Raptor對髓系細胞破骨分化與骨吸收的抑制作用

賴玲林 李素娟 胡楚璇 陳燕 陳力 何娟 盧慧勤

1廣東省第二人民醫院臨床研究部，廣州 510317；2廣東省第二人民醫院藥學部，廣州 510317

骨質疏松癥是以低骨密度及骨組織微構造退變為特性的一種全身性代謝骨病，伴有骨脆性增加，容易發生骨折，是當前世界上絕經后婦女、中老年人中發病率、病死率及保健費用損耗較大的疾病之一［1］。同時骨質疏松對許多疾病的發病率和病死率影響巨大，隨著社會老年化的進程，重視骨質疏松癥的發生發展是臨床的研究熱點。骨質疏松的發病機制主要是機體破骨細胞功能得到加強，作為骨組織成分的一種，破骨細胞功能增強會導致骨形成及骨吸收失偶聯，使骨質量降低與骨量減少，最終導致骨質疏松癥的發生［2］。現有的治療藥物雙磷酸鹽、雌激素及其受體調節劑、降鈣素等由于其不可避免的不良反應，使用風險很大［3］。因此尋找新的治療方案成為了骨質疏松臨床治療的研究熱點。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相 關 調 節 蛋 白（regulatory associated protein of mTOR，Raptor）是絲氨酸/蘇氨酸激酶功能性復合物mTORC1的重要組分，在細胞生長、細胞周期、細胞分化、自噬和氨基酸攝取中都能發揮關鍵作用［4］。近期一項研究表明，mTORC1能夠刺激Paget病患者的破骨細胞形成［5］，但Raptor 是否在其中發揮作用尚未得知。于2020 年1 月至2021 年6 月本研究通過體外實驗來探討Raptor 對小鼠髓系細胞破骨分化與骨吸收的影響及其作用機制，以期為臨床治療骨質疏松提供新的思路與證據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 髓系細胞提取試劑盒購自中國上海晶抗生物工程有限公司；SYBR Green 染料購自中國北京索萊寶科技有限公司；PCR 引物由中國上海生工生物工程股份有限公司合成；破骨分化相關基因轉錄因子（spi-1 proto-oncogene，PU.1）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、Fos 蛋白（c-Fos）以及β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自美國ThermoFisher Scientific 公司；ELISA 試劑盒購自中國上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 健康雄性6～8 周齡清潔級B6/C57 小鼠10 只購自北京大學醫學部［生產許可證為SCXK（京）2018-0010］，采用標準飼料與飲用水喂養，飼養溫度保持在（25±2）℃，相對濕度保持在（40±2）%。對動物房進行定期消毒和通風，總共進行適應性飼養7 d后進行實驗。敲除組通過基因敲除構建髓系細胞特異性敲除Raptor小鼠模型。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 兩組小鼠正常飼養14 d 后處死，并收集血清以及通過試劑盒分離髓系細胞，在含有10%小牛血清的培養皿中培育一段時間后通過100 μg/L 的sRANKL誘導形成破骨細胞。

1.3.2 免疫印跡試驗（Western blot） 將收集到的處理后細胞懸液在離心半徑10 cm 的條件下，以1 200 r/min離心5 min 后，棄去上清液，然后加入RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制劑提取總蛋白，提取出的蛋白放入10 ml EP 管中，然后向其中加入5 倍體積的十二烷基磺酸鈉，混勻后放入95～100 ℃沸水中水煮變性，冷卻后放入-20 ℃備用。每次向準備好的電泳配件中加入10 μl 蛋白，設置電泳條件為80 V 恒壓，30 min，結束后改變電泳條件為120 V 恒壓，50～60 min。當所需的蛋白分子量所在區域有一定分離度時可提前停止電泳。之后進行轉模，條件為200 mA 恒流，按分子量確定時間。轉膜后分別孵育破骨分化相關基因PU.1、CTSK、c-Fos 抗體與相對應的辣根過氧化物酶標記的二抗，最后將含有蛋白標記的膜洗凈，涂上化學發光顯影液通過顯影儀拍照，對結果用ImageJ 軟件對灰度值進行系統性分析。

1.3.3 反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR） 將將收集到的處理后細胞懸液在離心半徑10 cm的條件下，以1 200 r/min離心5 min 后，棄去上清液，向沉淀中加入適量TRIzol 試劑，在冰上孵育5～10 min后加入預冷過的氯仿0.2 ml。繼續冰上孵育5 min 后1 200 r/min 離心15 min，轉移水相，加入等體積異丙醇后再次離心10 min，棄上清液。加預冷75%乙醇溶液洗滌，棄上清后風干，加入40～200 μl的無酶水溶解制得RNA 備用。通過制備的RNA 反轉錄成cDNA，然后加入SYBR Green 染料與正反向引物混合離心（引物序列見表1），隨后于PCR儀上進行擴增，循環完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值（Ct 值）進行相對定量分析，比較2 組細胞中JAK3的mRNA 表達水平。

表1 破骨分化相關基因引物序列

1.3.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 取出部分小鼠血清，在離心半徑10 cm 的條件下，以1 200 r/min離心5 min后轉移上清液至干凈的EP 管，按照ELISA 試劑盒步驟對樣本骨吸收代謝產物I 型膠原C 端肽（C-telopeptide of type I，CTXI）、I 型膠原 N 端肽（N-telopeptide of type I，NTX1）及尿羥脯氨酸（U-Hydroxyproline，U-HYP）進行標記，通過酶標儀測量450 nm 處的吸光度，并以標準曲線來計算其中U-CTXI與U-NTXI含量。

1.4 統計學處理 所有結果取得數據都是基于3次及以上重復實驗獲得，且計量資料符合正態分布，并以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。數據分析所使用的軟件為SPSS 22.0 版本，當P＜0.05 時為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Western blot檢測2組細胞PU.1、CTSK、c-Fos的蛋白表達情況 采用Western blot技術檢測2組破骨分化相關基因蛋白表達水平的變化，結果如圖1 所示，與對照組相比，敲除Raptor 后敲除組小鼠髓系細胞中破骨分化相關基因PU.1、CTSK、TRAP 的蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05）。

圖1 2 組小鼠細胞中破骨分化相關基因的蛋白水平（重復3次）

2.2 RT-PCR 檢測 2 組細胞中 PU.1、的 mRNA 表達情況 采用RT-PCR 技術敲除破骨分化相關基因mRNA 表達水平的變化，結果如圖2所示，與對照組相比，敲除Raptor后敲除組小鼠髓系細胞中破骨分化相關基因PU.1、CTSK、TRAP 的mRNA 表達量顯著降低，與蛋白趨勢較為一致（均P＜0.05）。

圖2 2組小鼠細胞中PU.1、CTSK、c-Fos的mRNA水平（重復3次）

2.3 ELISA 檢測2 組細胞中骨吸收指標的表達情況ELISA 結果顯示，與對照組相比，Raptor 敲除小鼠血清CTXI、NTX1及U-HYP表達量顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），具體見表2。

表2 2組小鼠細胞中骨吸收代指標CTXI、NTX1及U-HYP的表達情況（）

表2 2組小鼠細胞中骨吸收代指標CTXI、NTX1及U-HYP的表達情況（）

注：敲除組為通過基因敲除構建髓系細胞特異性敲除Raptor小鼠模型，對照組為正常B6/C57 小鼠；CTXI 為I 型膠原C 端肽，NTX1為I型膠原N端肽，U-HYP為尿羥脯氨酸

U-HYP（μg/L）20.51±2.85 14.49±1.84 3.968 0.004組別對照組敲除組t值P值n 5 5 CTXI（pg/ml）185.53±36.69 124.58±25.77 3.040 0.016 NTX1（μg/L）2.89±0.37 2.21±0.42 2.717 0.026

3 討 論

骨質疏松癥一直是臨床治療的難點問題，其發病機制主要與破骨細胞的增殖分化有關。破骨細胞是一類來源于髓系前體細胞，其分化主要經歷了幾個重要的分化階段：造血干細胞分化成髓系前體；髓系前體形成破骨細胞前體；破骨細胞前體再分化形成單個核的破骨細胞；多個單個核的破骨細胞融合形成多個核的成熟的破骨細胞［6］。在健康人體內其骨組織中具有骨吸收功能的破骨細胞與具有骨形成功能的成骨細胞保持著平衡，一旦出現紊亂則會造成不良影響，如破骨細胞分化水平增加會導致骨吸收功能增強，從而導致骨質疏松的發生［7］。目前臨床治療藥物均有較大的風險與不良反應，近年來靶向治療已成為臨床研究的熱點，以抑制破骨細胞分化形成和骨吸收功能為靶點已經成為目前治療破骨細胞相關骨代謝疾病的主要策略。

破骨細胞是在骨組織的微環境下產生的，為了在體外獲得穩定的破骨細胞，我們通過給予破骨細胞分化因子RANKL 誘導前體細胞破骨分化［8］。Raptor 作為 mTOR 調節蛋白，能夠與mTOR 形成關鍵復合物mTORC1，在細胞的生長發育過程中發揮著重要作用。在本研究中，我們通過敲除小鼠Raptor 基因取得樣本并進行一系列實驗。PU.1、CTSK、c-Fos 是參與破骨細胞分化成熟的關鍵基因，其中PU.1 主要參與調控破骨細胞早期分化［9］，介導了前體細胞向破骨細胞前體分化的形成和存活；CTSK 能夠阻止多個單核破骨細胞融合成成熟的破骨細胞；c-Fos是JNK和ERK信號通路調節破骨細胞形成的重要參與者，參與了調節破骨細胞相關的特異性蛋白的表達，能夠通過促使單核細胞更多地向巨噬細胞分化來阻滯破骨細胞定向分化［10］。在本研究中，Western blot 與 RT-PCR 實驗結果顯示，2 組細胞中成骨細胞分化相關基因PU.1、CTSK、c-Fos 的蛋白及mRNA 表達水平差異均有統計學意義，敲除Raptor基因后細胞PU.1、CTSK、c-Fos 的蛋白及mRNA 較對照組顯著降低，提示Raptor基因與破骨細胞的分化具有緊密聯系，Raptor在前體細胞分化成成熟的破骨細胞全過程中發揮著關鍵作用。CTXI、NTX1及U-HYP在之前的研究中與骨密度呈負相關，能夠直觀地體現骨吸收情況［11］，在多項研究中骨質疏松患者體內CTXI、NTX1 及U-HYP 水平均顯著高于健康對象者。在本研究中，ELISA 實驗結果顯示，敲除組血清CTXI、NTX1 及U-HYP 水平較對照組顯著降低，提示敲除Raptor基因其骨吸收功能受到了明顯抑制，這可能與敲除Raptor抑制了破骨細胞分化進程，從而降低了骨吸收功能有關。

綜上所述，本研究通過對實驗小鼠進行Raptor 基因敲除，并將提取的前體髓系細胞通過RANKL 進行誘導破骨分化并與未敲除Raptor 的樣本進行對比，發現敲除Raptor 能夠顯著抑制成骨細胞分化相關基因PU.1、CTSK、c-Fos 的蛋白及mRNA 表達水平，降低骨吸收指標CTXI、NTX1 及U-HYP 的表達水平，從而發揮抑制破骨細胞分化的進程。本研究為臨床治療骨質疏松癥及其他破骨細胞相關骨代謝疾病提供了新的思路與研究證據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。