利用膜透析技術(shù)提高腺苷發(fā)酵產(chǎn)量

梅漫莉,孫鵬杰,徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457) 2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津,300457) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室,天津,300457)

腺苷,化學(xué)名為9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤[1],指由腺嘌呤的N-9與D-核糖的C-1通過β糖苷鍵連接而成的化合物,是用于合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、腺嘌呤、腺苷酸(adenosine monophosphate,AMP)、阿糖腺苷的重要中間體。腺苷可直接進(jìn)入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸,參與心肌能量代謝,同時(shí)還參與擴(kuò)張冠狀血管,增加冠脈血流量[2-4]。此外,腺苷還是一種抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)物,在神經(jīng)傳遞中起重要作用[5-6]。因此,腺苷在醫(yī)學(xué)方面有著重要的作用。

腺苷的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、RNA水解法和發(fā)酵法[7-8]。化學(xué)合成法合成腺苷存在著成本偏高、反應(yīng)繁瑣、收率低等一系列問題。RNA水解法同時(shí)會(huì)得到4種核苷物質(zhì)[9],給后續(xù)的分離帶來困難。發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷成本較低、原料易得,產(chǎn)腺苷效率較高,因此在腺苷生產(chǎn)中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。但在腺苷發(fā)酵過程中,也存在著很多問題,比如腺苷發(fā)酵需要非常豐富的營養(yǎng),使得腺苷發(fā)酵成本很高,發(fā)酵到了中后期菌體開始停止生長(zhǎng),耗糖速率變慢,產(chǎn)苷速率也變慢,使得腺苷發(fā)酵過程中有效的產(chǎn)苷周期很短,腺苷產(chǎn)量變低,糖苷轉(zhuǎn)化率變低。為了進(jìn)一步提高腺苷產(chǎn)量,延長(zhǎng)產(chǎn)苷周期,提高糖苷轉(zhuǎn)化率,本文開展膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的研究。利用5 L發(fā)酵罐,以BacillussubtilisXGL(8-AGr+ His-+xan-+SGr)為出發(fā)菌株,將發(fā)酵罐與陶瓷膜分離裝置相偶聯(lián),發(fā)酵一定時(shí)間后,發(fā)酵液經(jīng)過陶瓷膜過濾后把濃縮菌體回收至發(fā)酵罐中,將透析濾液排出,再在發(fā)酵罐中補(bǔ)加新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行腺苷發(fā)酵[10-11]。通過膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵法,降低發(fā)酵液中的產(chǎn)物濃度,從而有效解除菌體的反饋抑制作用和副產(chǎn)物的毒害作用[12-14],補(bǔ)加的新鮮培養(yǎng)基可以為菌體的繼續(xù)生長(zhǎng)和產(chǎn)苷提供營養(yǎng)物質(zhì),從而增加菌體量,延長(zhǎng)產(chǎn)苷周期,提高腺苷產(chǎn)量和糖苷轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

BacillussubtilisXGL(8-AGr+ His-+xan-+SGr),天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌株。

1.1.2 試劑

MnSO4· H2O,天津市化學(xué)試劑六廠；MgSO4·7H2O,天津市耀華化工廠；FeSO4·7H2O、葡萄糖,天津化學(xué)試劑三廠；KH2PO4·3H2O,天津塘沽化學(xué)試劑廠；黃嘌呤、組氨酸,北京索萊寶科技有限公司。以上試劑純度均為99.9%。玉米漿(40%),河北梅花味精集團(tuán)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10,葡萄糖2,NaCl 2.5,蛋白胨10,酵母粉5,黃嘌呤0.05,組氨酸0.05,瓊脂條30。調(diào)pH至7.0～7.2,121 ℃,20 min滅菌。滅菌后分別制成試管斜面培養(yǎng)基和茄形瓶培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25,豆餅水解液20,酵母粉5,MgSO4·7 H2O 0.4,維生素B10.001,維生素H 0.001,玉米干粉 25(121 ℃、20 min單獨(dú)滅菌),KH2PO41.5,蛋白胨8,黃嘌呤0.1,組氨酸0.05。調(diào)pH至6.4～6.7,115 ℃,15 min滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100,豆餅水解液50,酵母粉25,MgSO4·7H2O 5,維生素B10.002,維生素H 0.002,玉米干粉25(121 ℃、20 min 單獨(dú)滅菌),味精12,K2HPO44.5,葡萄糖酸鈉1.5,黃嘌呤0.1,組氨酸0.05,CaCl22,FeSO4·7H2O 0.006,MnSO40.006。調(diào)pH至7.0～7.2,115 ℃,15 min滅菌。

透析培養(yǎng)基(g/L)：豆餅水解液50,酵母粉25,MgSO4·7H2O 5,維生素B10.002,維生素H 0.002,味精12,K2HPO44.5,葡萄糖酸鈉1.5,黃嘌呤0.1,組氨酸0.05,CaCl22,FeSO4·7H2O 0.006,MnSO40.006。調(diào)pH至7.0～7.2,115 ℃,15 min滅菌。

1.2 儀器與設(shè)備

5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所；Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent C18(5 μm,250 mm × 416 mm),Agilent Technologies；752紫外分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理方法

菌體量測(cè)定：每隔4 h取適量發(fā)酵液,滅菌生理鹽水適當(dāng)倍數(shù)稀釋,通過分光光度計(jì)測(cè)定720 nm吸光度[11]。

發(fā)酵液中糖含量的測(cè)定：使用生物傳感器進(jìn)行檢測(cè),將取出的樣品進(jìn)行離心,離心后取上清液稀釋100倍進(jìn)行測(cè)定。

葡萄糖補(bǔ)加量測(cè)定：用電子稱記錄下每隔一定時(shí)間的80%的葡萄糖液補(bǔ)加量。

pH、溫度、溶氧的測(cè)定:通過發(fā)酵罐上的自動(dòng)控制器自動(dòng)控制發(fā)酵液的pH、溫度和溶氧,另外再用pH試紙進(jìn)行pH測(cè)定與調(diào)試。

腺苷產(chǎn)量測(cè)定:高效液相色譜法定量檢測(cè)發(fā)酵液中的腺苷濃度[15-17]。

發(fā)酵液預(yù)處理：取適量發(fā)酵液,用濃度為1 mol/L NaOH溶液稀釋10倍,煮沸,13 000 r/min離心5～10 min,取上清液用去離子水稀釋100倍過膜[1]。

液相色譜分離條件：柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm,流動(dòng)相總流量0.8 mL/min,色譜柱為 Kromasil C18柱(250 mm×416 mm,5 μm),流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=(1∶9)[1]。

乙偶姻產(chǎn)量測(cè)定：見參考文獻(xiàn)[18]。

1.3.2 培養(yǎng)方法

菌種活化與擴(kuò)培：取1個(gè)斜面培養(yǎng)基,在無菌間中,將-80 ℃保菌管中保藏的菌種用接種環(huán)挑2～3環(huán)于斜面培養(yǎng)基中,在斜面培養(yǎng)基中涂勻,放至32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h。10～12 h后將斜面上的菌體挑取2～3環(huán)至茄形瓶培養(yǎng)基上進(jìn)行再次活化與擴(kuò)培,再次放至32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h待用。

5 L發(fā)酵液種子培養(yǎng)方法：將裝有發(fā)酵液的5 L發(fā)酵罐滅菌后,連接溶氧電極、pH電極、溫度電極,通上無菌空氣,調(diào)好發(fā)酵液的pH至7.0～7.2。用無菌水將茄形瓶培養(yǎng)基上的菌體沖洗下來,然后接種至5 L發(fā)酵罐中,定容至3 L。再次調(diào)好pH,調(diào)節(jié)發(fā)酵控制器,溫度設(shè)置為32 ℃,pH設(shè)置為7.0,后續(xù)主要通過自動(dòng)流加氨水調(diào)節(jié)pH；初始轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r/min,初始通風(fēng)量為 2 L/min,用泡敵消泡,培養(yǎng) 10～13 h 左右,菌體量生長(zhǎng)至 OD600 nm為15時(shí)按15%的接種量接種發(fā)酵。

對(duì)照發(fā)酵：發(fā)酵過程中通過自動(dòng)流加氨水調(diào)節(jié)pH,pH前期控制在7.0左右,后期控制在6.4左右。發(fā)酵罐自動(dòng)控制溫度、轉(zhuǎn)速,過程中需要調(diào)節(jié)通風(fēng)量將溶氧前期控制在30%～40%,后期控制在10%～20%。用生物傳感分析儀測(cè)定發(fā)酵液中的糖濃度,后期糖濃度控制在0～10 g/L。后續(xù)如果糖濃度偏低通過自動(dòng)流加80%的葡萄糖溶液進(jìn)行過程補(bǔ)糖。

膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵：如圖1所示,將發(fā)酵罐與陶瓷膜分離裝置相偶聯(lián),發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜過濾后截留菌體,把菌體重新流回罐中,把發(fā)酵液過濾出來,再在發(fā)酵罐中補(bǔ)加新配制的經(jīng)過滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基[10-11],定容至3 L,新鮮培養(yǎng)基的量不低于發(fā)酵液的80%(體積分?jǐn)?shù)),繼續(xù)進(jìn)行腺苷發(fā)酵。膜偶聯(lián)透析時(shí)間和補(bǔ)加培養(yǎng)基的時(shí)間不計(jì)入發(fā)酵時(shí)間。

1-發(fā)酵罐；2-離心泵；3-陶瓷膜；4-蒸氣發(fā)生器圖1 膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵裝置Fig.1 Membrane coupling batch dialysis fermentation device

酶活力測(cè)定：

(1)菌體收集:取培養(yǎng)至一定時(shí)期的枯草芽胞桿菌菌液10 mL,離心收集菌體,用pH 6.4(發(fā)酵過程中控制的實(shí)際pH值)的PBS緩沖液洗2次,最后重懸于相同的緩沖液中[9]。

(2)酶蛋白提取:將收獲的細(xì)胞重懸于1 mL的pH 7.5、含 30%甘油的 50 mmol/L Tris-HCl 中[18]。采用高通量破碎法破碎細(xì)胞,6 200 r/min 工作20 s,液氮放置30 s,重復(fù)10次。于 4 ℃、10 000 r/min 離心15 min,上清液即為粗酶液。測(cè)總蛋白后置于冰上待測(cè)各酶活性。此外,可將酶液于-20 ℃保存[19]。

(3)腺苷琥珀酸合成酶活力的測(cè)定：向含有菌體的溶液中加入肌苷酸(inosine monophosphate,IMP)和天冬氨酸,終濃度分別為10 mmol/L和20 mmol/L。34 ℃,200 r/min培養(yǎng)3 h,利用HPLC法測(cè)定其中IMP含量的變化。計(jì)算單位時(shí)間內(nèi),菌體OD600變化為1時(shí)的IMP的轉(zhuǎn)化速度[9]。胞內(nèi)IMP含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]的方法。

(4)磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP)轉(zhuǎn)移酶活力測(cè)定:參考文獻(xiàn)[1]的方法。

1.4 計(jì)算公式

糖苷轉(zhuǎn)化率按公式(1)計(jì)算:

(1)

所有數(shù)據(jù)取3次數(shù)據(jù)的平均值,進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜偶聯(lián)透析發(fā)酵對(duì)腺苷生產(chǎn)的影響

2.1.1 膜偶聯(lián)透析發(fā)酵對(duì)菌體量、產(chǎn)苷量和發(fā)酵液中溶氧量的影響

如圖2所示,在44 h進(jìn)行膜偶聯(lián)透析發(fā)酵,發(fā)酵至72 h菌體OD600 nm達(dá)到83.5,與正常發(fā)酵工藝相比菌體量提高了14.4%。發(fā)酵液內(nèi)平均產(chǎn)苷39.32 g/L(腺苷平均產(chǎn)量=透析前后腺苷總產(chǎn)量/發(fā)酵液總體積。透析時(shí)為截留菌體,將0.6 L左右的發(fā)酵液流回發(fā)酵罐,因此發(fā)酵液總體積減少約0.6 L,下同),比正常發(fā)酵72 h后腺苷產(chǎn)量37.2 g/L,提高了5.7%。

圖2 正常發(fā)酵與透析發(fā)酵OD600 nm、腺苷產(chǎn)量和乙偶姻產(chǎn)量對(duì)比Fig.2 Comparison of OD600 nm,adenosine production and acetoin production between normal and dialysis fermentation

膜偶聯(lián)透析發(fā)酵與正常發(fā)酵工藝相比,加入了大量新鮮的培養(yǎng)基,提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)。又通過膜偶聯(lián)透析分離出發(fā)酵液內(nèi)高質(zhì)量濃度的主產(chǎn)物和副產(chǎn)物,有效解除了菌體的反饋抑制作用和副產(chǎn)物的毒害作用,使得菌體能迅速恢復(fù)活力,繼續(xù)高速率產(chǎn)苷。如圖2所示,正常發(fā)酵72 h后副產(chǎn)物乙偶姻產(chǎn)量為41.5 g/L,透析發(fā)酵后其產(chǎn)量為31.8 g/L,明顯下降。副產(chǎn)物乙偶姻通過糖酵解途徑生成丙酮酸,再經(jīng)催化作用生成,而腺苷的合成是通過戊糖磷酸途徑合成,因此副產(chǎn)物的合成速度變慢會(huì)使得代謝流更多地流向腺苷的合成途徑中,使得腺苷的合成量增多。正常發(fā)酵到后期由于腺苷和一些副產(chǎn)物產(chǎn)量的增多,發(fā)酵液內(nèi)形成晶體,阻礙發(fā)酵罐內(nèi)的供氧,使得發(fā)酵罐內(nèi)溶氧降低,如圖3所示,在44～48 h發(fā)酵液中溶氧降低,由圖2可知44～48 h后菌體和產(chǎn)苷變緩。

圖3 正常發(fā)酵與透析發(fā)酵通風(fēng)量、溶氧量對(duì)比Fig.3 Comparison of ventilation and dissolved oxygen between normal and dialysis fermentation

進(jìn)行透析之后去除了大量的結(jié)晶,使發(fā)酵液內(nèi)供氧充足,菌體恢復(fù)活力,同時(shí)產(chǎn)苷速率增加。所以,膜偶聯(lián)透析發(fā)酵可以使菌體保持正增長(zhǎng),產(chǎn)苷速率保持一個(gè)較高水平。

2.1.2 膜偶聯(lián)透析發(fā)酵對(duì)發(fā)酵過程中葡萄糖消耗速率的影響

如圖4所示,正常發(fā)酵工藝中隨著菌體的生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)苷速率的加快,葡萄糖的消耗速率也相應(yīng)提高,在24～36 h處于較高水平,后期由于菌體量不再增長(zhǎng)葡萄糖消耗速率變緩。透析后由于菌體恢復(fù)活力,葡萄糖消耗速率也有所增長(zhǎng)。可見,膜偶聯(lián)透析能夠使菌體保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的活力,處于一個(gè)持續(xù)生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)腺苷的狀態(tài),因此葡萄糖消耗速率也處于較高水平。膜偶聯(lián)透析發(fā)酵后,采取葡萄糖流加的方式,使發(fā)酵液內(nèi)殘?zhí)鞘冀K控制在0～10 g/L。

圖4 正常發(fā)酵與透析發(fā)酵葡萄糖消耗速率和殘?zhí)橇繉?duì)比Fig.4 Comparison of glucose consumption rate and residual sugar content between normal and dialysis fermentation

2.2 不同時(shí)期進(jìn)行膜偶聯(lián)透析對(duì)腺苷生產(chǎn)的影響

2.2.1 不同時(shí)期進(jìn)行膜偶聯(lián)透析對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)苷的影響

為探究最適的膜偶聯(lián)透析發(fā)酵時(shí)間,分4個(gè)時(shí)期(32、36、40、44 h)進(jìn)行膜偶聯(lián)透析發(fā)酵并進(jìn)行對(duì)比。之所以選擇這幾個(gè)時(shí)期進(jìn)行透析是因?yàn)槿绻肝霭l(fā)酵過早,菌體量較少,產(chǎn)苷有限;如果透析較晚,菌體活力較差,透析發(fā)酵效果不佳。

由圖5-a可知32和36 h進(jìn)行膜偶聯(lián)透析發(fā)酵菌體OD600 nm分別達(dá)到了93.5和92.7,相比之下菌體量最多。這兩個(gè)階段進(jìn)行膜偶聯(lián)透析菌體量大是因?yàn)樵谶M(jìn)行透析時(shí)絕大部分菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體活力較強(qiáng),透析之后菌體仍處在對(duì)數(shù)期,生長(zhǎng)速度較快。而在40和44 h進(jìn)行膜偶聯(lián)透析發(fā)酵時(shí)菌體處在穩(wěn)定期,此時(shí)菌體生長(zhǎng)相對(duì)較緩慢,發(fā)酵72 h菌體OD600 nm分別為87.2和83.5。

如圖5-b所示,在32、36、40、44 h進(jìn)行膜偶聯(lián)透析時(shí)發(fā)酵液中平均產(chǎn)苷量分別為41.14、42.4、41.06、39.32 g/L。由此可見,在36 h進(jìn)行透析發(fā)酵的總產(chǎn)苷量最大。

a-菌體生長(zhǎng);b-腺苷產(chǎn)量圖5 不同時(shí)間段透析發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)和腺苷產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of dialysis fermentation in different periods on the growth and adenosine production of bacteria注:透析發(fā)酵1、2、3、4分別代表在發(fā)酵的第32、36、40、44 h開始進(jìn)行膜偶聯(lián)透析發(fā)酵(下同)

2.2.2 不同時(shí)期進(jìn)行膜偶聯(lián)透析對(duì)葡萄糖消耗速率、糖苷轉(zhuǎn)化率和副產(chǎn)物的影響

由圖6可知,透析發(fā)酵后葡萄糖消耗速率變大,由于透析后采用葡萄糖流加的方式,所以殘?zhí)橇炕颈３址€(wěn)定。由圖7和表1可知,透析發(fā)酵2的糖苷轉(zhuǎn)化率最高,達(dá)到24.12%。從圖8可以看出進(jìn)行透析發(fā)酵后乙偶姻的產(chǎn)量下降,其中透析發(fā)酵2中乙偶姻的產(chǎn)量最低。

圖6 不同時(shí)間段透析發(fā)酵對(duì)葡萄糖消耗速率和殘?zhí)橇康挠绊慒ig.6 Effect of dialysis fermentation in different periods on the rate of glucose consumption and the amount of remaining glucose

可見在36 h進(jìn)行膜偶聯(lián)透析發(fā)酵最好,發(fā)酵36 h菌體OD達(dá)到一定的量,且菌體活力較強(qiáng),產(chǎn)苷速率較快。若透析發(fā)酵較早,菌體還處在快速生長(zhǎng)期,葡萄糖的分解更多地用于菌體的生長(zhǎng)和繁殖,用于合成代謝產(chǎn)物的則減少。

圖7 不同時(shí)間段透析發(fā)酵的糖苷轉(zhuǎn)化率Fig.7 Conversion rate of glucose to adenosine in different periods of dialysis fermentation

表1 不同時(shí)期進(jìn)行透析發(fā)酵的參數(shù)對(duì)比Table 1 Comparison of the data of dialysis and fermentation in different periods

圖8 不同時(shí)期進(jìn)行透析發(fā)酵腺苷與乙偶姻產(chǎn)量對(duì)比Fig.8 Production of adenosine and acetoin in dialysis fermentation at different periods

如果在后期進(jìn)行透析發(fā)酵,菌體雖然耗糖降低,但同時(shí)產(chǎn)苷速率也相對(duì)變緩,因此總產(chǎn)苷量相對(duì)較少,糖苷轉(zhuǎn)化率較低。

2.3 不同比例的透析培養(yǎng)基對(duì)腺苷發(fā)酵的影響

2.3.1 不同比例的透析培養(yǎng)基對(duì)腺苷發(fā)酵中菌體量和腺苷產(chǎn)量的影響

為了節(jié)約原料,減少發(fā)酵成本,在最適的膜透析時(shí)間下,設(shè)置了不同比例的新鮮培養(yǎng)基用于膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵的補(bǔ)加培養(yǎng)基,新鮮培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分為3 L培養(yǎng)基的50%、60%、70%、80%(分別為透析發(fā)酵a、b、c、d)。由圖9-a可知在不同比例的透析培養(yǎng)基中70%和80%的透析培養(yǎng)基發(fā)酵到72 h時(shí)菌體量最高,分別為90.5和92.6。如圖9-b所示,進(jìn)行膜透析前發(fā)酵液中腺苷產(chǎn)量幾乎一樣,在36 h進(jìn)行透析后,透析發(fā)酵d產(chǎn)苷速率最快,發(fā)酵到72 h時(shí)產(chǎn)苷43.8 g/L,其次是透析發(fā)酵c,在發(fā)酵72 h時(shí)產(chǎn)苷42.1 g/L。透析發(fā)酵a和b最終產(chǎn)苷37.8、39.8 g/L。因此在70%、80%的新鮮培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)苷狀況良好,兩個(gè)比例的培養(yǎng)基進(jìn)行透析后菌體量和產(chǎn)苷量幾乎相同,為節(jié)約原料,降低發(fā)酵成本,應(yīng)選擇70%的透析培養(yǎng)基進(jìn)行透析發(fā)酵。

圖9 不同比例的透析培養(yǎng)基對(duì)菌體量和腺苷產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of different ratios of dialysis medium on growth and adenosine production of bacteria注:透析發(fā)酵a、b、c、d分別為補(bǔ)加50%、60%、70%、80%的3 L培養(yǎng)基(下同)

2.3.2 不同比例的透析培養(yǎng)基對(duì)腺苷發(fā)酵中糖苷轉(zhuǎn)化率的影響

由圖10看出,發(fā)酵c和d中糖苷轉(zhuǎn)化率最高,兩種方案的糖苷轉(zhuǎn)化率非常接近。更進(jìn)一步證明在透析培養(yǎng)中應(yīng)選擇70%的透析培養(yǎng)基作為新鮮的透析發(fā)酵培養(yǎng)基,這樣可以盡可能地節(jié)約資源,減少發(fā)酵成本。

圖10 不同比例的透析培養(yǎng)基對(duì)糖苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.10 The effect of different ratios of dialysis media on the rate of glucose conversion to adenosine

2.4 透析發(fā)酵中的酶活力

在枯草芽胞桿菌中參與嘌呤合成途徑中有幾個(gè)關(guān)鍵酶決定著產(chǎn)物生成速率的大小,其中非常重要的兩個(gè)酶分別是PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶和腺苷琥珀酸合成酶。其中PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶由purF基因編碼,催化嘌呤合成途徑中的第1個(gè)反應(yīng),即PRPP與谷氨酰胺反應(yīng),轉(zhuǎn)化為5-磷酸核糖胺(5-phosphoribosylamine,PRA),是嘌呤全合成途徑中的關(guān)鍵酶,該酶活性的高低直接影響進(jìn)入嘌呤合成途徑的通量[20-22]。PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的活性受到AMP和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)的特異性反饋抑制,且當(dāng)腺嘌呤過量時(shí),PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的合成被阻遏,當(dāng)腺嘌呤限量時(shí),可解除對(duì)PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的阻遏作用[9]。有研究表明提高PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的酶活力可以有效提高嘌呤物質(zhì)的產(chǎn)量[1]。

腺苷琥珀酸合成酶(adenylosuccinate synthase,Adss)該酶由purA基因編碼,催化IMP和天冬氨酸通過還原作用結(jié)合為腺苷酸琥珀酸,此反應(yīng)是AMP合成分支的第1個(gè)反應(yīng),是嘌呤合成途徑中的限速步驟[23-26]。該酶僅特異性受AMP系物質(zhì)的反饋?zhàn)瓒鬧9]。

根據(jù)圖9可知,進(jìn)行膜透析后40～60 h是菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)苷的高峰期,為探究該段時(shí)間內(nèi)菌體中PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶和Adss酶活力是否有所提升,選擇在該時(shí)間段中任一時(shí)期進(jìn)行菌體酶活力測(cè)定。發(fā)酵52 h分別對(duì)正常發(fā)酵工藝和透析發(fā)酵工藝進(jìn)行取樣,測(cè)發(fā)

酵液中PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶和Adss酶的活力,如圖11所示,透析發(fā)酵后PRPP酶的活力為14.8 U/g,是正常透析發(fā)酵的1.9倍,Adss酶活力是正常透析發(fā)酵的1.8倍。兩種酶活力均有所提高,因此經(jīng)過透析發(fā)酵能有效地提高嘌呤合成途徑中關(guān)鍵酶的活力,從而增加菌體活力,提高腺苷產(chǎn)量和糖苷轉(zhuǎn)化率,延長(zhǎng)產(chǎn)苷周期。

圖11 PRPP酶和Adss酶活力對(duì)比Fig.11 Comparison of PRPP enzyme and Adss enzyme activity

2.5 膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵對(duì)腺苷發(fā)酵的影響

為進(jìn)一步提高腺苷生產(chǎn)速率,如圖12和表2所示,在發(fā)酵至60 h時(shí)進(jìn)行了第2次膜偶聯(lián)透析發(fā)酵,與之前的正常發(fā)酵工藝和36 h進(jìn)行膜偶聯(lián)透析發(fā)酵工藝相比,膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵將發(fā)酵周期延長(zhǎng)至96 h,OD600 nm達(dá)到了94.6,相比于進(jìn)行一次透析發(fā)酵有所提高,腺苷產(chǎn)量由一次發(fā)酵72 h總產(chǎn)苷295.4 g,平均產(chǎn)苷42.4 g/L,提升到448.3 g,平均產(chǎn)苷44.2 g/L,糖苷轉(zhuǎn)化率由24.1%提升到25.1%。

a-菌體量；b-腺苷產(chǎn)量；c-耗糖量；d-糖苷轉(zhuǎn)化率圖12 間歇透析發(fā)酵對(duì)腺苷發(fā)酵過程中各參數(shù)的影響Fig.12 Effect of intermittent dialysis fermentation on the parameters of adenosine fermentation

表2 膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵參數(shù)Table 2 Membrane coupling batch dialysis fermentation parameters

葡萄糖消耗速率在二次透析后也有所增加。因此通過二次透析可以再次提高腺苷產(chǎn)量,進(jìn)一步提高糖苷轉(zhuǎn)化率,使之達(dá)到一個(gè)較理想的菌體代謝水平和產(chǎn)苷水平。

3 結(jié)論

為提高發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的產(chǎn)量,延長(zhǎng)產(chǎn)苷時(shí)間,提高糖苷轉(zhuǎn)化率,本文以枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象,分析了透析發(fā)酵對(duì)腺苷生產(chǎn)的影響,并確定了最優(yōu)方案。分別在發(fā)酵36、60 h對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行2次膜偶聯(lián)透析,使發(fā)酵周期延長(zhǎng)至96 h,菌體OD600 nm提高到94.6,單批次產(chǎn)苷448.3 g,平均產(chǎn)苷44.2 g/L。糖苷轉(zhuǎn)化率提高到25.1%。相比于正常發(fā)酵工藝產(chǎn)苷周期延長(zhǎng)36～40 h,菌體量提高了29.6%,產(chǎn)量增加298.4 g,產(chǎn)苷強(qiáng)度增加7 g/L,副產(chǎn)物乙偶姻產(chǎn)量降低。在發(fā)酵52 h時(shí)檢測(cè)透析發(fā)酵中PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶和腺苷琥珀酸合成酶活力,相比于正常發(fā)酵工藝均有所提高。由此可見通過膜偶聯(lián)透析發(fā)酵解除了產(chǎn)物的反饋抑制作用,從而提高了嘌呤合成途徑中相關(guān)酶的活性,進(jìn)而使得菌體活力比較旺盛,降低了副產(chǎn)物乙偶姻的量,使得更多的碳源流向腺苷的合成,膜透析分離出發(fā)酵液中的結(jié)晶,使得發(fā)酵液中溶氧充足,使腺苷合成速率變大,糖苷轉(zhuǎn)化率提高。目前透析發(fā)酵還存在一定的問題尚待解決,例如,每次透析時(shí)發(fā)酵液的體積控制精度差,透析過程中會(huì)造成部分菌體死亡等問題。如果這些問題能夠得到很好的解決對(duì)于透析發(fā)酵提高產(chǎn)量將會(huì)有很大的幫助。