3種烏龜尿液揮發性成分GC-MS分析及抑菌活性研究

李娉 龔志強 梁天堅 蒙田秀 霍宇 陳國香

1廣東省婦幼保健院藥學部，廣州 510010；2廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，南寧 530222

龜隸屬動物界、脊索動物門、爬行綱、龜鱉目［1］，目前世界上已知龜類動物 240 余種［2］，我國分布有 31 種，隸屬 5 個科 18 屬，其中淡水龜類 23 種，陸龜類 3 種［3-4］。龜類具有很高的藥用價值，其龜板、肉、膽、血、尿等都可入藥，龜板在《本草綱目》介部中介紹其性味咸、甘、平，主漏下赤白、五痔陰蝕、濕痹四肢重等，古文記載“龜尿走竅透骨，故能治暗、聾及龜背，染鬢發也”“小兒龜背以龜尿摩其胸背，久久即瘥”“中風不語烏龜尿點少許于舌下，神妙”“須發早白以龜尿調水蛭細末，日日撚之，自黑，末忌粗”［5-6］。對龜尿的收集也有詳細的記載，“按孫光憲北夢瑣言云：龜性鮅而與蛇交。惟取龜置瓦盆中，以鑒照之。龜見其影。則淫發失尿。急以物收取之。又法：以紙柱，以點其尻，亦致失尿，但差緩耳”，“今人惟以豬鬢或松葉刺其鼻，即尿出”［6］。烏龜在生活繁殖過程中往往伴隨著多種致病菌的感染，現代藥理表明龜尿具有顯著的抑菌作用，抑菌活性物質主要為尿酸及三甲氧芐二氨基嘧啶［7-9］。文獻記載龜尿的給藥途徑為舌下或透皮吸收，通過脂溶性成分滲透皮膚進入毛細血管而發揮藥效，國內外對龜尿揮發性化學成分的研究未見報道，本文于2019 年采用GC-MS 法分析同一環境飼養的3 種龜尿液揮發性成分組成及差異，并通過抑菌環法、懸液定量法［10-11］開展3 種龜尿液揮發性成分對金黃色葡萄球菌等常見菌的抑菌能力試驗，為龜尿的研究提供試驗依據。

1 儀器與材料

Aglient7890A-5975C 氣相色譜質譜聯用儀（GC/MS，美國Agilent公司）；N-1300D-WB 旋轉蒸發器（日本EYELA 公司）；3510E-DTH 超聲波清洗儀（美國BRANSON 公司），LG16-W 臺式高速離心機（北京京立），各菌種菌株號分別為大腸桿菌（ATCC25922），金黃色葡萄球菌（ATCC25923），傷寒沙門氏菌［CMCC（B）14028］，綠膿桿菌（ATCC9027），由廣西中醫藥大學微生物教研室提供，其余試劑均為國產分析純。

3種烏龜均同一環境飼養數年，經廣西中醫藥大學梁天堅教授鑒定分別為黃喉擬水龜（Mauremys mutica，母，淡水龜，體質量 1.7 kg，年齡為 12 歲），凹甲陸龜（Manouria impressa，母，陸龜，體質量0.7 kg，年齡為12歲），三線閉殼龜（Cuora trifasciata，母，淡水龜，體質量2.3 kg，年齡為12歲）。

2 方法與結果

2.1 烏龜尿液揮發性成分樣品的制備 采用古法“今人惟以豬鬢或松葉刺其鼻，即尿出”［6］，取豬鬢毛刺掃龜鼻，連續收集早、中、晚3 次新鮮尿液，充分混合，冷藏。取龜尿50 ml 至錐形瓶中，加入 100 ml 無水乙醚，超聲（100 Hz，40 W）萃取3 次，靜置，合并上層乙醚液，濃縮后得淡黃色臭味油狀提取物，高速離心10 min（10 000/min），取上清液用無水硫酸鈉干燥備用。

2.2 氣相色譜質譜分析條件 進樣口溫度230 ℃，進樣量 5 μl，隔墊吹掃 3.0 ml·min-1，不分流，載氣高純 He，恒流 1.5 ml·min-1，程序升溫：柱溫60 ℃，以30 ℃·min-1程序升溫至180 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1，程序升溫至250 ℃，保持4 min，EI 離子源，能量70 eV，離子源溫度230 ℃，倍增電壓1.933 kV，掃描質量范圍m/z為33～800。

2.3 抑菌環法測定抑菌活性 參考文獻，取經過滅菌的培養皿，緩慢倒入冷卻至45 ℃的培養基，攤布均勻，放置超凈工作臺使之凝固，制備培養基備用。將經過活化的4 種菌種用接種環轉移至滅菌水中稀釋5 個濃度梯度，吸取試驗菌液10 μl加入至培養基層，用涂布器均勻涂抹接種菌種。采用打孔機將定性濾紙制成直徑6 mm 的圓片。將已滅菌的紙片和藥液（對照組用10 mg·ml-1的水楊酸，空白樣品用無菌水+二甲基亞砜），置于無菌操作臺上，將濃縮好的藥液傾倒于無菌的培養皿中，用滅菌的鑷子取出紙片放置于藥液中，浸泡24 h，備用。采用十字交叉法，用游標卡尺測定抑菌圈直徑，每個實驗平行3 次，取其平均值作為測定結果，如抑菌環小于7 mm，則判為無抑菌作用。實驗結果表明3 種烏龜尿液揮發性提取物對4 種常見致病菌的生長均有一定程度的抑制作用，其中黃喉擬水龜對金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌抑菌效果最好，最大抑菌圈直徑分別為14.2、11.4 mm，平均抑菌圈直徑為分別13.9、11.1 mm，而三線閉殼龜尿液揮發性成分對大腸桿菌抑菌效果較明顯，最大抑菌圈直徑為14.4 mm，平均抑菌圈直徑為14.2 mm，凹甲陸龜尿液揮發性成分之表現對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑制作用，3種烏龜尿液揮發性成分對供試菌種的抑菌作用見表1。

表1 3種烏龜尿液揮發性成分、水楊酸與空白對照組對供試菌種的抑菌作用（n=3，d/mm，）

表1 3種烏龜尿液揮發性成分、水楊酸與空白對照組對供試菌種的抑菌作用（n=3，d/mm，）

注：“-”表示無菌

組別黃喉擬水龜三線閉殼龜凹甲陸龜水楊酸空白對照組綠膿桿菌10.00±0.18 10.30±0.21-11.20±0.18-金黃色葡萄球菌13.90±0.32 10.90±0.26 8.90±0.19 12.60±0.24-傷寒沙門氏菌11.10±0.28 9.98±0.17-11.80±0.31-大腸桿菌12.80±0.22 14.20±0.23 9.20±0.15 14.00±0.17-

2.4 最小抑菌濃度（MIC）測定 MH（B）營養肉湯分裝后于121 ℃高壓滅菌15 min，試驗菌懸液用無菌水稀釋，以比濁管調整菌液濃度為1×106cfu·ml-1。分別將上述3 種烏龜尿揮發性成分用二甲基亞砜稀釋成6 個濃度（10%、25%、40%、60%、75%、100%），參照美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）標準采用微量稀釋法進行。用微量移液器吸取試驗菌液0.1 ml 加入到含樣品5.0 ml 的試管中，需要迅速混勻，并立即計時。分別加入各菌液10 μl 與供試液混合液0.1 ml，加入含5.0 ml 經滅菌的無菌水試管中，充分混勻，然后放置10 min。用微量移液器吸取各濃度供試液接種于滅菌平皿，用15 ml 的營養瓊脂培養基（45 ℃）作傾注，緩慢轉動平皿，使其充分均勻，待瓊脂凝固后翻轉平皿，30 ℃濕盒孵育，48 h 后觀察結果，做活菌菌落計數，結果判斷的前提是生長對照良好，空白對照無菌生長清晰。3種烏龜尿液揮發性成分對4 種常見供試菌的MIC 見表2。試驗結果表明，3 種烏龜尿液揮發性成分對4 種常見供試菌均表現出一定的生長抑制作用，但抑制作用差異較大。

表2 3種烏龜尿液揮發性成分對供試菌的最低抑菌濃度（ml/ml）

2.5 揮發性成分鑒定 按上述實驗條件，用氣相色譜質譜聯用法對烏龜尿液揮發性成分進行定性定量分析，采用安捷倫GC-MS 化學工作站數據處理系統，以峰面積歸一法測得揮發性物質各組分相對含量，3種烏龜尿液中提取的揮發性成分揮發油總離子流圖見圖1。對總離子流圖中各峰經質譜數據庫（NIST08.L，要求相似度90%以上），及配合人工譜圖解析，并查對有關數據文獻，從基峰相對豐度等幾個方面進行直觀比較，鑒定3 種烏龜尿液中提取的揮發性成分化學組分，見表3。

圖1 3種烏龜尿液揮發性部位總離子流圖（A為黃喉擬水龜，B為凹甲陸龜，C為三線閉殼龜）

表3 3種烏龜尿液揮發性化學成分分析

續表

3 討論

實驗結果表明，黃喉擬水龜尿液中分離鑒定34 個化學成分，占總揮發性成分的89.4%，主要為脂肪酸（13.65%）、脂類（39.16%）和不飽和烴類物質（7.21%）；三線閉殼龜尿液中分離鑒定25 個化學成分，占總揮發性成分的76.24%，主要為動物油脂類（42.68%）及其脂（28.78%）和少量不飽和烴類物質，凹甲陸龜尿液共分離鑒定37 個化合物，占總揮發性成分的88.37%，主要為脂肪烴及不飽和烴類物質（39.07%）及動物油脂類（41.64%）；與文獻報道的龜板提取液中脂肪酸類成分報道較為相似［12］。

3 種龜尿液揮發性共有成分為17 種，主要為脂肪酸和飽和脂肪烴類化合物，其中凹甲陸龜和三線閉殼龜尿液中含量最高均為油酸酰胺，分別為20.32%和30.57%，為動物油脂中常見成分，油酸酰胺能誘導動物生理性睡眠，具有大麻擬似物作用，抑制淋巴細胞增殖［13-15］，可能與烏龜的生理性冬眠有關。而黃喉擬水龜尿液中含量最高的為苯二甲酸-1-丁酯-2-異丁酯（14.66%），是工業常用的增塑劑材料，作為全球性的有機環境污染物，3 種烏龜在同一生長環境飼養近10 年，黃喉擬水龜和凹甲陸龜中檢出的鄰苯二甲酸酯有機污染物是否為其內源性物質，或是源自環境，有待證實，同時3 種龜尿液中均檢出大量的不飽和脂肪烴類化合物，可能和攝取的食物及自身二次代謝產物隨尿液排出體外有關。

3 種烏龜尿液揮發性成分中均檢出具有抑菌活性的三甲氧芐二氨基嘧啶［9，16］，淡水龜黃喉擬水龜和三線閉殼龜尿液中三甲氧芐二氨基嘧啶含量分別為2.15%、1.17%，含量遠高于凹甲陸龜。三甲氧芐二氨基嘧啶具有競爭性與二氫葉酸還原酶結合抑制二氫葉酸還原酶的活性，具有較好的抑菌活性。該成分含量與龜尿抗菌活性實驗結果正性相關，表明三甲氧芐二氨基嘧啶是龜尿液抑菌作用的主要活性成分之一。

黃喉擬水龜和三線閉殼龜尿液中分離鑒定的蒙旦醇（二十八醇）也稱普利醇、高粱醇，是一種天然存在的高級醇，主要存在于蔗蠟、糠蠟、小麥胚芽油、蜂蠟等天然產物中，具有廣泛的生理活性，包括抗疲勞、降血脂、增強性功能的功效，可用于治療老年初期帕金森氏病及生殖障礙疾病，現已開發多種蒙旦醇健康食品和保健飲料［17-19］。凹甲陸龜尿液中未檢出該成分，其含有的棕櫚酸和鹵代不飽和烴都具有一定毒性［20-21］，能引起神經損害，肺水腫、肺充血等癥，故《本草綱目》記載烏龜以淡水龜入藥，而陸龜常稱為“秦龜，方藥稀用，不入補腎藥”，其中蒙旦醇是否為龜尿藥用的主要活性成分，有待進一步藥理實驗驗證。

4 結論

現代藥理實驗表明烏龜尿液具有顯著的抑菌活性，而不同種烏龜尿液的抑菌作用及對不同菌種的抑菌活性等相關性研究未見報道，實驗考察了3 種龜尿揮發性成分對常見4 種致病菌的抑菌活性，結果表明淡水龜黃喉擬水龜和三線閉殼龜尿液揮發性成分對4 種供試菌均有不同程度的抑制作用，其抑菌活性明顯強于凹甲陸龜，其抑菌作用的強弱可能與尿液中含有的三甲氧芐二氨基嘧啶含量有關。

本實驗通過對兩種淡水烏龜和一種陸龜的尿液揮發性化學成分進行比較研究，對鑒定的化學組成中活性物質進行了比較探討，但對文獻記載的淡水龜入藥，陸龜不入藥的結論仍需進一步藥理實驗依據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。