蘆丁聯合順鉑抗肺癌作用的初探

買世雄，黃艷智，王振興，闞元順，劉珅賀，孫園園，孫 旭，張天行，王 躍*

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.長春市兒童醫院；3.吉林大學校醫院；4.吉林大學藥學院)

肺癌(lung cancer)是當前影響人類健康和生命的惡性腫瘤之一[1]。隨著生活環境的變化，肺癌的患病率正逐年增加[2]。已有研究發現，我國每年肺癌發病率正以 4.5%的速度上升[3]。目前，肺癌的治療手段主要是以手術治療，輔助化療、放療、免疫治療等[4]。而順鉑作為金屬鉑類絡合物，可抑制腫瘤細胞中的DNA復制過程[5]。但肺癌的化療機理仍有待進一步深入研究。蘆丁(Rutin)作為心腦血管類藥物，已應用多年[6]。近些年來，蘆丁在腫瘤的治療上也逐漸被報道。本文探討蘆丁聯合順鉑對肺癌作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器順鉑(湖北麥凱斯精化科技有限責任公司)；蘆丁(四川軒禾康生物科技有限公司)；DAPI(北京百奧萊博科技有限公司)；酶標儀(thermo)；流式細胞儀(常州必達科生物科技有限公司)。

1.2 細胞分組

在實驗分為未處理的A549細胞組；2 mg/L順鉑處理A549細胞組；蘆丁+順鉑組和順鉑+蘆丁組。

1.3 MTT檢測細胞活力

進行MTT分析用于研究順鉑+蘆丁在肺癌A549細胞中的細胞活力。A549細胞(3×103/孔)在96孔板中培養24 h。隨后，每孔加入10 μl MTT溶液(Beyotime Institute of Biotechnology)，細胞在 37℃下培養 4 h。在450 nm處測量光密度(OD) 值。細胞活性=實驗組OD值/空白對照組OD值。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期

A549細胞按每孔4×105個密度接種于60 mm細胞培養皿內，培養過夜后，用順鉑，順鉑+蘆丁和蘆丁+順鉑藥物處理細胞。胰酶消化收集細胞，并用1 mL PBS緩沖液清洗剩余細胞1次，全部加入15 ml管中。800 rpm離心5 min。用低速振蕩器震動邊加入5 ml預冷的70%乙醇，固定。次日1 000 rpm的轉速離心5 min，棄上清，加入5 μl RNaseA(10 mg/mL)37℃消化1 h，加入終濃度50 mg/mL碘化丙啶(propidium iodide PI)4℃避光染色過夜，在EPICS XL流式細胞儀上分析。

1.5 DAPI檢測細胞凋亡

(1)A549細胞每孔0.8×105；(2)移去完全培養基，用PBS清洗1次；(3)4%的多聚甲醛PBS在室溫固定20 min；(4)用PBS在室溫漂洗3次，每次10 min；(5)用含0.5%Triton-X-100的PBS在室溫通透化處理15 min；(6)在室溫用含10%NGS的PBS封閉1 h；(7)用含0.1% Tween-20的PBS在室溫漂洗3次，每次10 min；(8)去除二抗，加入DAPI染色液室溫作用15 min以上；(9)用含0.1% Tween-20的PBS在室溫漂洗3次，每次10 min；(10)在熒光顯微鏡下觀察，照相保存實驗結果。

2 結果

2.1 MTT檢測細胞活力

通過順鉑處理的A549細胞，其細胞活力明顯地低于未處理組(P<0.05)；先加順鉑再加蘆丁后細胞活力亦明顯低于未處理組(P<0.05)；而先加蘆丁再加順鉑后A549細胞活力略低于順鉑+蘆丁組(P<0.05)，見圖1。

圖1 MTT測定各組的細胞活力

2.2 流式細胞儀檢測細胞周期

順鉑處理的A549細胞，其周期在G2，S期發生明顯的變化；在G1期變化不明顯；而蘆丁+順鉑處理后，除G2，S期變化明顯外，A549細胞的G1期亦有所變化。這說明蘆丁+順鉑可能對A549細胞的G2、S和G1均具有一定的調控作用(圖2)。

圖2 蘆丁+順鉑對A549細胞周期的影響

2.3 DAPI檢測細胞凋亡

順鉑處理后的A549細胞數量較未處理組A549細胞數量明顯減少；而蘆丁+順鉑處理后，A549細胞數量較順鉑組少；這些結果說明蘆丁可增加順鉑的抗腫瘤作用。見圖3。

圖3 蘆丁+順鉑對A549細胞凋亡的影響

3 討論

目前臨床上肺癌的主要治療手段仍然是手術切除、放射療法和化學療法[4]。目前治療手段對提高肺癌治愈率和生存率十分有限。因此，深入研究肺癌的治療機理對于提升肺癌的治愈率和生存率具有重要的意義。順鉑作為金屬鉑類絡合物，對腫瘤細胞周期有非特異性，可破壞DNA，抑制腫瘤生長[5]。目前，研究發現順鉑可用于非小細胞肺癌膀胱癌、黑色素瘤、肉瘤、頭頸部腫瘤和惡性淋巴瘤的治療[5]。但在肺癌的治療機理方面仍有待進一步深入研究。

蘆丁作為心腦血管類藥物，主要用于腦溢血預防、血管性紫癜癥防治、再發性鼻出血、創傷性肺出血和產后流血等[6]。雖然蘆丁在肺癌的治療機理上有一定的研究，但仍有待深入探究。MTT是一種檢測細胞存活和生長的方法[7],本實驗研究結果顯示：通過順鉑處理的A549細胞，其細胞活力明顯地低于未處理組，這一結果說明，順鉑可有效地調控腫瘤細胞的活力。而先加順鉑再加蘆丁后細胞活力較單獨使用順鉑殺傷腫瘤細胞的效果好；而先加蘆丁再加順鉑殺傷腫瘤細胞能力更強，但該結果有待更深入的研究。細胞周期概念是構成細胞學說的重要組成部分[8],而大部分化療藥物(如順鉑和柴杉醇)對細胞周期產生特定的作用。細胞周期結果顯示：順鉑處理的A549細胞，其周期在G2，S期發生明顯的變化；這一結果說明順鉑可調控A549細胞的G2和S期，進而起到化療的作用。順鉑處理A549細胞后的G1期變化不明顯；而蘆丁+順鉑處理后，除G2，S期變化明顯外，G1期亦有所變化。這說明蘆丁可能增強了順鉑對A549細胞G1的調控作用。細胞凋亡受基因調控，它是細胞在主動參與其自身有序的生理性死亡過程[9]。細胞調亡實驗結果顯示：順鉑處理后的A549細胞數量明顯減少；而順鉑+蘆丁處理后，A549細胞數量較單獨使用順鉑處理后的A549細胞數量少；這一結果說明蘆丁可能增強了順鉑對A549細胞的殺傷作用。而先加蘆丁后加順鉑較先加順鉑再加蘆丁的殺傷效果更佳。但該結果仍有待進一步論證。