利用膜透析技術提高腺苷發酵產量

梅漫莉,孫鵬杰,徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457) 2(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室,天津,300457) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室,天津,300457)

腺苷,化學名為9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤[1],指由腺嘌呤的N-9與D-核糖的C-1通過β糖苷鍵連接而成的化合物,是用于合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、腺嘌呤、腺苷酸(adenosine monophosphate,AMP)、阿糖腺苷的重要中間體。腺苷可直接進入心肌經磷酸化生成腺苷酸,參與心肌能量代謝,同時還參與擴張冠狀血管,增加冠脈血流量[2-4]。此外,腺苷還是一種抑制性神經傳導物,在神經傳遞中起重要作用[5-6]。因此,腺苷在醫學方面有著重要的作用。

腺苷的生產方法主要有化學合成法、RNA水解法和發酵法[7-8]。化學合成法合成腺苷存在著成本偏高、反應繁瑣、收率低等一系列問題。RNA水解法同時會得到4種核苷物質[9],給后續的分離帶來困難。發酵法生產腺苷成本較低、原料易得,產腺苷效率較高,因此在腺苷生產中占據絕對優勢。但在腺苷發酵過程中,也存在著很多問題,比如腺苷發酵需要非常豐富的營養,使得腺苷發酵成本很高,發酵到了中后期菌體開始停止生長,耗糖速率變慢,產苷速率也變慢,使得腺苷發酵過程中有效的產苷周期很短,腺苷產量變低,糖苷轉化率變低。為了進一步提高腺苷產量,延長產苷周期,提高糖苷轉化率,本文開展膜偶聯間歇透析發酵法生產腺苷的研究。利用5 L發酵罐,以BacillussubtilisXGL(8-AGr+ His-+xan-+SGr)為出發菌株,將發酵罐與陶瓷膜分離裝置相偶聯,發酵一定時間后,發酵液經過陶瓷膜過濾后把濃縮菌體回收至發酵罐中,將透析濾液排出,再在發酵罐中補加新鮮的發酵培養基繼續進行腺苷發酵[10-11]。通過膜偶聯間歇透析發酵法,降低發酵液中的產物濃度,從而有效解除菌體的反饋抑制作用和副產物的毒害作用[12-14],補加的新鮮培養基可以為菌體的繼續生長和產苷提供營養物質,從而增加菌體量,延長產苷周期,提高腺苷產量和糖苷轉化率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

BacillussubtilisXGL(8-AGr+ His-+xan-+SGr),天津科技大學代謝工程研究室保藏菌株。

1.1.2 試劑

MnSO4· H2O,天津市化學試劑六廠；MgSO4·7H2O,天津市耀華化工廠；FeSO4·7H2O、葡萄糖,天津化學試劑三廠；KH2PO4·3H2O,天津塘沽化學試劑廠；黃嘌呤、組氨酸,北京索萊寶科技有限公司。以上試劑純度均為99.9%。玉米漿(40%),河北梅花味精集團有限公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基(g/L)：牛肉膏10,葡萄糖2,NaCl 2.5,蛋白胨10,酵母粉5,黃嘌呤0.05,組氨酸0.05,瓊脂條30。調pH至7.0～7.2,121 ℃,20 min滅菌。滅菌后分別制成試管斜面培養基和茄形瓶培養基。

種子培養基(g/L)：葡萄糖25,豆餅水解液20,酵母粉5,MgSO4·7 H2O 0.4,維生素B10.001,維生素H 0.001,玉米干粉 25(121 ℃、20 min單獨滅菌),KH2PO41.5,蛋白胨8,黃嘌呤0.1,組氨酸0.05。調pH至6.4～6.7,115 ℃,15 min滅菌。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖100,豆餅水解液50,酵母粉25,MgSO4·7H2O 5,維生素B10.002,維生素H 0.002,玉米干粉25(121 ℃、20 min 單獨滅菌),味精12,K2HPO44.5,葡萄糖酸鈉1.5,黃嘌呤0.1,組氨酸0.05,CaCl22,FeSO4·7H2O 0.006,MnSO40.006。調pH至7.0～7.2,115 ℃,15 min滅菌。

透析培養基(g/L)：豆餅水解液50,酵母粉25,MgSO4·7H2O 5,維生素B10.002,維生素H 0.002,味精12,K2HPO44.5,葡萄糖酸鈉1.5,黃嘌呤0.1,組氨酸0.05,CaCl22,FeSO4·7H2O 0.006,MnSO40.006。調pH至7.0～7.2,115 ℃,15 min滅菌。

1.2 儀器與設備

5 L自動控制發酵罐,上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所；Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent C18(5 μm,250 mm × 416 mm),Agilent Technologies；752紫外分光光度計,上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理方法

菌體量測定：每隔4 h取適量發酵液,滅菌生理鹽水適當倍數稀釋,通過分光光度計測定720 nm吸光度[11]。

發酵液中糖含量的測定：使用生物傳感器進行檢測,將取出的樣品進行離心,離心后取上清液稀釋100倍進行測定。

葡萄糖補加量測定：用電子稱記錄下每隔一定時間的80%的葡萄糖液補加量。

pH、溫度、溶氧的測定:通過發酵罐上的自動控制器自動控制發酵液的pH、溫度和溶氧,另外再用pH試紙進行pH測定與調試。

腺苷產量測定:高效液相色譜法定量檢測發酵液中的腺苷濃度[15-17]。

發酵液預處理：取適量發酵液,用濃度為1 mol/L NaOH溶液稀釋10倍,煮沸,13 000 r/min離心5～10 min,取上清液用去離子水稀釋100倍過膜[1]。

液相色譜分離條件：柱溫30 ℃；檢測波長為259 nm,流動相總流量0.8 mL/min,色譜柱為 Kromasil C18柱(250 mm×416 mm,5 μm),流動相為V(乙腈)∶V(水)=(1∶9)[1]。

乙偶姻產量測定：見參考文獻[18]。

1.3.2 培養方法

菌種活化與擴培：取1個斜面培養基,在無菌間中,將-80 ℃保菌管中保藏的菌種用接種環挑2～3環于斜面培養基中,在斜面培養基中涂勻,放至32 ℃的恒溫培養箱中培養10～12 h。10～12 h后將斜面上的菌體挑取2～3環至茄形瓶培養基上進行再次活化與擴培,再次放至32 ℃恒溫培養箱中培養10～12 h待用。

5 L發酵液種子培養方法：將裝有發酵液的5 L發酵罐滅菌后,連接溶氧電極、pH電極、溫度電極,通上無菌空氣,調好發酵液的pH至7.0～7.2。用無菌水將茄形瓶培養基上的菌體沖洗下來,然后接種至5 L發酵罐中,定容至3 L。再次調好pH,調節發酵控制器,溫度設置為32 ℃,pH設置為7.0,后續主要通過自動流加氨水調節pH；初始轉速設置為200 r/min,初始通風量為 2 L/min,用泡敵消泡,培養 10～13 h 左右,菌體量生長至 OD600 nm為15時按15%的接種量接種發酵。

對照發酵：發酵過程中通過自動流加氨水調節pH,pH前期控制在7.0左右,后期控制在6.4左右。發酵罐自動控制溫度、轉速,過程中需要調節通風量將溶氧前期控制在30%～40%,后期控制在10%～20%。用生物傳感分析儀測定發酵液中的糖濃度,后期糖濃度控制在0～10 g/L。后續如果糖濃度偏低通過自動流加80%的葡萄糖溶液進行過程補糖。

膜偶聯間歇透析發酵：如圖1所示,將發酵罐與陶瓷膜分離裝置相偶聯,發酵液經陶瓷膜過濾后截留菌體,把菌體重新流回罐中,把發酵液過濾出來,再在發酵罐中補加新配制的經過滅菌的發酵培養基[10-11],定容至3 L,新鮮培養基的量不低于發酵液的80%(體積分數),繼續進行腺苷發酵。膜偶聯透析時間和補加培養基的時間不計入發酵時間。

1-發酵罐；2-離心泵；3-陶瓷膜；4-蒸氣發生器圖1 膜偶聯間歇透析發酵裝置Fig.1 Membrane coupling batch dialysis fermentation device

酶活力測定：

(1)菌體收集:取培養至一定時期的枯草芽胞桿菌菌液10 mL,離心收集菌體,用pH 6.4(發酵過程中控制的實際pH值)的PBS緩沖液洗2次,最后重懸于相同的緩沖液中[9]。

(2)酶蛋白提取:將收獲的細胞重懸于1 mL的pH 7.5、含 30%甘油的 50 mmol/L Tris-HCl 中[18]。采用高通量破碎法破碎細胞,6 200 r/min 工作20 s,液氮放置30 s,重復10次。于 4 ℃、10 000 r/min 離心15 min,上清液即為粗酶液。測總蛋白后置于冰上待測各酶活性。此外,可將酶液于-20 ℃保存[19]。

(3)腺苷琥珀酸合成酶活力的測定：向含有菌體的溶液中加入肌苷酸(inosine monophosphate,IMP)和天冬氨酸,終濃度分別為10 mmol/L和20 mmol/L。34 ℃,200 r/min培養3 h,利用HPLC法測定其中IMP含量的變化。計算單位時間內,菌體OD600變化為1時的IMP的轉化速度[9]。胞內IMP含量的測定參考文獻[9]的方法。

(4)磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP)轉移酶活力測定:參考文獻[1]的方法。

1.4 計算公式

糖苷轉化率按公式(1)計算:

(1)

所有數據取3次數據的平均值,進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 膜偶聯透析發酵對腺苷生產的影響

2.1.1 膜偶聯透析發酵對菌體量、產苷量和發酵液中溶氧量的影響

如圖2所示,在44 h進行膜偶聯透析發酵,發酵至72 h菌體OD600 nm達到83.5,與正常發酵工藝相比菌體量提高了14.4%。發酵液內平均產苷39.32 g/L(腺苷平均產量=透析前后腺苷總產量/發酵液總體積。透析時為截留菌體,將0.6 L左右的發酵液流回發酵罐,因此發酵液總體積減少約0.6 L,下同),比正常發酵72 h后腺苷產量37.2 g/L,提高了5.7%。

圖2 正常發酵與透析發酵OD600 nm、腺苷產量和乙偶姻產量對比Fig.2 Comparison of OD600 nm,adenosine production and acetoin production between normal and dialysis fermentation

膜偶聯透析發酵與正常發酵工藝相比,加入了大量新鮮的培養基,提供充足的營養物質。又通過膜偶聯透析分離出發酵液內高質量濃度的主產物和副產物,有效解除了菌體的反饋抑制作用和副產物的毒害作用,使得菌體能迅速恢復活力,繼續高速率產苷。如圖2所示,正常發酵72 h后副產物乙偶姻產量為41.5 g/L,透析發酵后其產量為31.8 g/L,明顯下降。副產物乙偶姻通過糖酵解途徑生成丙酮酸,再經催化作用生成,而腺苷的合成是通過戊糖磷酸途徑合成,因此副產物的合成速度變慢會使得代謝流更多地流向腺苷的合成途徑中,使得腺苷的合成量增多。正常發酵到后期由于腺苷和一些副產物產量的增多,發酵液內形成晶體,阻礙發酵罐內的供氧,使得發酵罐內溶氧降低,如圖3所示,在44～48 h發酵液中溶氧降低,由圖2可知44～48 h后菌體和產苷變緩。

圖3 正常發酵與透析發酵通風量、溶氧量對比Fig.3 Comparison of ventilation and dissolved oxygen between normal and dialysis fermentation

進行透析之后去除了大量的結晶,使發酵液內供氧充足,菌體恢復活力,同時產苷速率增加。所以,膜偶聯透析發酵可以使菌體保持正增長,產苷速率保持一個較高水平。

2.1.2 膜偶聯透析發酵對發酵過程中葡萄糖消耗速率的影響

如圖4所示,正常發酵工藝中隨著菌體的生長、繁殖和產苷速率的加快,葡萄糖的消耗速率也相應提高,在24～36 h處于較高水平,后期由于菌體量不再增長葡萄糖消耗速率變緩。透析后由于菌體恢復活力,葡萄糖消耗速率也有所增長。可見,膜偶聯透析能夠使菌體保持對數生長期的活力,處于一個持續生長、繁殖和產腺苷的狀態,因此葡萄糖消耗速率也處于較高水平。膜偶聯透析發酵后,采取葡萄糖流加的方式,使發酵液內殘糖始終控制在0～10 g/L。

圖4 正常發酵與透析發酵葡萄糖消耗速率和殘糖量對比Fig.4 Comparison of glucose consumption rate and residual sugar content between normal and dialysis fermentation

2.2 不同時期進行膜偶聯透析對腺苷生產的影響

2.2.1 不同時期進行膜偶聯透析對菌體生長和產苷的影響

為探究最適的膜偶聯透析發酵時間,分4個時期(32、36、40、44 h)進行膜偶聯透析發酵并進行對比。之所以選擇這幾個時期進行透析是因為如果透析發酵過早,菌體量較少,產苷有限;如果透析較晚,菌體活力較差,透析發酵效果不佳。

由圖5-a可知32和36 h進行膜偶聯透析發酵菌體OD600 nm分別達到了93.5和92.7,相比之下菌體量最多。這兩個階段進行膜偶聯透析菌體量大是因為在進行透析時絕大部分菌體處于對數生長期,菌體活力較強,透析之后菌體仍處在對數期,生長速度較快。而在40和44 h進行膜偶聯透析發酵時菌體處在穩定期,此時菌體生長相對較緩慢,發酵72 h菌體OD600 nm分別為87.2和83.5。

如圖5-b所示,在32、36、40、44 h進行膜偶聯透析時發酵液中平均產苷量分別為41.14、42.4、41.06、39.32 g/L。由此可見,在36 h進行透析發酵的總產苷量最大。

a-菌體生長;b-腺苷產量圖5 不同時間段透析發酵對菌體生長和腺苷產量的影響Fig.5 Effect of dialysis fermentation in different periods on the growth and adenosine production of bacteria注:透析發酵1、2、3、4分別代表在發酵的第32、36、40、44 h開始進行膜偶聯透析發酵(下同)

2.2.2 不同時期進行膜偶聯透析對葡萄糖消耗速率、糖苷轉化率和副產物的影響

由圖6可知,透析發酵后葡萄糖消耗速率變大,由于透析后采用葡萄糖流加的方式,所以殘糖量基本保持穩定。由圖7和表1可知,透析發酵2的糖苷轉化率最高,達到24.12%。從圖8可以看出進行透析發酵后乙偶姻的產量下降,其中透析發酵2中乙偶姻的產量最低。

圖6 不同時間段透析發酵對葡萄糖消耗速率和殘糖量的影響Fig.6 Effect of dialysis fermentation in different periods on the rate of glucose consumption and the amount of remaining glucose

可見在36 h進行膜偶聯透析發酵最好,發酵36 h菌體OD達到一定的量,且菌體活力較強,產苷速率較快。若透析發酵較早,菌體還處在快速生長期,葡萄糖的分解更多地用于菌體的生長和繁殖,用于合成代謝產物的則減少。

圖7 不同時間段透析發酵的糖苷轉化率Fig.7 Conversion rate of glucose to adenosine in different periods of dialysis fermentation

表1 不同時期進行透析發酵的參數對比Table 1 Comparison of the data of dialysis and fermentation in different periods

圖8 不同時期進行透析發酵腺苷與乙偶姻產量對比Fig.8 Production of adenosine and acetoin in dialysis fermentation at different periods

如果在后期進行透析發酵,菌體雖然耗糖降低,但同時產苷速率也相對變緩,因此總產苷量相對較少,糖苷轉化率較低。

2.3 不同比例的透析培養基對腺苷發酵的影響

2.3.1 不同比例的透析培養基對腺苷發酵中菌體量和腺苷產量的影響

為了節約原料,減少發酵成本,在最適的膜透析時間下,設置了不同比例的新鮮培養基用于膜偶聯間歇透析發酵的補加培養基,新鮮培養基的營養成分為3 L培養基的50%、60%、70%、80%(分別為透析發酵a、b、c、d)。由圖9-a可知在不同比例的透析培養基中70%和80%的透析培養基發酵到72 h時菌體量最高,分別為90.5和92.6。如圖9-b所示,進行膜透析前發酵液中腺苷產量幾乎一樣,在36 h進行透析后,透析發酵d產苷速率最快,發酵到72 h時產苷43.8 g/L,其次是透析發酵c,在發酵72 h時產苷42.1 g/L。透析發酵a和b最終產苷37.8、39.8 g/L。因此在70%、80%的新鮮培養基中菌體生長和產苷狀況良好,兩個比例的培養基進行透析后菌體量和產苷量幾乎相同,為節約原料,降低發酵成本,應選擇70%的透析培養基進行透析發酵。

圖9 不同比例的透析培養基對菌體量和腺苷產量的影響Fig.9 Effect of different ratios of dialysis medium on growth and adenosine production of bacteria注:透析發酵a、b、c、d分別為補加50%、60%、70%、80%的3 L培養基(下同)

2.3.2 不同比例的透析培養基對腺苷發酵中糖苷轉化率的影響

由圖10看出,發酵c和d中糖苷轉化率最高,兩種方案的糖苷轉化率非常接近。更進一步證明在透析培養中應選擇70%的透析培養基作為新鮮的透析發酵培養基,這樣可以盡可能地節約資源,減少發酵成本。

圖10 不同比例的透析培養基對糖苷轉化率的影響Fig.10 The effect of different ratios of dialysis media on the rate of glucose conversion to adenosine

2.4 透析發酵中的酶活力

在枯草芽胞桿菌中參與嘌呤合成途徑中有幾個關鍵酶決定著產物生成速率的大小,其中非常重要的兩個酶分別是PRPP轉酰胺酶和腺苷琥珀酸合成酶。其中PRPP轉酰胺酶由purF基因編碼,催化嘌呤合成途徑中的第1個反應,即PRPP與谷氨酰胺反應,轉化為5-磷酸核糖胺(5-phosphoribosylamine,PRA),是嘌呤全合成途徑中的關鍵酶,該酶活性的高低直接影響進入嘌呤合成途徑的通量[20-22]。PRPP轉酰胺酶的活性受到AMP和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)的特異性反饋抑制,且當腺嘌呤過量時,PRPP轉酰胺酶的合成被阻遏,當腺嘌呤限量時,可解除對PRPP轉酰胺酶的阻遏作用[9]。有研究表明提高PRPP轉酰胺酶的酶活力可以有效提高嘌呤物質的產量[1]。

腺苷琥珀酸合成酶(adenylosuccinate synthase,Adss)該酶由purA基因編碼,催化IMP和天冬氨酸通過還原作用結合為腺苷酸琥珀酸,此反應是AMP合成分支的第1個反應,是嘌呤合成途徑中的限速步驟[23-26]。該酶僅特異性受AMP系物質的反饋阻遏[9]。

根據圖9可知,進行膜透析后40～60 h是菌體生長和產苷的高峰期,為探究該段時間內菌體中PRPP轉酰胺酶和Adss酶活力是否有所提升,選擇在該時間段中任一時期進行菌體酶活力測定。發酵52 h分別對正常發酵工藝和透析發酵工藝進行取樣,測發

酵液中PRPP轉酰胺酶和Adss酶的活力,如圖11所示,透析發酵后PRPP酶的活力為14.8 U/g,是正常透析發酵的1.9倍,Adss酶活力是正常透析發酵的1.8倍。兩種酶活力均有所提高,因此經過透析發酵能有效地提高嘌呤合成途徑中關鍵酶的活力,從而增加菌體活力,提高腺苷產量和糖苷轉化率,延長產苷周期。

圖11 PRPP酶和Adss酶活力對比Fig.11 Comparison of PRPP enzyme and Adss enzyme activity

2.5 膜偶聯間歇透析發酵對腺苷發酵的影響

為進一步提高腺苷生產速率,如圖12和表2所示,在發酵至60 h時進行了第2次膜偶聯透析發酵,與之前的正常發酵工藝和36 h進行膜偶聯透析發酵工藝相比,膜偶聯間歇透析發酵將發酵周期延長至96 h,OD600 nm達到了94.6,相比于進行一次透析發酵有所提高,腺苷產量由一次發酵72 h總產苷295.4 g,平均產苷42.4 g/L,提升到448.3 g,平均產苷44.2 g/L,糖苷轉化率由24.1%提升到25.1%。

a-菌體量；b-腺苷產量；c-耗糖量；d-糖苷轉化率圖12 間歇透析發酵對腺苷發酵過程中各參數的影響Fig.12 Effect of intermittent dialysis fermentation on the parameters of adenosine fermentation

表2 膜偶聯間歇透析發酵參數Table 2 Membrane coupling batch dialysis fermentation parameters

葡萄糖消耗速率在二次透析后也有所增加。因此通過二次透析可以再次提高腺苷產量,進一步提高糖苷轉化率,使之達到一個較理想的菌體代謝水平和產苷水平。

3 結論

為提高發酵法生產腺苷的產量,延長產苷時間,提高糖苷轉化率,本文以枯草芽孢桿菌為研究對象,分析了透析發酵對腺苷生產的影響,并確定了最優方案。分別在發酵36、60 h對發酵液進行2次膜偶聯透析,使發酵周期延長至96 h,菌體OD600 nm提高到94.6,單批次產苷448.3 g,平均產苷44.2 g/L。糖苷轉化率提高到25.1%。相比于正常發酵工藝產苷周期延長36～40 h,菌體量提高了29.6%,產量增加298.4 g,產苷強度增加7 g/L,副產物乙偶姻產量降低。在發酵52 h時檢測透析發酵中PRPP轉酰胺酶和腺苷琥珀酸合成酶活力,相比于正常發酵工藝均有所提高。由此可見通過膜偶聯透析發酵解除了產物的反饋抑制作用,從而提高了嘌呤合成途徑中相關酶的活性,進而使得菌體活力比較旺盛,降低了副產物乙偶姻的量,使得更多的碳源流向腺苷的合成,膜透析分離出發酵液中的結晶,使得發酵液中溶氧充足,使腺苷合成速率變大,糖苷轉化率提高。目前透析發酵還存在一定的問題尚待解決,例如,每次透析時發酵液的體積控制精度差,透析過程中會造成部分菌體死亡等問題。如果這些問題能夠得到很好的解決對于透析發酵提高產量將會有很大的幫助。