載酶塑料填料的制備與優化

王洪海，尹依，劉星，魏斯文，蘇偉怡，李春利

（1 河北工業大學化工學院，天津 300130；2 化工節能過程集成與資源利用國家地方聯合工程實驗室，天津 300130）

反應精餾（RD）將反應過程與分離技術耦合在一個裝置內，是新型強化工藝技術[1]。在RD 中通常使用強酸或強堿作催化劑，但它們回收困難，而且可能造成嚴重污染[2]。生物酶具有環境友好性，近年來已廣泛用于替代傳統催化劑[3-4]。將酶催化應用到反應精餾中即為酶催化反應精餾（ERD），這一工藝可以高效利用反應精餾的優勢，提升酶催化反應的效率[5]，因此，ERD 具有提高酯化行業技術水平和經濟效益的潛力[6]。

南極假絲酵母脂肪酶B（CaLB）是一種優異的生物催化劑，不僅具有高活性、立體選擇性和操作穩定性[7-8]，而且它的耐熱性較強，失活溫度可達50～60℃，然而，游離態CaLB 存在不穩定、有機溶劑耐受性差、難以回收再利用等缺點[9]，限制了其應用。近年來，研究者使用各種固定化酶的方法如共價結合、包埋、吸附和交聯等[10-11]，以提高酶的穩定性、高效回收率和可重復使用性[12]。溶膠-凝膠包埋法不僅可以增強生物酶的穩定性，而且能夠維持酶結構，因此被廣泛應用于ERD 工藝中[13]。例如，Heils 等[14]首次使用溶膠-凝膠法將酶固定在規整填料上并在RD 柱中催化酯交換反應。因為CaLB 被固定在硅烷前體經過水解、縮聚而成的三維網絡中，所以在催化酯交換反應過程中，外部基質可以自由擴散到硅凝膠的內部發生催化反應，同時轉化產物擴散至凝膠外部[15]。

溶膠-凝膠包埋法在ERD中的應用已經取得很大的進步，但是，對凝膠材料穩定性的研究仍存在一些挑戰，特別是凝膠材料質地較脆，容易發生龜裂現象[16]，這將造成載酶涂層嚴重脫落，從而降低催化劑的循環使用性，增加工藝成本。生物催化劑的性質取決于酶和載體材料，而凝膠配方各組分的相對含量直接影響凝膠基質和酶的性能[17]。凝膠配方中的有機改性硅凝膠（MTMS）可以克服材料的脆性，增強凝膠的韌性，提高涂層的黏附力[18]，而且MTMS是含有機官能團的疏水性硅膠，可以實現酶分子與SiO2網絡之間的特殊鍵合，從而有效保留酶的活性[19]。

塑料填料質地輕、耐腐蝕、不易破裂、加工方便、價格低廉，與金屬填料相比，它更符合綠色化學理念。在新型填料開發和應用的背景下，聚丙烯填料具有優異的物理、化學性能，在中國已經成為使用最廣泛的塑料填料之一[20-21]。在已有的研究中尚未發現使用塑料填料制備負載型催化填料的詳細研究，因此，本文選擇聚丙烯填料進行固定化酶的初步研究。

在這項工作中，首次使用聚丙烯為原料的鮑爾環填料與溶膠-凝膠包埋法結合制備載酶塑料填料。選擇正丁醇（BuOH）與乙酸乙酯（EtAC）在70℃下的酯交換反應作為模型反應[22]。由于原配方[23]（本文作者課題組先前工作中使用的凝膠配方稱為原配方）制備的載酶涂層存在明顯的開裂情況，進而對凝膠配方進行優化以適用于塑料填料。結果表明優化后塑料載酶涂層開裂現象得以改善，通過黏附力表征、循環使用性以及酶學穩定性測試結果得出載酶塑料填料有希望應用于ERD工藝。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑與材料

主要試劑：乙酸乙酯，乙醇，正丁醇，甲醇，乙酸正丁酯，AR，天津市大茂化學試劑廠；甲基三甲氧基硅烷和聚乙二醇400，AR，上海阿拉丁試劑有限公司；正硅酸甲酯，AR，天津希恩思生產科技有限公司；氟化鈉，AR，天津市風船化學試劑科技有限公司。南極假絲酵母脂肪酶B，諾維信公司。聚丙烯鮑爾環，填料直徑、高度分別為16mm、16mm，萍鄉市海川化工有限公司。所有化學藥品均為分析純，無需進一步處理。

1.2 載酶填料的制備

在本文作者課題組先前研究[23]的基礎上優化了溶膠-凝膠的配方且將金屬填料改為聚丙烯填料，基體制備過程如下。①交聯劑的配制：將一定質量比的正硅酸甲酯（TMOS）、甲基三甲氧基硅烷（MTMS）和甲醇（MeOH）混合稱為A 液。②溶劑的配制：將一定質量比的聚乙二醇（PEG400）、氟化鈉、去離子水、CaLB 酶液混合稱為B 液。③因為前體水解過程中會產生大量的熱，為了避免這一過程放出的熱對生物酶造成嚴重損害，所以先將A液和B 液分別在0℃冰水浴中攪拌冷卻1min，再將A液緩慢多次的倒進B液中，混合液繼續在冰水浴中攪拌冷卻約3min。④將商用噴槍以恒定的速度從距離填料15cm 的高度Z 字形噴涂，噴射流量為1.82kg/h，噴射壓力為0.1bar（1bar=0.1MPa），為了防止噴槍的氣流噴除掉剛剛涂覆到填料表面的溶膠溶液，在噴涂過程中使用吹風機輔助干燥。噴涂完成后，將其放置在室溫下干燥至恒定質量，即得到載酶塑料填料，4℃下儲存備用。制備過程如圖1所示。

圖1 載酶填料的制備過程

1.3 表征方法

利用荷蘭Philips公司的XL30-TMP型掃描式電子顯微鏡（SEM）分析配方優化前后填料表面凝膠涂層的形貌及形態。

使用德國布魯克公司的VECTOR22 型傅里葉紅外光譜（FTIR）分析凝膠的化學組成。

用蘭州中科凱華科技開發有限公司的WS-2005 型自動劃痕儀測量涂層的黏附性能。壓頭尖端的半徑為200μm、采用0～50N 的動態載荷加載范圍、加載速度為0.5N/min，劃痕長度為4mm。在聲發射模式下，產生的第一個聲發射信號載荷值即為涂層黏附力數值。涂層的黏附強度用式(1)計算。

式中，F為第一聲發射信號所處載荷值，N；P為涂層的黏附強度，MPa；S為壓頭與涂層的接觸面積，m2。

在深圳新三思計量公司的CMT-6104型材料萬能試驗機上使用10kN 傳感器進行單軸壓縮試驗，加載速度為2mm/min，測量凝膠的機械性能。

載酶填料分別放置于70℃下的間歇反應體釜中，使用電動攪拌器對反應體系進行攪拌，攪拌速率均為400r/min，使反應釜中的載酶填料近似模擬精餾塔中反應段的環境，反應4 次（每次30min）測試載酶填料的循環穩定性。

1.4 酶活力測試

本文使用水解活性的方法測定固定化酶和游離酶的酶活，利用酶催化4-硝基苯基棕櫚酸酯（p-NPP，5.0mg/mL）水解生成對硝基苯酚（p-NP）的原理。水解酶活的定義：在測試條件下，單位時間（1min）內，釋放單位產物p-NP（1μL）所需要的酶量，定義為1U。具體的，在3mL 的磷酸緩沖液（PBS，0.1mol/L，pH7.5）中加入20mg 的固定化酶粉（或200μL 的游離酶），放置于37℃的集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上攪拌5min，隨后在上述緩沖溶液中加入200μL的p-NPP，在室溫條件下使用旋渦混合器將其震蕩30s保證混合均勻，再放回集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中持續反應3min，迅速取出過濾得到上清液，利用紫外分光光度計在410nm 的波長處測量吸光值，根據上清液中p-NP的含量，計算固定化酶（或游離酶）的酶活。

1.5 蛋白固載率的測定

采用考馬斯亮藍[24]測定固定化酶CaLB 的蛋白含量，參考牛血清蛋白（BSA）的標準曲線，分析游離酶和固定化酶的磷酸鹽緩沖洗滌液中脂肪酶的含量，計算固定化之前游離酶的蛋白含量和固定化之后洗滌液中的蛋白含量，兩者的差值即為蛋白固載量。蛋白固載率的計算公式為式(2)。

式中，C0為原酶液的蛋白含量，mg/mL；C1為固定化后洗滌液中的蛋白含量，mg/mL。

1.6 催化效率

正丁醇（BuOH）和乙酸乙酯（EtAC）酯交換反應在間歇反應釜中進行。向四口燒瓶中加入EtAC 和適量的催化劑，將BuOH 放入錐形瓶中，分別加熱至70℃，然后將BuOH 迅速加入燒瓶中。反應在恒溫水浴中進行5h[23]。在此期間，每30min取樣一次，通過氣相色譜（GC）分析評估BuOH的轉化率。（反應條件：酯醇摩爾比為2∶1，催化劑質量為正丁醇的10%。）

1.7 游離酶和固定化酶的酶學性質測試

為了測試優化后配方制備的固定化酶的酶學性能，對其熱穩定性、有機溶劑耐受性、儲存穩定性和可重復利用性進行了測定，與游離酶CaLB 進行比較。將游離酶和固定化酶的初始活性均設定為100%，計算孵育后的酶活性。在每次測試之后，用大量緩沖溶液清洗，再測試另一個環境下的酶活性，每個實驗做3次，以確保結果的可靠性。相對酶活的計算如式(3)。

（1）熱穩定性測試

在70℃、pH 7.5 的PBS（0.1mol/L）緩沖溶液中共孵育8h，每2h 測量并計算殘留的酶活性，用以表征游離CaLB和固定化酶的熱穩定性。

（2）有機溶劑穩定性測試

將含酶量相同的游離酶CaLB 和固定化酶分別放置在乙酸乙酯溶劑中，在室溫下孵育20h研究有機溶劑的耐受性，采用式(3)測試殘留酶活性。

（3）儲存穩定性測試

將游離酶CaLB 和固定化酶在室溫下放置60天，相同時間間隔（每10 天）取出樣品測量并計算相對酶活性，以此來評估游離CaLB 和固定化酶的儲存穩定性。

（4）固定化酶的可重復使用性

為了研究此固定化酶在酯交換反應中的重復使用性，分次反應6 個周期（每次反應2h）。在每個循環結束后，通過抽濾、洗滌和干燥回收催化劑，然后用于新一輪的催化反應。定義固定化酶反應前的初始活力為100%，通過與初始活力比較來計算固定化酶的剩余活性，以此來評定固定化酶催化劑的重復使用性。

2 結果與討論

2.1 溶膠-凝膠配方優化

在實驗初期，多次使用原配方噴涂至塑料填料表面制備載酶塑料填料，發現載酶涂層均存在明顯的開裂現象。這種開裂會降低載酶涂層與填料基體的結合強度，導致涂層嚴重脫落[25]，原因可能是凝膠基質的脆性較大，在曲率較小的塑料填料表面開裂問題被放大，說明原配方不適合應用于塑料基體。為了實現塑料填料固定化酶，提高總體經濟效益，必須改善凝膠開裂問題。因為凝膠配方各組分的相對含量直接影響凝膠基質的性能，所以有必要優化凝膠配方以改善凝膠基質脆性，提高塑料載酶涂層的穩定性。對凝膠配方的主要組分：硅烷前體甲基三甲氧基硅烷與正硅酸甲酯的質量比（MTMS/TMOS）、CaLB、PEG400 和水的加入量進行了研究。

2.1.1 硅烷前體的優化

硅烷前體的比例對包埋酶的活性和凝膠結構有很大影響。考察MTMS 與TMOS 的質量比對固定化酶活性和蛋白固載率的影響，實驗結果如圖2 所示。當MTMS 與TMOS 的質量比增大時，酶活性和固載率的比例先增大后減小，在質量比為3.5∶1時達到最大值。在原凝膠配方中，MTMS 與TMOS 的質量比為3∶1，這說明優化后MTMS 的含量增加。凝膠基質的疏水性取決于疏水性硅烷（MTMS）與親水性硅烷（TMOS）的比例，因此MTMS 的增加可以增強凝膠的疏水性；又因為脂肪酶CaLB 是一種界面活性酶，所以凝膠基質的疏水性有利于維持分子構象并增強酶的活性[26]；此外，TMOS 具有優異的網絡形成能力[27]，若其相對質量過高，在凝膠的干燥過程中可能會由于過度收縮導致涂層破裂和酶活性損失。因此，適當增加MTMS的相對含量可改善材料的脆性且增強酶活性[13]。

圖2 硅烷前體對酶活和蛋白固載率的影響

2.1.2 游離酶添加量的優化

酶的加入量是固定化過程中的關鍵因素，它直接影響固定化酶的“相對活性”[19]。實驗結果如圖3 所示，隨著CaLB 質量分數的增加，酶活提高，加入的酶幾乎被完全包埋，所以蛋白固載率基本不變；然而，當CaLB 的質量分數大于23%時，固定化酶CaLB 的活性幾乎保持不變，而蛋白固載率顯著降低。通常，隨著酶質量分數的增加，相應的結合位點增加，酶與底物的結合效果更好[26]。但是，當酶的質量分數超過一定量時，酶分子不能被完全包埋，容易產生團聚現象，導致酶活性和蛋白固載率下降。因此，選擇CaLB 的最佳質量分數為溶膠總質量的23%。與原配方相比，優化凝膠中包埋的酶數量有所增加。

圖3 游離酶添加量對酶活和蛋白固載率的影響

2.1.3 PEG400添加量的優化

PEG400 具有良好的生物相容性，它可以先于脂肪酶吸附在凝膠材料的表面，減弱凝膠與脂肪酶之間的相互作用，更好地保持酶活性[26,28]；而且適量的PEG400 能調節凝膠的孔結構。當PEG400 含量低時，它對硅烷前體的水解和縮聚過程影響很小，僅起到分散劑的作用，不足以為凝膠制孔。當PEG400 含量較高時，由于聚乙二醇鏈結構在溶膠顆粒表面的包覆作用，溶劑層的厚度增加，因此無法使凝膠形成規則的孔道[28]。

實驗結果如圖4 所示，隨著PEG400 含量的增加，固定化酶活性和蛋白固載率增加；然而，當其質量分數超過1.4%后，酶活性和蛋白固載率均呈下降趨勢。因此，PEG400 的添加量為溶膠總質量的1.4%。適量的PEG400有利于形成均勻的孔隙分布，防止因孔坍塌導致涂層開裂[28]。

圖4 PEG400加入量對酶活和蛋白固載率的影響

2.1.4 水添加量的優化

水的含量是影響凝膠基質結構和包埋效果的另一重要因素。實驗結果如圖5所示，固定化酶的活性和蛋白固載率隨水加入量增加而逐漸增加，當水的質量分數超過12%時，固定化酶CaLB 的活性和蛋白固載率下降。水的加入量較低時，前體不能被完全水解，大量Si—OR 基團的存在使得縮聚形成的Si—O—Si 網絡化程度很低，極易引起凝膠層開裂[19]，此外，水含量過低，在SiO2網絡形成過程中會發生醇縮合，不利于酶的固定化[29]；當水含量過高時，凝膠網絡可以提供更多的微水環境，酶分子傾向于停留在水相中，這可能導致凝膠化過程的延長[19]，降低酶活性和蛋白固載率。因此，水的加入量被確定為溶膠總質量的12%。

圖5 水的量對酶活和蛋白固載率的影響

2.2 優化后硅凝膠的性能

使用優化后的溶膠-凝膠配方，制備載酶塑料填料，并對其性能進行表征。

2.2.1 SEM分析

使用優化后的配方制備了載酶填料，通過SEM 圖可以觀察到填料表面凝膠涂層的形態。從圖6(a)可以看出，原配方制備的載酶涂層存在多處裂紋，而圖6(b)表明優化后涂層幾乎沒有明顯的裂紋，說明配方優化改善了凝膠的脆性開裂問題。證明優化配方適用于塑料填料固定化酶。

圖6 塑料填料載酶涂層的SEM圖

2.2.2 紅外光譜分析

FTIR被廣泛應用于分析樣品中官能團的變化。圖7為優化前后凝膠粉末的紅外光譜圖，新配方沒有添加或去除任何組分，因此官能團數量沒有變化，僅峰面積發生變化。在波長1645cm-1和3412cm-1處對應CaLB的—NH2伸縮振動峰，兩處峰面積均變大表明凝膠網絡中包埋的酶量增加[30]。波長1411cm-1處的峰歸因于Si—CH3的拉伸振動，Si—CH3是MTMS 的獨特官能團，其峰變大，說明凝膠中MTMS相對含量增加。此外，硅烷前體的水解程度可以通過Si—O—C 的拉伸振動來評估，該拉伸振動對應于1039cm-1的譜帶[31]，其峰面積變小，意味著硅烷前體的水解程度增加。從峰面積的變化可以看出，配方中各組分相對含量的變化對硅烷前體的水解、縮聚過程起促進作用。

圖7 配方優化前后凝膠粉末的紅外光譜圖

2.2.3 凝膠材料抗壓性

使用材料測試機對配方優化前后制備的干凝膠的機械性能進行測試[31]。通常，較低的機械強度會導致凝膠涂層開裂[32]。測試結果如圖8所示，當干凝膠經壓縮時，應力-應變曲線以階梯式上升，在達到峰值后快速下降，此特征表明凝膠基質是脆性材料，破壞模式為脆性斷裂[31,33]。在壓縮過程中，當應力達到5.79MPa時，原配方凝膠上出現明顯的斷裂現象，優化后的凝膠僅出現少量微裂紋。結果表明配方優化改善了凝膠材料的脆性，提高了凝膠的韌性[34]。

圖8 兩配方制備干凝膠的應力應變曲線

2.2.4 黏附強度

黏附強度是評估涂層性能的重要依據[35]。在聲發射模式中，涂層的黏附強度由劃痕斷裂產生的第一聲發射信號的載荷值表示。抗劃痕實驗結果如圖9所示，原配方制備的載酶涂層在載荷值5.3N時開始被破壞，由式(1)計算可得，原配方涂層附著力為42.198MPa， 而優化配方涂層附著力為48.169MPa。表明脆性問題的改善可以提高涂層與基體的黏附強度[34]，使載酶涂層與填料的附著力提高了14.2%。優化配方制備的載酶填料與本文作者課題組先前使用的金屬載酶填料的黏附強度值相近[36]。因為金屬載酶填料已成功進行精餾實驗[23]，所以塑料填料制備的載酶涂層有希望應用于ERD工藝。

圖9 配方優化前后載酶涂層的黏附強度

2.2.5 循環穩定性

載酶填料的循環穩定性不僅是評估催化劑工業應用潛力的重要特征之一，而且決定精餾工藝的經濟成本。為了進一步表征載酶填料的穩定性，將優化前后兩配方制備的載酶填料在反應釜中攪拌反應，測試各循環反應后的涂層損失率。載酶涂層從塑料填料上脫落的質量分數如圖10所示，在反應4次后，優化配方載酶填料的質量損失為18.66%，而原配方載酶涂層的損失為26.35%。可以看出改善凝膠開裂問題后，涂層與基體黏附強度提高，涂層脫落率降低，有利于提高精餾工藝的經濟效益。

圖10 兩配方制備的載酶填料的循環穩定性

2.2.6 催化效率

通過酶活性測試，得到游離CaLB 的酶活性為(510±17)U/g，原配方制備的固定化酶活性為(484±12)U/g，優化后的酶活性為(496±11)U/g，可能是因為優化后被包埋酶的含量增加，酶活有一定提高。比較了兩配方制備的催化劑在間歇反應釜中酯交換反應的催化效率，結果如圖11 所示，雖然最終的平衡轉化率基本一致，但是原配方催化的反應在240min 達到平衡，優化后反應在210min 平衡。因此，使用優化配方制備的固定化酶催化劑具有更好的催化效果和酶活力。

圖11 配方優化前后的催化效率對比

通過上述分析可以得出，配方優化不僅提高了凝膠機械強度，改善了凝膠涂層開裂，減少了涂層的質量損失，而且提高酶的活力和催化性能。接下來探討優化配方制備的固定化酶的酶學穩定性。

2.3 游離酶和固定化酶的酶學性質

生物酶催化劑的穩定性在工業應用中至關重要。當固定化酶具備優異的穩定性和長效性時才能實現在工業上的大規模應用[37]。在本研究中，采用熱穩定性、有機溶劑穩定性、儲存穩定性和循環穩定性來評估配方優化后酶的固定化效果。

2.3.1 熱穩定性

良好的熱穩定性是工業應用的關鍵。游離酶和固定化酶的熱穩定性如圖12 所示，將初始酶活設為100%，在70℃、PBS 緩沖溶液中，隨著孵育時間的延長，固定化酶的相對酶活高于游離酶CaLB。孵育8h后，游離酶的相對酶活僅為8%，而固定化酶的相對酶活高達77%，表現出優異的耐熱性。通常，在高溫下游離脂肪酶的蛋白結構易被破壞[38]，酶在凝膠中的原位包埋有效阻止酶的二級結構變化，從而保護酶的蛋白質結構，降低其變性程度，因此，固定化酶具有較高的熱穩定性。

圖12 游離酶和固定化酶在70℃環境下的熱穩定性

2.3.2 有機溶劑穩定性

將游離酶CaLB 和固定化酶浸泡在乙酸乙酯溶劑中，測定其有機溶劑耐受性。結果如圖13所示，隨時間延長相對酶活均降低，孵育20h后游離酶的相對酶活為51%，但固定化酶的相對酶活仍能維持在83%。這是因為包埋后凝膠三維網絡結構對CaLB 起了一定的保護作用，提高了酶的剛性并阻止了酶在惡劣條件下的構象變化[39]，有機溶劑穩定性明顯提高。

圖13 游離酶和固定化酶的有機溶劑耐受性

2.3.3 儲存穩定性

儲存穩定性是固定化酶在工業應用中的關鍵因素之一。將固定化酶和游離酶在室溫下放置一段時間，評定其儲存穩定性，初始酶活定義為100%。實驗結果如圖14所示，固定化酶在儲存60天后仍保持86%的相對活性，游離酶表現出更快的分解速度，相對酶活僅為53%，活性降低的原因主要有兩方面：①隨著時間延長，酶活性的自然喪失；②酶溶液可作為微生物的營養來源而被分解，因此，在儲存過程可能會發生自溶[40]。凝膠載體可以為酶提供適宜生存的孔結構，不僅可以防止蛋白分子構象轉變，還會阻止環境中的微生物與酶蛋白接觸[39]。因此，固定化酶具有優異的長期儲存穩定性。

圖14 游離酶和固定化酶的儲存穩定性

2.3.4 重復使用性

以乙酸乙酯和正丁醇為底物測試各循環反應的相對活性，研究固定化酶的可重復利用性。實驗結果如圖15 所示，隨著反應次數的增加，相對酶活逐漸降低，在循環反應6次后，固定化酶的相對活性為67%，且活性趨于穩定。表明此固定化酶具有較強的可重復使用性，為其在酶催化的工業應用中降低成本。

圖15 固定化酶的重復使用性

3 結論

（1）本文首次使用塑料填料固定化酶，發現了凝膠載酶涂層的開裂現象。

（2）對凝膠配方進行優化，優化結果如下：硅烷前體（MTMS∶TMOS）的質量比為3.5∶1；酶、PEG400、水的質量分數分別為23%、1.4%、12%。

（3）通過優化配方，改善了凝膠材料的脆性和涂層與填料之間的黏合強度，降低了涂層損失率，說明此配方制備的載酶塑料填料穩定性較優異，符合綠色可持續發展理念。證實了塑料填料固定化酶的可行性，為進一步在ERD 中應用奠定了基礎。

（4）測定了優化配方制備的催化劑的酶學穩定性，結果表明此固定化酶具有優異的熱穩定性、有機溶劑耐受性、儲存穩定性及可重復利用性。