重組谷氨酰胺轉胺酶突變體的表達、分離純化及其催化應用

宋小平,沈何放,余銀,馬若彤,潘李娜

1(安徽醫學高等專科學校 藥學系,安徽 合肥,230061) 2(安徽省重組蛋白藥物工程技術研究中心,安徽 合肥,230022)

谷氨酰胺轉胺酶(transglutaminase,TG)能夠催化蛋白質肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與各種酰基受體發生酰基轉移反應,是一種有效的蛋白質交聯劑[1-3]。微生物谷氨酰胺轉胺酶(microbial transglutaminase,MTG)具有低蛋白分子質量、非Ca2+依賴性和較廣的底物范圍等優點,在食品工業[4-6]、生物醫藥[7]、組織工程[7]、定點蛋白交聯[8]和同源抗體偶聯藥物的構建等行業均具有廣泛的應用價值[8-10]。近年來,通過分子進化獲得更高活性和熱穩定性的突變酶,并擴大其應用范圍的研究一直受到國內外學者的密切關注。

我們在前期研究中,成功構建了一種5位點組合突變的畢赤酵母菌株pro/rDNA-mtg-mut2,其表達的重組酶MTG-MUT2為5個氨基酸組合突變體：S2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y。MTG-MUT2比酶活力為(39.3±1.6) U/mg,是野生酶的2.4倍[野生酶(16.7±0.7) U/mg]；最佳酶反應溫度是55 ℃；50和60 ℃的半衰期分別為446.9和 27.6 min,分別是野生酶的11.7和10.2倍(野生酶在50和60 ℃的半衰期分別為38.5和2.7 min)。本研究首先通過高密度發酵獲得粗酶液,分離純化得到純酶；并對該純酶的3個組分進行分離,分析糖基化對酶活性的影響及其影響機制。然后,研究該純酶催化氨基酸交聯反應,旨在拓展重組酶MTG-MUT2的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

畢赤酵母重組菌株pro/rDNA-mtg-mut2為本實驗室構建并保藏。

1.1.2 儀器

AKTA Pure蛋白質層析純化系統、Superdex 75 prep grade,GE公司；BWS465-785S拉曼光譜儀,美國必答泰克公司。實驗用水為超純水。

1.1.3 試劑與培養基

N-carboxybenzoyl-L-glutaminyl-glycine(N-CBZ-Gln-Gly)、L-谷氨酸-γ-單羥胺酸、牛血清蛋白,Sigma-Aldrich公司；還原型谷胱甘肽,華美生物工程有限公司；anti-MTG,Eurogentec公司；L-谷氨酰胺(純度>99%),國藥集團試劑有限公司；L-賴氨酸(純度>99%),麥克林試劑公司。其他試劑均為國產分析純。

畢赤酵母培養基：YPD、BMGY、BMMY,參照Invitrogen公司的操作手冊配制,畢赤酵母培養溫度28 ℃,誘導溫度25 ℃[9-10]。

1.2 實驗方法

1.2.1 pro/rDNA-mtg-mut2 的高密度發酵及純化

高密度發酵在14 L發酵罐中進行。采用起始發酵體積為3 L的發酵體系,初始培養基組成：2.4 L BMGY(4%甘油)+300 mL YNB+300 mL PPB,發酵參數設定為：pH 6.0,生長溫度28 ℃,攪拌轉速800 r/min,通氣量10 L/min。當罐內基礎甘油用完后,溶氧會在短時間內上升,此時開始補加甘油,50%甘油(含12 ml/L PTM1)恒速補料25 mL/(L·h)。當菌體濕重達到(195±2)g/L時停止補甘油,開始補加100%甲醇誘導(甲醇含12 mL/L PTM1)。甲醇誘導采用3步補料(根據甲醇電極判斷補料時間點),誘導溫度調整為25 ℃。整個發酵過程中控制溶氧水平為25%～30%[9-11],誘導40 h。每8 h取樣測定菌體濕重和酶活力,采用非還原SDS-PAGE檢測,膠濃度10%,Western Blot鑒定目標蛋白,鑒定用抗體為anti-MTG。發酵產物的分離純化采用His Trap HP組氨酸標記親和層析法,操作步驟見參考文獻[9-10]。純化樣品檢測方法同上。

1.2.2 MTG-MUT2酶活力測定

異羥肟酸比色法測定MTG酶活力,按照參考文獻[12-14]的方法進行。MTG酶活力定義為：在37 ℃下,MTG每分鐘催化底物(N-CBZ-Gln-Gly)生成1 μmoL谷氨酸-單羥胺酸(氧肟酸)為1個酶活單位。蛋白濃度測定采用Bradford方法,標準蛋白為牛血清蛋白[13]。

1.2.3 糖基化對MTG-MUT2酶活性的影響

將1.2.2 所得純化樣品過分子篩(Superdex 75 prep grade),并在同一條件下測定這3個組分的酶活力,以探索糖基化對酶活性的影響,酶活力測定方法見1.2.2。流程為：平衡→上樣→洗脫。PBS(pH 7.4)平衡分子篩,上樣流速為2 mL/min,PBS洗脫,手動收集各個紫外峰組分,SDS-PAGE檢測,膠濃度10%,每孔上樣量2.5 μg,考馬斯亮藍R-250染色。

1.2.4 MTG-MUT2催化條件優化

為了進一步探討MTG-MUT2對蛋白質中氨基酸的交聯作用,以L-谷氨酰胺和L-賴氨酸作為底物,首先分析反應底物的配比對產物生成的影響。固定L-谷氨酰胺的濃度為300 mmol/L,L-賴氨酸與其的比例為A∶0.9、B∶1.0、C∶1.1、D∶1.2,在55 ℃、pH 6.5下反應2 h,比較谷賴二肽產量,確定2種底物最適合的添加比例。接著,研究L-谷氨酰胺的濃度分別為100、200、300、400、500、600 mmol/L時,L-賴氨酸和L-谷氨酰胺添加比例的最適比例,比較谷賴二肽產量。

1.2.5 MTG-MUT2催化產物的檢測

采取檸檬酸鈉還原法制備銀納米顆粒(Ag nanoparticles,AgNPs),Ag+被還原成直徑為納米級的AgNPs。具體制備依據文獻[14-19]的方法進行制備。

將待測樣品用PBS緩沖液(pH 7.2)稀釋為100 μg/mL。取50 μL待測樣本與50 μL修飾后的AgNPs混合后放入微量比色皿中進行表面增強拉曼散射光譜(surface enhanced Raman scattering,SERS)測試。激發波長為785 nm,積分時間5 ms,激光功率20 mW。數據采集及光譜處理均采用光譜儀自帶軟件。

2 實驗結果

2.1 pro/rDNA-mtg-mut2在14 L發酵罐中的表達和純化

典型的發酵曲線如圖1-a所示,包括間歇培養、甘油進料和甲醇誘導階段。在間歇培養階段,酵母種子在含4%甘油(pH 6.0)的BMGY培養基中培養,28 ℃控制,持續17～18 h,當細胞濕重(wet cell weight,WCW)達到140 g/L,開始補甘油。在甘油補料階段,補50%的甘油(含有12 mL/L PTM1溶液),將DO控制在30%,溫度維持在28 ℃,至WCW達到約(195±2)g/L時,補料結束。當溶氧(dissolved oxygen,DO)出現急劇上升,開始甲醇誘導(100%甲醇,含12 mL/L PTM1),甲醇采取3步誘導：3.6、7.2和10.8 mL/(L·h),誘導過程DO保持在大約30%(圖1-a)。甲醇誘導持續40 h,當酵母WCW達到約340～350 g/L時結束。在甲醇誘導的前32 h,MTG-MUT2的酶活力和表達逐漸增加(圖1-b～圖1-d)；然而,誘導32 h后,MTG-MUT2酶活力和表達量增加不明顯,發酵結束時,發酵上清液的最高酶活力為7.45 U/mL(圖1-b)。

2.2 MTG-MUT2的純化和SDS-PAGE分析

對pro/rDNA-mtg-mut2高密度發酵的70 h培養上清液進行1步鎳柱親和層析純化,收集洗脫液215 mL。如表1所示,酶活力為12.3 U/mL,蛋白質量濃度274.3 μg/mL,蛋白純化2.7倍,回收率為87.4%。SDS-PAGE結果如圖2所示,重組MTG-MUT2有3條特異性蛋白帶,分別為1條非糖基化條帶和2條糖基化條帶,大小為38 k～42 kDa,這與前期實驗結果及文獻報道的1～3條帶的結果相一致[10-12]。

a-發酵曲線；b-不同誘導時間的生物量和酶活力；c-SDS-PAGE不同誘導時間發酵上清液；d-WB檢測不同誘導時間發酵上清液圖1 pro/rDNA-mtg-mut2高密度發酵過程的檢測Fig.1 Parameters detected at different induction time of high-density pro/rDNA-mtg-mut2 fermentation

表1 重組MTG的純化方案Table 1 Purification scheme of recombinant MTG-MUT2

圖2 SDS-PAGE檢測純化MTG-MUT2Fig.2 Detection of purified MTG-MUT2

2.3 糖基化對MTG-MUT2酶活性的影響

MTG-MUT2的3個組分分離結果如圖3所示。與未分離蛋白條帶比較,3條蛋白帶的主帶已分離,根據分子質量從大到小依次為42、40、38 kDa,但由于2條帶表觀分子質量相差只有約2 kDa,所以條帶沒有完全分開,但不影響后續酶活力的分析。以未分離酶作為對照,在同一條件下檢測這3個組分(42、40、38 kDa)的酶活力,結果分別為：10.6、14.7和8.7 U/mL,40 kDa糖蛋(14.7 U/mL)是非糖基化酶(8.7 U/mL)的1.7倍；2個位點均發生糖基化的酶活力次之(10.6 U/mL),是非糖基化酶的1.2倍。

1,5-未過分子篩樣品(不同批次)；2～4-分離后的蛋白樣品圖3 MTG-MUT2分離后組分的SDS-PAGE檢測Fig.3 Components seperated by MTG-MUT2 detected by SDS-PAGE

2.4 MUT2催化條件優化

固定谷氨酰胺的濃度為300 mmol/L,L-賴氨酸與其的比例為A∶0.9、B∶1.0、C∶1.1、D∶1.2,在55 ℃、pH 6.5下反應2 h,結果如圖4所示(圖中數據均為扣除基線和溶劑的峰)。拉曼光譜特征峰在298～2 000 cm-1,與Gln和Lys比較,Lys與Gln連接產物可能的峰在719、755、1 180、1 288、1 476、1 602 cm-1(圖4)。其中719、755 cm-1主要是酰胺Ⅳ的CO面內彎曲所致,1 180 cm-1是NCαC骨架伸縮振動的特征峰,1 288 cm-1主要是酰胺Ⅲ中NH 面內彎曲引起的峰,因此1 288 cm-1可作為Gln的γ-羧酰胺基與Lys的酰基形成酰胺鍵(肽鍵)的重要指征,是2個氨基酸交聯的重要依據,其峰強可反映谷賴二肽的生成量。

圖4 Lys和Gln交聯反應產物的拉曼光譜圖Fig.4 Raman spectra of Lys and Gln cross-linked reaction products

谷賴二肽在1 288 cm-1的拉曼光譜峰強度隨著底物賴氨酸濃度的增加而增大,但當比例大于1.1時,峰強增加有限(峰強度3 550.7 a.u.),所以當賴氨酸濃度為330 mmol/L,谷氨酰胺濃度為300 mmol/L,即比例1.1為底物的最佳濃度比(圖5-a)。L-賴氨酸和L-谷氨酰胺的添加比例為1.1,谷賴二肽的產量如圖5-b所示。隨著L-谷氨酰胺的濃度從100 mmol/L 增加到600 mmol/L,谷賴二肽在1 288 cm-1的拉曼光譜峰強度隨著底物谷氨酰胺濃度的增加而增大,分別為3 191.8、3 250.1、3 550.7、3 764.7、3 994.6和4 274.7 a.u.。

a-Lys/Gln對催化反應的影響；b-Gln濃度對催化反應的影響圖5 底物的配比和底物濃度對MTG-MUT2催化反應的影響Fig.5 Effect of substrate ratio and substrate concentration on MTG-MUT2 catalytic reaction

3 結論與討論

本研究對前期構建的畢赤酵母pro/rDNA-mtg-mut2,在14 L發酵罐高密度發酵表達獲得MTG-MUT2,對其純化酶的催化交聯反應進行了研究,并探索了糖基化對酶活力的影響。

研究表明,在pH 為6.0時,誘導WCW為(195±2) g/L,采取甲醇3步補料工藝3.6 mL/(L·h) 5～6 h、7.2 mL/(L·h) 2～3 h和10.8 mL/(L·h)持續到下罐,產酶速率最快,為8.89 U/g WCW；酶活性最高,達到3.12 U/mL。一般誘導時間越長,目的蛋白的表達量越高,但誘導時間過長,可能會影響共表達2種蛋白(前導肽PRO和MTG-MUT2)的平衡[3,10-11],反而會抑制MTG-MUT2的活性表達,故本研究中誘導時間不超過45 h。在優化的最適合培養條件下,對該菌株在14 L發酵罐中高密度發酵表達,表達產物通過1步鎳柱親和層析純化,蛋白純化2.7倍,回收率為87.4%。

表達的重組蛋白在內質網中正確折疊是其正常分泌的重要條件,這是影響畢赤酵母高效表達蛋白的重要因素,分子伴侶和N-糖基化對有些蛋白的正確折疊是必不可少的[20-23]。本研究中Western Blot鑒定結果顯示MTG-MUT2在34～43 kDa處有3條特異性蛋白帶,表明有2個位點均參與了MTG-MUT2的糖基化修飾。分析其晶體結構發現MTG-MUT2有2個N-糖基化位點：N282和N297,N282環繞在活性位點C64附近,推測通過N-糖基化修飾增加肽鏈的親水性,從而使肽鏈能夠避免修飾位點與附近其他蛋白發生疏水作用,從而提高蛋白折疊的可能性,并增大了與底物的接觸面積,賦予其較高的酶活。另一個糖基化位點N297,與N282相距較近,因位阻作用影響其糖基化以及與底物結合,從而影響酶活,因而N297只是一個潛在的糖基化位點,這就解釋了2個位點均發生糖基化的蛋白酶活(10.6 U/mL)要低于1個位點糖基化(N282)的酶活(14.7 U/mL),但是均高于非糖基化蛋白酶活(8.7 U/mL)。以上研究結果表明,糖基化有助于MTG-MUT2的正確折疊,增大了與底物的接觸面積,從而賦予其較高的酶活。

本研究還對該純化酶催化L-谷氨酰胺的酰基轉移給L-賴氨酸的交聯反應條件進行了研究,并采用SERS快速、靈敏分析交聯反應產物[24-26]。實驗結果顯示底物賴氨酸的拉曼特征峰位于651、1 203、1 354、1 518 cm-1,谷氨酰胺的拉曼特征峰位于384、501 cm-1,賴氨酸與谷氨酰胺連接產物可能的峰位于719、755、1 180、1 288、1 476、1 602 cm-1(圖4)。其中1 288 cm-1主要是酰胺Ⅲ中NH 面內彎曲引起的峰,因此1 288 cm-1可作為Gln的γ-羧酰胺基與Lys的酰基形成酰胺鍵(肽鍵)的重要指征,是2個氨基酸交聯的重要依據,其峰強可反映谷賴二肽的生成量。確定了賴氨酸和谷氨酰胺的最適添加比例為1.1；在最適反應條件下(反應溫度55 ℃,最適pH 6.5),當谷氨酰胺濃度為600 mmol/L、賴氨酸濃度為660 mmol/L時,反應2 h,谷賴二肽在1 288 cm-1的特征峰強度為4 274.7,高于野生酶在同等反應條件下峰強的20%(野生酶：2 992.5),顯示出該酶在較高反應溫度下較好的氨基酸交聯反應。雙縮脲反應適用于分子中含兩個或兩個以上肽鍵(—CO—NH—)等基團的物質,不能用于二肽的檢測。研究結果表明,采用銀溶膠作為SERS基底,能夠快速簡便、高效靈敏檢測谷氨酰胺轉氨酶催化的反應產物。

綜上所述,MTG-MUT2具有良好的熱穩定性和催化效率高的優良特性,在工業生產中具有良好的應用潛力。MTG-MUT2催化蛋白質內或蛋白質間交聯反應的性質,使其在組織工程上有潛在的應用,有待后續研究。