魚露中高產蛋白酶耐鹽菌株的篩選、鑒定及產酶條件優化

李文靜,李春生,李來好*,王悅齊,陳勝軍,楊少玲

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266100) 2(中國水產科學研究院南海水產研究所 農業農村部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東 廣州,510300) 3(大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連，116034)

魚露是一種以低值魚蝦為原料,經過長時間自然發酵制得的調味品,具有獨特的風味和營養價值。魚露味道鮮美,富含氨基酸、有機酸、微量元素以及抗氧化活性物質等成分[1],備受東南亞以及我國南方沿海一帶人民的喜愛。我國魚露的生產過程是將新鮮的魚與高濃度的鹽(質量分數20%～30%)混合,通過耐鹽性、嗜鹽性微生物和魚體自身所含的酶將魚蛋白分解成肽和氨基酸,最終形成一種清澈的琥珀色液體[2]。魚露完全依靠自然發酵,需要12～24個月,生產周期長,是目前魚露生產企業面臨的難題。

采用加菌或加酶發酵是目前魚露快速發酵常用的方法。有研究者將可以產生多種高活性酶且安全性較高的微生物菌株應用到魚露發酵過程中。SUN等[3]添加AspergillusoryzaeOAY1進行魚露發酵,雖然發酵速度有所提高,但失去了魚露的特征風味,同時容易污染雜菌,造成腐敗變質。為避免雜菌污染,國內外對快速發酵魚露的研究主要集中于從魚露發酵過程中篩選產蛋白酶菌株作為發酵劑,分析菌種發酵對魚露發酵速度以及各項理化指標的影響。目前,從魚露等傳統發酵食品中篩選到的菌屬主要包括乳桿菌屬(Lactobacillussp.)[4-5]、枝芥孢桿菌屬(Virgibacillussp.)[6-8]、平球菌屬(Planococcussp.)[9]、嗜鹽桿菌屬(Halobacteriumsp.)[10]、四聯球菌屬(Tetragenococcussp.)[11-13]等。但由于上述菌株產酶能力低,在高鹽環境下失活等限制因素,未能實現在魚露發酵產業中的應用。采用添加蛋白酶制劑發酵魚露時,其種類主要為中性、堿性蛋白酶等商用酶制劑,酶解效果差、耐鹽能力低、應用成本高,缺少適合魚露發酵的專用酶制劑。

本研究利用透明圈法從魚露發酵液中篩選到了1株產蛋白酶且耐鹽的菌株B-2,采用VITEK 2 COMPACT細菌鑒定系統和16S rRNA基因序列分析分別對其進行生理生化和分子生物學鑒定,利用掃描電子顯微鏡觀察菌株在不同鹽度下的形態變化,評價菌株的耐鹽能力,并分別對培養基成分和發酵條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 魚露發酵液樣品

不同發酵時間下的魚露發酵液,汕頭魚露廠有限公司。

1.1.2 試劑

豆粕、酪蛋白、酪氨酸標準品,北京索萊寶生物科技有限公司；Na2CO3、NaCl、三氯乙酸,上海麥克林生化科技有限公司；福林-酚試劑,國藥集團化學試劑有限公司；VITEK 2 BCL卡,法國生物梅里埃公司。

1.1.3 培養基

初篩平板培養基(g/L)：胰蛋白胨5.0,酵母膏粉2.5,葡萄糖1.0,瓊脂15.0,脫脂奶粉30.0,蒸餾水1 000 mL,pH (7.0±0.2)。

液態發酵培養基(g/L)：蛋白胨10.0,酵母膏粉5.0,NaCl 5.0,葡萄糖1.0,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0±0.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選

初篩采用水解圈的方法：將魚露發酵液用無菌生理鹽水稀釋,取100 μL稀釋的魚露發酵液均勻涂布于初篩平板培養基,于37 ℃恒溫培養箱培養直至有透明圈出現。挑取透明圈直徑較大的菌落進行分離純化。通過測定蛋白酶活力進行復篩：將純化后的菌株分別進行液體發酵培養,發酵溫度為37 ℃,搖床轉速為180 r/min,發酵時間為24 h。篩選出產蛋白酶活力最高的菌株在4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 菌株鑒定

用接種環將新鮮培養的細菌在聚苯乙烯試管壁上研磨,用無菌水(含4.5 g/L NaCl)將菌液濁度調至1.8～2.0 MCF。將BCL卡片和菌株懸濁液一同放入VITEK 2 COMPACT細菌鑒定儀。

菌株B-2的分子生物學鑒定采用16S rRNA基因測序(北京六合華大基因科技有限公司)的方法。選擇與B-2基因序列相似度較高且為同一菌屬的標準菌株,然后使用Clustal W進行多序列對比分析。在MEGA 5.1軟件中選擇鄰位相連法(Neighbor-Joining)進行系統發育進化樹的構建。

1.2.3 菌株在不同鹽環境下細胞形態和生長情況

菌株B-2種子液以2%的接種量分別接種到含0、50、100、150、200、300 g/L NaCl的發酵培養基中,在37 ℃、180 r/min下培養48 h。發酵液離心后棄去上清液,菌體經過清洗、固定、脫水、冷凍干燥等步驟,在掃描電子顯微鏡下觀察細胞形態。采用干重法評價菌株在不同鹽環境下生長情況。將在不同鹽濃度下培養的發酵液于12 000 r/min離心10 min,菌體用無菌超純水洗滌1次,110 ℃烘箱烘至恒重后稱質量,計算菌體生物量(g/L)。

1.2.4 培養基成分優化

1.2.4.1 碳源種類及濃度

分別以1 g/L的淀粉、麥芽糖、果糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖為發酵培養基中的碳源,其他成分不變。各培養基發酵液中產蛋白酶活力最高的成分確定為最適碳源。同時研究不同碳源含量對蛋白酶活力的影響,確定最適碳源添加量。

1.2.4.2 氮源種類及濃度

在上述培養基的基礎上,分別以5 g/L的脫脂奶粉、酪蛋白、豆粕、牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨作為發酵培養基中的氮源。各培養基發酵液中產蛋白酶活力最高的成分確定為最適氮源。同時研究不同氮源含量對蛋白酶活力的影響,確定最適氮源添加量。

1.2.4.3 NaCl質量濃度

在上述培養基的基礎上,添加NaCl進行發酵,NaCl的質量濃度分別設為0、5、10、15、20、25 g/L,測定發酵液中蛋白酶活力,確定最適NaCl添加量。

1.2.4.4 響應面優化培養基成分

在單因素實驗的基礎上,以果糖(A)、豆粕(B)、NaCl(C)質量濃度為因素,發酵液中蛋白酶活力(Y)為響應值,利用響應面軟件中的Box-Behnken法,設計3因素3水平的實驗,確定培養基中各成分的添加量。

1.2.5 發酵條件優化

1.2.5.1 pH

在最適培養基條件下,將培養基pH分別調至6、7、8、9、10、11,通過發酵液產蛋白酶活力的大小,探究菌株最適產酶pH。

1.2.5.2 溫度

在上述條件下,將菌株B-2置于25、30、35、40、45、50 ℃的溫度下培養,通過測定發酵液中蛋白酶活力的大小,探究菌株最適產酶溫度。

1.2.5.3 接種量

在上述條件下,分別將接種量設置為1%、2%、3%、4%、5%,通過測定發酵液中蛋白酶活力的大小,探究菌株最適產酶接種量。

1.2.5.3 響應面優化培養基成分

在單因素實驗的基礎上,以pH(X1)、溫度(X2)、接種量(X3)為因素,發酵液中蛋白酶活力(Y)為響應值,利用響應面軟件中的Box-Behnken法,設計3因素3水平的實驗,確定菌株最適發酵條件。

1.2.6 發酵條件優化

菌株產蛋白酶活力的測定均采用福林法

1.2.7 統計分析

每組實驗重復測定3次,然后使用SPSS 20.0對實驗數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA),使用Tukey法檢驗數據差異性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

從魚露發酵液中初篩得到16株能夠產生明顯透明圈的菌株(圖1)。

圖1 魚露中產蛋白酶菌株水解透明圈形態Fig.1 Protease hydrolyzed transparent circles of the primary screening strains in fish sauce

復篩結果顯示,發酵9個月的魚露中分離出的菌株B-2產蛋白酶活力最高,達到28.05 U/mL(圖2)。

菌株B-2的生理生化鑒定結果如表1所示,其符合芽胞桿菌的特征反應,初步確定菌株B-2屬于芽胞桿菌屬(Bacillus)。

進一步的菌株B-2基因測序結果顯示,其與多種Bacillus的菌株高度相似。利用B-2基因序列與相近的標準菌株構建系統發育進化樹,菌株B-2的16S rRNA基因序列與BacillussubtilisNCIB 3610的距離最近(圖3),兩者同源性為100%。結合菌株B-2特征反應和16S rRNA基因序列,確定該菌為Bacillussubtilis,并命名為BacillussubtilisB-2。目前,已經從魚露發酵液中篩選到B.megaterium[13]、B.piscicolaNR1-3-2T[14],B.licheniformisRKK-04[15]等其他芽胞桿菌屬,但是對于枯草芽胞桿菌的篩選較少。本研究也是近年來,首次從中國傳統發酵魚露中篩選到B.subtilis。

圖2 篩選菌株的產蛋白酶活力測定Fig.2 Protease activity of the strains

表1 利用VITEK 2 COMPACT細菌鑒定系統分析菌株B-2的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain B-2 tested by VITEK 2 COMPACT

圖3 利用Neighbor-Joining構建菌株B-2系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain B-2 constructed by Neighbor-Joining method

2.2 菌株耐鹽性

菌株B-2在不同鹽含量下的產酶情況如圖4-a所示。培養12 h,菌株生成的菌落較小,分解蛋白質較少、產生透明圈較小、產酶較少,可能是由于培養時間太短,菌株還未完全生長；培養24 h,各平板上均有較明顯的透明圈出現,其中不含NaCl的平板上透明圈最為明顯,含100 g/L NaCl的平板上透明圈最小；培養48 h,含50和100 g/L NaCl平板中透明圈進一步擴大,說明菌株B-2在0～100 g/L NaCl環境中均生長并產生蛋白酶。

在不同鹽環境下對應的掃描電鏡細胞形態如圖4-b所示。當在不含鹽的環境下培養時,菌株B-2呈桿狀,細胞大小(長×寬)為1.44 μm×540 nm,表面光滑,細胞結構完整；當在50 g/L的NaCl環境下培養時,細胞雖無明顯破裂,但細胞變短至1.02 μm×663 nm,呈短桿狀；當在100 g/L的NaCl環境下培養時,高環境的滲透壓對細胞形態影響較大,細胞被拉長到11.5 μm×658 nm,呈長條狀且細胞結構有輕微破裂。

a-產酶情況；b-細胞形態圖4 菌株B-2在高鹽條件下產蛋白酶特性、形態特征Fig.4 Protease production,morphological characteristics of strain B-2 under high salinity

當NaCl含量超過150 g/L時,細胞表面形成明顯褶皺,大小和形態與不加鹽時無顯著變化。由此推斷,在0～100 g/L NaCl質量濃度下,細胞代謝旺盛,能夠通過改變自身形態來應對不同鹽濃度環境。而當NaCl質量濃度超過150 g/L時,細胞代謝受到顯著抑制,并對細胞造成一定損害。

進一步研究了不同鹽環境下菌株B-2的生長情況,結果如圖5所示。隨著NaCl含量增加,生物量呈下降趨勢,但與初始接種量相比,在200 g/L的條件下菌株的生物量依然顯著增加,在300 g/L的條件下菌株依然能夠緩慢生長。結果表明,該菌株具有很強的耐鹽性,在200～300 g/L的鹽環境下仍能夠保持生長和代謝。與其他已報道的產蛋白酶菌株相比,菌株B-2具有較強的耐鹽特性,為縮短魚露發酵時間,提高生產效率提供了一種新的發酵劑。

圖5 菌株B-2在不同鹽條件下生物量Fig.5 Biomass of strain B-2 under different salinity

2.3 培養基成分優化

2.3.1 碳源種類及濃度

圖6-a顯示,以果糖作為碳源時,發酵液中產蛋白酶活力最大值為30.60 U/mL。這與產蛋白酶菌株B.luteusH11[16]的研究結果一致。果糖含量太低導致微生物營養不足,影響生長代謝；果糖含量太高導致滲透壓增大,影響菌株生長和產酶。通過測定果糖含量對菌株產酶的影響發現,當果糖含量為0.5 g/L時的蛋白酶活力最高(圖6-b),達到49.77 U/mL。因此,以0.5 g/L的果糖作為優化培養基的碳源。

2.3.2 氮源種類及濃度

不同種類氮源對菌株B-2產蛋白酶活力的影響如圖6-c所示。當培養基中分別添加蛋白胨、酪蛋白、豆粕等有機氮與硫酸銨等無機氮時,菌株B-2所產蛋白酶的活力存在顯著差異。該菌株對無機氮利用率較差、產蛋白酶活力低,對有機氮利用率較好,產蛋白酶活力普遍較高。當以成本最低的豆粕作為培養基碳源時,蛋白酶的活力最高,達到63.25 U/mL,且發酵液具有獨特的大豆清香味。本研究結果與產蛋白酶的B.subtilisWB600[17]研究結果一致。豆粕中含有多種蛋白質、無機鹽、維生素和促生長因子,與其他氮源相比,營養更豐富,更能促進蛋白酶的生成。通過測定豆粕含量對菌株產酶的影響,發現當豆粕含量為15 g/L時,蛋白酶活力達到97.63 U/mL(圖6-d)。因此,培養基中豆粕的添加量為15 g/L。

2.3.3 NaCl濃度

Na+可以維持細胞滲透壓,是微生物發酵培養基中的必要成分。圖6-e表明當培養基中NaCl為5 g/L時,蛋白酶活力最高,為103.38 U/mL；NaCl為10 g/L時,蛋白酶活力略有下降；NaCl質量濃度超過25 g/L時,測定蛋白酶活力值為仍超過57 U/mL,表明該菌在高鹽條件具有較穩定的產蛋白酶能力。因此,確定菌株B-2產酶優化培養基最適NaCl質量濃度為5 g/L。

a-碳源種類；b-果糖濃度；c-氮源種類；d-豆粕濃度；e-NaCl濃度對蛋白酶活力的影響圖6 培養基成分單因素實驗Fig.6 Single factor experiment of medium compositions

2.3.4 響應面優化培養基成分

根據單因素的實驗結果,以果糖質量濃度(A)、豆粕質量濃度(B)、NaCl質量濃度(C)為響應面實驗的3個因素,以蛋白酶活力(Y)為響應值,采用Box-Behnken法設計的實驗方案[18]和實驗結果如表2所示。

表2 培養基成分響應面設計方案及結果Table 2 Response surface design scheme and results of medium compositions

續表2

果糖、豆粕、NaCl質量濃度與蛋白酶活力之間的關系可以用多元二次回歸方程表示：Y=104.54+2.17A-2.99B+0.44C-0.30AB+1.39AC-0.43BC-7.50A2-6.84B2-14.53C2。培養基中果糖0.57 g/L、豆粕13.88 g/L、NaCl 5.13 g/L時,預測蛋白酶的酶活力最高可達105.04 U/mL。

由表3中方差分析可得,該模型P<0.000 1,失擬項P=0.411 7>0.05,說明該模型可以準確的反映3因素與響應值之間的關系。同時,該模型R2=0.988 6,說明該模型與實驗擬合程度好,利用該方程預測的不同條件下蛋白酶活力實驗誤差小,因此可以用此模型進行分析和預測。根據F值大小,各個因素對菌株產酶的影響順序為：B(豆粕質量濃度)>A(果糖質量濃度)>C(NaCl質量濃度)。利用響應面優化后的培養基進行了3次驗證實驗,蛋白酶酶活平均值為106.41 U/mL,非常接近模型的預測值,表明實驗得到的模型可以用于預測實際值。

表3 培養基成分響應面分析實驗方差分析Table 3 Analysis of variance in the response surface analysis of medium compositions

2.4 發酵條件優化

2.4.1 pH值

pH可以改變培養基成分的離子化程度,影響營養物質的吸收,同時可以調節細胞膜的電負性和滲透性,影響轉運和代謝過程[19]。圖7-a顯示了菌株B-2在pH 6～11蛋白酶活力的變化。在弱酸性環境下(pH=6)產酶較低,可能是因為在弱酸性環境下,各種金屬的溶解度很高,這些金屬很容易穿過細胞膜,造成不良的氧化還原反應,破壞細胞膜,導致細胞死亡[20]。當pH為7～9,蛋白酶活力逐漸增加,因此該菌株產蛋白酶類型為堿性蛋白酶。當pH為9時,蛋白酶活力最高,為157.71 U/mL。當pH超過10,蛋白酶活力迅速下降。研究發現,B.subtilis產蛋白酶活力最適pH普遍在7～9,B.subtilisUMN-26[21]最適pH為7,B.subtilisVe1[22]最適pH為8,而菌株B-2的最適pH與吳海波等[23]的研究結果相似,均在pH為9時有最大酶活力。因此,確定菌株B-2最適pH為9。

2.4.2 溫度

微生物細胞中的糖類、脂質、蛋白質等營養物質都需要在酶的催化作用下分解,而各種酶的催化作用均需要適宜的溫度,因此溫度對微生物代謝過程有重要影響[24]。圖7-b顯示,隨著溫度的升高酶活力逐漸增大,30 ℃時達到峰值,為177.33 U/mL。培養溫度30～40 ℃時,酶活力下降趨勢緩慢,表明該菌對高溫具有較強適應性,即使在50 ℃下培養,蛋白酶活力仍能達到90.02 U/mL。因此,確定菌株B-2最佳發酵溫度為30 ℃。中國傳統魚露通常是在(30±2) ℃的環境下,露天發酵而成。菌株最適溫度和魚露發酵溫度一致,有利于菌株B-2在魚露快速發酵中的應用。

2.4.3 接種量

適宜的接種量可以有效提高發酵速度,在工業應用時,可以有效的節約時間和成本。接種量太小,菌體密度未達到生長要求,造成微生物生長緩慢；接種量太大則會造成菌體密度過大,菌株生長時供氧不足,影響生長,造成產酶下降。由圖7-c可知,當接種量為4%時,酶活力達到最大值190.36 U/mL。研究發現,從大豆發酵食品中分離出的B.subtilisW1[25]最適接種量與本實驗一致,均為4%。因此,確定菌株B-2最佳接種量為4%。

a-pH；b-溫度；c-接種量圖7 發酵條件單因素實驗Fig.7 Single factor experiment of fermentation conditions

2.4.4 響應面優化發酵條件

根據發酵條件單因素實驗結果,以pH(X1)、溫度(X2)、接種量(X3)為響應面實驗的3個因素,以蛋白酶酶活力(Y)為響應值,采用Box-Behnken試驗設計實驗方案和結果如表4所示。pH、溫度、接種量與蛋白酶活力之間的關系可以用如下多元二次回歸方程表示：Y=190.29+15.18A+13.86B+13.41C-14.70AB-1.40AC+9.53BC-21.78A2-53.26B2-7.41C2。當pH為9.4、溫度為28.4 ℃、接種量為4.9%時,預測蛋白酶活力理論得率可達201.88 U/mL。

表4 發酵條件響應面設計方案及結果Table 4 Response surface design scheme and results of fermentation conditions

發酵條件方差分析結果如表5所示,整體模型P=0.007<0.01,失擬項P=0.087 6>0.05,可知該模型回歸極顯著,失擬項不顯著。該模型中的R2=0.988 6說明擬合程度較好,能較好的預測不同條件下蛋白酶活力,因此可以用此模型進行分析和預測。根據F值大小,各個因素對菌株產酶的影響順序為：X1(pH)>X2(溫度)>X3(接種量)。利用經響應面優化后的發酵條件進行了3次驗證實驗,蛋白酶酶活力平均值為200.63 U/mL。與預測值基本一致,表明該模型準確性和實用性較高,能夠較好地預測蛋白酶活力。

表5 發酵條件響應面分析實驗方差分析Table 5 Analysis of variance in the response surface analysis of fermentation conditions

續表5

B.subtilis具有強大的產酶系統,能夠利用葡萄糖、蛋白質等營養物質,在生長過程分泌中性、堿性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等多種胞外酶[26]。同時,B.subtilis作為一種安全性極高的發酵劑,在發酵食品中有諸多應用。PONGSETKUL等[27]從泰國咸蝦醬中篩選到1株產蛋白酶菌株B.subtilisK-C3,在發酵前接種該菌株可以有效提高蝦醬的發酵速率。相比而言,本研究篩選到的B.subtilisB-2具有更高的產蛋白酶活力,通過添加該菌有望提高傳統魚露的發酵效率,而且通過對蛋白酶的分離純化,有望開發出一種適合于魚露發酵生產的專用酶制劑。

3 結果與討論

本文從魚露發酵液中分離到1株耐鹽且產蛋白酶的菌株,經生理生化鑒定和16S rRNA分子生物學鑒定,該細菌為Bacillussubtilis,并命名為BacillussubtilisB-2。利用掃描電子顯微鏡觀察菌株在不同鹽環境下的形態,并分析其生長情況,發現該菌株具有很強的耐鹽性,在200～300 g/L的鹽環境下仍能夠保持生長和代謝,并維持較為完整的細胞結構。優化后的培養基成分為果糖0.57 g/L、豆粕13.88 g/L、NaCl 5.13 g/L,最適發酵條件為pH 9.4、溫度28.4 ℃、接種量4.9%。在此條件下生長的菌株產蛋白酶活力是原來的7.15倍。與其他菌株相比,B.subtilisB-2具有高耐鹽性和產蛋白酶活性,因此該菌株及其產生的蛋白酶有望開發成魚露專用發酵菌劑和酶制劑。