重組表達D-泛解酸內酯水解酶乳酸克魯維酵母的發酵工藝優化

謝頌洋,顧正華,郭自濤,朱慧霞,時祎,辛瑜,張梁*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(制漿造紙工程國家重點實驗室(華南理工大學),廣東 廣州,510640)

D-泛解酸內酯水解酶具有高度的立體選擇性,可立體專一拆分DL-泛解酸內酯,生成D-泛解酸[1-2],是合成其他泛酸衍生物的重要中間體。泛酸,又稱泛解酸、遍多酸、維生素B5,它是幾乎每種天然食物來源中存在的必需微量營養素[3]。

生產D-泛酸的傳統方法是采用Stiller法(異丁醛-甲醛-氰化鈉法)或者乙醛酸-異丁醛法合成泛解酸內酯,再將β-丙氨酸鈣與泛解酸內酯直接縮合即得到DL-泛酸鈣。這種化學拆分的方法存在試劑貴、成本高、分離困難等缺點,此外還伴隨嚴重的環境污染和毒性問題。與傳統方法相比,直接發酵法是通過向能夠自身合成泛酸的微生物中加入相應的前體物質,比如β-氨基丙酸、DL-泛解酸內酯等,使其直接合成D-泛酸,然而,由于該方法分離D-泛酸比較困難,產品收率低,未見工業化的報道。近些年來,微生物立體選擇性拆分D-泛解酸內酯生成D-泛解酸的方法得到越來越多的關注。1994年SAKAMOTO等[4]利用特定菌株選擇性水解DL-泛解酸內酯中的D-泛解酸內酯來生成D-泛解酸。2001年,江南大學利用鐮孢霉菌(Fusarium)生產的水解酶對DL-泛解酸內酯進行拆分,1 L發酵液中有6～8 g干菌,酶活力達到0.52～0.74 U/100 mL[5],并實現了工業化生產；2016年,天津科技大學黎明課題組用離子交換樹脂D380對該酶進行了固定化研究并取得良好效果[6]。在此基礎上,伴隨基因工程技術、固定化材料與方法的發展,這些技術手段也為D-泛酸類物質的高效生產提供了必要的技術條件。例如近些年來興起的有機-無機雜化納米化固定化酶,這種固定化方法已經應用于生物大分子如脂肪酶[7]、牛血清白蛋白[8]和脲酶[9]等,其活性和穩定性較游離酶均有提高；潘敬坤等[10]2018年發表的專利表明,利用硅藻土為載體得到固定化的D-泛解酸內酯水解酶細胞后,可使得固定化酶活力達到140 U/g；余繼剛等[11]在2019年發表的專利中也顯示,通過對赤霉菌進行誘變,可使得誘變菌株的發酵酶活力達4.09 U/100 mL。

本實驗室前期通過分子生物學手段構建了1株高效表達串珠鏈孢霉菌屬D-泛解酸內酯水解酶基因的重組乳酸克魯維酵母(KluyveromyceslactisGG799/pKLAC1-DL),其搖瓶酶活力為(2.83±0.12) U/mL。在本研究中,將在5 L發酵罐上通過探究不同的pH值、攪拌轉速和接種量3種單因素條件,以及不同的補料策略來確定最佳的發酵條件,以期提高D-泛解酸內酯水解酶的酶活力,為進一步地擴大生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

本實驗室保存的重組乳酸克魯維酵母KluyveromyceslactisGG799/pKLAC1-DL。

1.1.2 培養基

種子培養基(YPD)(g/L)：葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖30,酵母粉15,蛋白胨20,NaCl 6,KCl 6,CaCl23,MgSO40.3。

補料培養基(g/L)：葡萄糖500。

1.2 實驗儀器

T&J Atype 5 L玻璃發酵罐,上海迪比爾生物工程有限公司；HC-2518高速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋,三洋電機株式會社；V-1200可見分光光度計,上海美普達儀器公司；HYG-C組合式搖床,江蘇太倉市強樂實驗設備有限公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司；Agilent 1260 System高效液相色譜,美國安捷倫科技公司；DRP-9082型電熱恒溫培養箱,上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子活化

將保藏在-80 ℃冰箱的甘油管按2%的接種量接種于含有15 mL YPD培養基的50 mL三角瓶內進行活化,于30 ℃,200 r/min培養大約21 h；取菌液劃線至YPD固體培養基平板,于30 ℃恒溫培養箱內培養48 h；隨后挑取單菌落在50 mL三角瓶進行活化作為一級種子液,再按2%的接種量接種于含有50 mL YPD培養基的250 mL三角瓶內,30 ℃,200 r/min培養菌體至對數期,作為上罐用的二級種子液。

1.3.2 發酵罐優化培養

以2%的接種量將種子液轉接到5 L發酵罐中,裝液量2.5 L,通氣比為1 vvm,培養溫度30 ℃,發酵時間96 h,使用10%(體積分數)硫酸和50%(體積分數)氨水調解pH。分別考察不同發酵pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、攪拌轉速(200、300、400、500、600 r/min)以及接種量(1.0%、1.6%、2.0%、3.0%)3種因素對產D-泛解酸內酯水解酶的影響。在分批發酵的基礎上,發酵一定時間后流加質量濃度為500 g/L的葡萄糖作為補加的碳源。

1.3.3 粗酶液的收集

將發酵液于4 ℃,12 000 r/min離心20 min,獲得的上清液即為粗酶液。

1.3.4 葡萄糖濃度的測定

參考文獻[12], 使用DNS法測定。

1.3.5 泛解酸內酯和泛解酸的HPLC測定

參考文獻[13]的方法測定。

1.3.6 酶活力測定

酶活力定義：在一定條件下,每分鐘水解1 μmolD(-)-泛解酸內酯成1 μmolD-(+)泛解酸的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

D-泛解酸內酯水解酶酶活力的測定方法：取離心的上清液0.5 mL、1 mL 4%D-泛解酸內酯水溶液、0.5 mL 2 mol/L Tris-HCl緩沖液,混勻并置于37 ℃搖床200 r/min反應10 min后立即放入沸水浴中加熱15 min,隨后將混合液于12 000 r/min離心20 min,以滅活酶作為對照,用HPLC分析泛解酸的生成量,計算每毫升發酵液的酶活力單位(U/mL)。

1.3.7 比速率的測定

參考文獻[14]的方法測定。

2 結果與討論

2.1 pH對分批發酵的影響

發酵過程中培養基的pH是微生物生長和合成產物的重要參數之一,也是反應微生物在一定環境條件下代謝活動的綜合指標。因此,必須通過掌握發酵過程中發酵液的pH變化,使得微生物生長和產物合成處于最佳狀態。由于在搖瓶發酵條件下很難對pH進行有效的控制,所以本實驗在發酵罐中進行分批發酵,并在對pH進行調控,后選取了pH值為5.5、6.0、6.5、7.0時的發酵過程進行比較。

圖1為控制不同pH條件下的發酵結果。酶活力的增加與菌體的生長呈現一定的正相關性,當發酵大約進行到第30 h時菌體進入生長平衡期,此時的酶活力增長緩慢。如表1所示,相較于其他3個pH條件,當pH控制在6.0時微生物產酶的效果最優,酶活力最高可達4.59 U/mL,比pH為5.5、6.5、7.0分別高了22%、13.5%和6%。在pH為6.5時,菌體量雖然增加較高,但是酶活力卻低于pH控制在6.0時的效果。pH為5.5時的OD明顯低于其他3種情況,可以看出低pH不利于菌體的生長和酶的產出。pH為7.0時的最高酶活力同pH為6.0相比相差不大,但是酶的產率較為緩慢,延長了生產時間。綜合以上因素考慮選擇pH控制策略為恒定6.0。

a-pH 5.5;b-pH 6.0;c-pH 6.5;d-pH 7.0圖1 pH值對分批發酵過程的影響Fig.1 Effect of pH on batch fermentation

表1 不同pH值的分批發酵參數對比Table 1 Comparison of parameters during batch fermentation under different pH

2.2 攪拌轉速對分批發酵的影響

在發酵過程中,溶解氧是影響生物生長發酵的重要因素之一,它在細胞生長、產物形成和維持細胞的代謝中起著重要作用[15]。調節發酵罐攪拌轉速是有效控制發酵液中溶氧狀態的主要條件方式,但是過高的攪拌轉速產生的剪切力也會對菌體的生長產生影響。

表2 不同攪拌轉速的分批發酵參數對比Table 2 Comparison of parameters during batch fermentation under different agitation speeds

2.3 接種量對分批發酵的影響

接種量是影響微生物生長及產物合成的另一個重要因素,接種量過小,菌體不足,延長期較長；接種量過大,菌體繁殖快,會造成培養基營養物質消耗過快,不利于微生物的持續生長,并進而影響產物的合成[20]。如圖3所示,分別以4種不同的接種量進行分批發酵(1.0%、1.6%、2.0%和3.0%),接種量的多少直接影響糖的消耗速率,但這4種情況基本上在發酵第40 h時將糖耗完,之后OD和酶活力處于一種動態平衡狀態。從圖3曲線趨勢和表3數據可知,不同接種量的最高酶活力和菌體生產強度的值相差不大,接種量對菌體的發酵產生的影響很小,只是延遲了菌體生長和產酶的時間。由于之前的接菌量一直是2%,所以后續還以2%的接種量進行發酵。

攪拌轉速:a-200 r/min;b-300 r/min;c-400 r/min;d-500 r/min;e-600 r/min圖2 攪拌轉速對分批發酵的影響Fig.2 Effect of agitation speed on batch fermentation

接種量:a-1%;b-1.6%;c-2%;d-3%圖3 接種量對分批發酵的影響Fig.3 Effect of inoculum volume on batch fermentation

表3 不同接種量的分批發酵參數對比Table 3 Comparison of parameters during batch fermentation with different inoculum volume

2.4 恒糖濃度對補料分批發酵的影響

根據前期的單因素實驗,當發酵pH為6.0,攪拌轉速為300 r/min,接種量為2%時分批發酵效果最好。為了進一步探索補料對發酵過程中產D-泛解酸內酯水解酶的影響,以初始葡萄糖30 g/L,發酵液起始體積為2 L,發酵一段時間后,通過補加質量濃度為500 g/L的葡萄糖以維持發酵過程中的糖質量濃度(1、5、10 g/L)。圖4為控制不同恒糖濃度的發酵結果,菌體的生長對數期是在發酵的0～30 h,在此期間,菌體生長旺盛且耗糖速率最快。當在補料發酵過程中維持葡萄糖質量濃度為5 g/L時,由表4數據可知,最高酶活力可達8.20 U/mL,與維持糖質量濃度1、10 g/L比分別高了61%和30%。導致這種現象的原因可能是由于過低或者過高的恒糖濃度均不利于D-泛解酸內酯水解酶的分泌。為證明發酵過程中的殘糖累積是否影響了酶活力,使用恒速補料策略來驗證。

發酵過程中的含糖量:a-1 g/L;b-5 g/L;c-10 g/L圖4 恒糖質量濃度對補料分批發酵過程的影響Fig.4 Eflect of different constant glucose concentration on fed-batch fermentation process

表4 不同恒糖濃度的補料分批發酵參數對比Table 4 Comparison of parameters during fed-batch fermentation process with different constant glucose concentrations

2.5 恒速補糖對補料分批發酵的影響

為了消除碳源濃度過高對產D-泛解酸內酯水解酶的影響,將恒糖補料方式改變為恒速流加葡萄糖。在分批發酵過程中,當發酵液中殘糖濃度<1 g/L時,分別以5、10、15 g/h的速度流加濃度為500 g/L的葡萄糖溶液。由圖5-a可看出,當補料速度為5 g/h時,所補加的葡萄糖可被耗盡,并使菌體保持較高的生長速率,在此條件下最高酶活力達到了10.70 U/mL(見表5)。

補糖速率:a-5 g/h;b-10 g/h;c-15 g/h圖5 恒速補料對補料分批發酵過程的影響Fig.5 Eflect of constant feeding speed on fed-batch fermentation

當補料速度為10和15 g/h時,由于菌體無法消耗過多的碳源,導致發酵過程中葡萄糖濃度的積累,此時OD比補糖速度5 g/h時分別低了10.2%和25.6%,酶活力則分別低了56%和69%,可以看出高濃度的糖對菌體的生長和產酶都造成了一定的抑制。而且這種補料方法有一個缺陷,就是恒速補料流速的大小可能使得菌體在對數生長期缺糖或短時間內出現糖累積現象,為此又進行了指數補料實驗。

表5 恒速補料的發酵參數對比Table 5 Comparison of parameters during fed-batch fermentation with constant feeding speed

2.6 指數補料對補料分批發酵的影響

YEE等[21]認為目前最成功的基因工程菌高密度培養方法是指數流加法。補料速度隨著發酵時間的進行而呈指數增加,較好地避免了菌體在生長對數期因為缺糖導致的生長受到抑制或對產酶的影響。指數補料的流加速率如公式(1)所示。

(1)

式中：F,流加速度,L/h；μ,設定的比生長速率,h-1；XO和VO分別是流加初始時的細胞質量濃度(g/L)和培養基體積(L)；t,指數流加后的發酵時間,h；Y,細胞對葡萄糖的得率系數(由分批發酵數據得到)；SO,補料用的葡萄糖質量濃度,g/L。

設定的μ值需小于μmax(根據上述分批發酵結果求得),所以本文設定了μ值分別為0.15 h-1和0.20 h-1。當發酵液中殘糖質量濃度<1 g/L時開始指數流加補料,根據上述補料結果得知發酵液中殘糖質量濃度過高對菌體生長和酶活力有很大影響,所以當發酵液殘糖質量濃度>10 g/L時逐漸降低降低補料流速,直到殘糖質量濃度達到動態平衡。當設定μ=0.15 h-1時,由表6可知,此時最高OD為210,最高酶活力為4.50 U/mL,殘糖最高累積到大約10 g/L。如圖6-b所示,當設定μ=0.20 h-1時,指數補料的速度更快,發酵第30 h時流速為66 mL/h,殘糖最高積累到大約25 g/L,最高OD為216同圖6-a相比稍微有所增加,但是最高酶活力比圖6-a下降了22.4%。雖然指數補料能獲得更多的菌體,但發酵液中殘糖越多酶活力卻越低,就如同上述以恒速10和15 g/h補糖時,發酵液中的殘糖抑制菌體產酶。這印證了上述結果的觀點,即酶活力的增加與菌體生長呈現一定正相關性,但不意味著OD越高酶活力越高,且高濃度殘糖的累積抑制了菌體產酶。

a-μ=0.15 h-1;b-μ=0.20 h-1圖6 指數補料對補料分批發酵過程的影響Fig.6 Effect of exponentical feeding speed on fed-batch fermentation

表6 指數補料的發酵參數對比Table 6 Comparison of parameters during fed-batch fermentation with exponentical feeding speed

3 結論

本研究在5 L玻璃發酵罐中探索了不同的pH、攪拌轉速、接種量3種單因素以及3種不同的補料措施,分別以分批發酵及補料分批發酵方式,實現了D-泛解酸內酯水解酶在乳酸克魯維酵母(K.lactisGG799/pKLAC1-DL)中的高效表達。單因素實驗發現,當發酵pH為6.0時,攪拌轉速為300 r/min時,接種量為2%時,分批發酵效果最好,酶活力最高為5.12 U/mL。與分批發酵相比,當維持補料發酵過程中恒糖濃度為5 g/L時,酶活力可達8.20 U/mL,比最優的分批發酵酶活力提高了60.1%；而當以5 g/h進行恒速補料時,此時流加的糖能夠全部被耗盡,酶活力最高為10.70 U/mL,較分批發酵提高了98.6%,指數補料策略雖然保證了發酵過程菌體不會缺糖,但是殘糖的累積對菌體的產酶有很大抑制作用,高OD并沒有帶來預想中的高酶活力,所以在發酵過程中不能有過多殘糖的累積。與同類研究相比,本研究中所獲得的發酵最高酶活力有了明顯提高。例如,在2020年1月公布的專利中穆曉玲等使用1株串珠鐮刀菌B5-1-7發酵,最高酶活力82.3 U/g干菌體[22],本研究的酶活力單位經過換算成干菌體酶活力得最高酶活力為153 U/g干菌體,與之相比酶活力提高了1.86倍；在另一份2020年5月公布的專利中,吳建中等使用1株串珠鐮刀菌JHpharm 2-1,最高酶活力6.75 U/mL[23],本研究中的最高酶活力為10.70 U/mL,與之相比酶活力提高了1.58倍。以上結果為進一步擴大D-泛解酸內酯水解酶的生產規模與提高產酶效率提供了技術參考。