35例COVID-19患者外周血白細胞及T淋巴細胞亞群的動態變化

郝建志 曹舉潮 黃曉青 李曉鋒 黃馨 王燕 黎國威 江奕恒 黎程

1廣東省第二人民醫院急診科，廣州 510317；2廣東省第二人民醫院廣東省傳統醫學與運動康復研究所，廣州 510317；3廣東省第二人民醫院普外二科，廣州 510317；4廣東省第二人民醫院臨床流行病與方法學中心，廣州 510317；5廣東省第二人民醫院呼吸內科，廣州 510317

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是一種新發現的病原體，它具有冠狀病毒家族的典型特征，屬于冠狀病毒科、β 冠狀病毒屬，它同嚴重急性呼吸綜合征（SARS）基因組序列的相似度高達80%。目前，SARS-CoV-2 的致病機制仍不清楚，但近期發表的文獻表明它的發病過程伴隨著淋巴細胞的減少，并且推測它的加重過程和細胞因子風暴有一定的關系［1-2］。T細胞亞群在機體細胞免疫過程是起著非常關鍵作用的一類免疫細胞亞群，它的數量和比例是衡量機體免疫水平的重要指標［3］。我們在臨床治療過程中，觀察到在所有新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）患者中，淋巴細胞及T 淋巴細胞亞群均有不同程度的下降。為了探討COVID-19 病程與淋巴細胞及T 淋巴細胞亞群之間的關系，本文回顧性分析了廣東省第二人民醫院收治的35 例COVID-19 患者外周血白細胞、淋巴細胞、T 淋巴細胞亞群的動態變化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象及臨床資料采集 2020 年1 月至2 月廣東省第二人民醫院收治的35例COVID-19患者。所有患者入院后，除常規詢問病史以及流行病學史外，均檢測血尿便常規、肝腎功能、心肌酶譜、電解質、T淋巴細胞亞群等，必要時查動脈血氣分析；常規行胸片檢查，必要時行多次胸片檢查或胸部CT 檢查；根據治療情況定期復查以上項目，并行咽拭子、肛拭子以檢測SARS-CoV-2轉陰情況。

1.1.2 診斷標準、臨床病情分型及出院判斷標準 所有患者經咽拭子檢測SARS-CoV-2 均為陽性。診斷標準、臨床病情分型以及出院判斷標準均依據中華人民共和國衛健委頒布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》（試行第5版）［4］執行。

1.2 檢測方法

1.2.1 檢測結果收集 收集所有患者入院后在第1、3、5、7、10、15、20 天的血常規檢測結果；收集所有患者在病程第 1、2、3、4 周的 T 淋巴細胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+T 細胞計數檢測結果，并計算CD4+/CD8+比值；其中發病第1～7、8～14、15～20、21～28天分別計入第1、2、3、4周。

1.2.2 外周血血常規檢測 用EDTA-K2 抗凝管抽取全血3 ml，進行白細胞分類計數檢測。

1.2.3 外周血T 淋巴細胞亞群檢測 特異性細胞固定及檢測法，基于抗原抗體特異性反應原理，將人體外周血中表達有CD 抗原的細胞固定于單克隆抗體包被玻片上，通過淋洗、染色等操作后，對特異性細胞進行自動計數儀自動計數。

1.3 統計學方法 數據庫及統計學分析在SPSS 20.0軟件上進行；符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）描述，病程組組間比較采用方差分析；方差不齊采用Dunnett’s T3法，方差齊采用LSD法；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床資料 共35 例患者，其中男19 例，女16 例，年齡12～74（44.63±14.80）歲。1 例患者無任何癥狀，其余34 例患者發病至住院時間間隔為1～25 d，中值為3.50 d。35 例患者中有4 例在住院第4～7 天轉外院治療，其余31 例全部治愈出院，住院10～36（21.29±7.93）d。轉院患者中轉院前診斷普通型、重型各2 例，其余31 例輕型4 例、普通型26 例、重型1 例，無危重型。治療措施：35 例患者辨證給予中藥治療。31 例未轉院患者中，除1 例未服用抗病毒藥物外，其余30 例患者均服用了1～4 種抗病毒藥物，其中使用奧司他韋16 例、克立芝22 例、阿比朵多爾8 例、磷酸氯喹9 例、干擾素1 例；抗生素使用18 例；4 例使用甲潑尼龍治療，使用3～11（6.50±3.70）d，使用總劑量分別64、120、260、400 mg；2例使用地塞米松治療，分別使用3 d和6 d，使用總劑量分別為15、30 mg；其余注射丙種球蛋白、注射用胸腺法新和白蛋白的患者分別為 11、14、7 例；4 例輕型和 1 例重型患者均未使用糖皮質激素治療；26 例普通型患者中6 例使用糖皮質激素治療。

2.2 COVID-19 患者外周血白細胞及血小板計數的變化 COVID-19 患者外周血白細胞及血小板計數結果如表1所示。

表1 入院后不同時間COVID-19患者外周血白細胞及血小板計數等情況（）

表1 入院后不同時間COVID-19患者外周血白細胞及血小板計數等情況（）

注：MONO（%）的Levene 方差齊性檢驗P＜0.05，提示方差不齊，多重比較采用Dunnett’s T3 法；其余方差齊性檢驗P＞0.05，提示方差齊，多重比較采用LSD法。與1 d時比較，aP＜0.05。COVID-19為新型冠狀病毒肺炎，WBC為白細胞計數，NEU為中性粒細胞計數，LYM為淋巴細胞計數，MONO為單核細胞計數，PLT為血小板計數

PLT（×109/L）177.23±56.32 162.11±45.25 164.38±49.38 206.11±63.98 249.96±85.00a 265.95±95.62a 219.75±56.62 0.109＜0.001 1 d 3 d 5 d 7 d 10 d 15 d 20 d Levene（P值）ANOVA（P值）35 19 21 19 25 20 12 4.54±1.48 5.21±3.74 5.15±2.73 6.21±3.04a 5.76±2.52 6.42±2.95a 5.89±1.67 0.167 0.149 2.91±1.37 3.80±3.74 3.54±2.72 4.44±2.98a 3.80±2.44 4.25±2.73 3.64±1.41 0.227 0.423 0.62±0.13 0.68±0.12 0.65±0.14 0.67±0.14 0.63±0.12 0.63±0.12 0.61±0.11 0.860 0.580 1.24±0.50 1.05±0.31 1.20±0.63 1.31±0.68 1.49±0.60a 1.62±0.58a 1.66±0.58a 0.153 0.007 0.29±0.11 0.24±0.10 0.27±0.12 0.25±0.11 0.28±0.10 0.28±0.10 0.29±0.10 0.799 0.688 0.31±0.14 0.34±0.17 0.36±0.15 0.38±0.14 0.35±0.15 0.40±0.17a 0.38±0.11 0.718 0.490 0.07±0.03 0.07±0.04 0.08±0.03 0.07±0.02 0.06±0.02 0.06±0.02 0.06±0.01 0.015 0.513時間 例數WBC（×109/L）NEU（×109/L）NEU（%）LYM（×109/L）LYM（%）MONO（×109/L）MONO（%）

2.3 COVID-19 患者的T 淋巴細胞亞群的變化 由表2 可見，隨著病程的延長，CD3+、CD4+、CD8+T 細胞絕對值計數在逐漸上升。

表2 發病后不同時間COVID-19患者T淋巴細胞亞群計數情況（）

表2 發病后不同時間COVID-19患者T淋巴細胞亞群計數情況（）

注：Levene 方差齊性檢驗均P＜0.05，提示方差不齊，兩兩比較采用Dunnett’s T3 法；與1 周時比較，aP＜0.05。COVID-19 為新型冠狀病毒肺炎，CD為白細胞分化抗原

CD4+/CD8+1.71±0.83 1.88±0.59 2.08±0.77 1.71±0.48時間1周2周3周4周例數23 22 21 8 CD3+（/μl）518.09±195.63 689.27±301.13 985.33±388.42a 1356.50±247.03a CD4+（/μl）299.74±118.37 427.91±227.50 609.90±255.27a 804.00±189.41a CD4+（%）0.57±0.11 0.61±0.10 0.61±0.07 0.59±0.05 CD8+（/μl）198.52±88.07 239.55±114.51 310.86±131.59a 480.50±100.86a CD8+（%）0.39±0.11 0.35±0.07 0.32±0.07 0.36±0.05 0.145 0.343 Levene（P值）ANOVA（P值）0.002＜0.001 0.001＜0.001 0.129 0.433 0.480＜0.001 0.023 0.078

2.4 COVID-19輕型與普通型患者外周血白細胞、T淋巴細胞亞群的檢測結果 未轉院31 例患者中，輕型患者4例，普通型患者26例，重型1例。因樣本數少，僅比較了輕型和普通型患者住院第1 天時的血常規結果以及病程第1、2 周的T 淋巴細胞亞群的檢測結果，見表3、表4、表5。住院第1 天時，輕型和普通型患者的淋巴細胞比值差異有統計學意義（P＜0.05），白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、單核細胞計數、血小板絕對值以及中性粒細胞比率、單核細胞比率差異均無統計學意義（均P＞0.05）。病程第1 周 CD3+、CD4+、CD8+T 細胞絕對值計數、CD4+T 細胞比率、CD8+T細胞比率、CD4+/CD8+比值，以及病程第2周CD4+T細胞比率、CD8+T 細胞比率、CD4+/CD8+比值，兩組間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。在病程第2 周時，比較兩組CD3+、CD4+、CD8+T 細胞絕對值計數，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表3 入院第1天輕型和普通型COVID-19患者的血常規結果（）

表3 入院第1天輕型和普通型COVID-19患者的血常規結果（）

注：Levene方差齊性檢驗均P＜0.05，提示方差不齊，兩兩比較采用Dunnett’s T3法；COVID-19為新型冠狀病毒肺炎，WBC為白細胞計數，NEU為中性粒細胞計數，LYM為淋巴細胞計數，MONO為單核細胞計數，PLT為血小板計數

PLT（×109/L）184.25±7.37 183.27±62.60組別輕型普通型例數4 26 WBC（×109/L）3.50±0.71 4.62±1.61 NEU（×109/L）1.80±0.77 2.94±1.43 NEU（%）0.50±0.13 0.62±0.12 LYM（×109/L）1.42±0.38 1.27±0.52 LYM（%）0.41±0.11 0.29±0.10 MONO（×109/L）0.22±0.08 0.32±0.15 MONO（%）0.07±0.03 0.07±0.03 0.017 0.031 0.976 Levene（P值）t值P值0.282-1.355 0.186 0.310-1.559 0.130 0.960-1.646 0.091 0.624 0.562 0.578 0.641 2.407 0.023 0.188-1.333 0.193 0.728-0.301 0.765

表4 入院第1周輕型和普通型COVID-19患者T淋巴細胞亞群結果（）

表4 入院第1周輕型和普通型COVID-19患者T淋巴細胞亞群結果（）

注：Levene 方差齊性檢驗均P＜0.05，提示方差不齊，兩兩比較采用Dunnett’s T3 法；COVID-19 為新型冠狀病毒肺炎，CD 為白細胞分化抗原

CD4+/CD8+1.93±0.27 1.67±0.85 0.066 0.505 0.619組別輕型普通型Levene（P值）t值P值例數3 17 CD3+（/μl）618.67±105.25 527.06±196.91 0.541 0.774 0.449 CD4+（/μl）392.00±69.40 298.59±113.46 0.451 1.363 0.190 CD4+（%）0.63±0.04 0.57±0.10 0.104 1.099 0.286 CD8+（/μl）205.33±41.05 207.53±93.40 0.321-0.039 0.969 CD8+（%）0.33±0.03 0.39±0.11 0.050-0.935 0.362

表5 入院第2周輕型和普通型COVID-19患者T淋巴細胞亞群結果（）

表5 入院第2周輕型和普通型COVID-19患者T淋巴細胞亞群結果（）

注：Levene 方差齊性檢驗均P＜0.05，提示方差不齊，兩兩比較采用Dunnett’s T3 法；COVID-19 為新型冠狀病毒肺炎，CD 為白細胞分化抗原

CD4+/CD8+2.01±0.59 1.97±0.57 0.873 0.105 0.918組別輕型普通型Levene（P值）t值P值例數3 16 CD3+（/μl）1 138.67±185.23 651.25±257.91 0.361 3.093 0.007 CD4+（/μl）790.67±267.14 396.63±164.71 0.236 3.483 0.003 CD4+（%）0.69±0.19 0.61±0.07 0.015 0.713 0.546 CD8+（/μl）406.67±123.31 216.88±94.83 0.666 3.059 0.007 CD8+（%）0.35±0.06 0.33±0.06 0.684 0.563 0.581

3 討 論

目前，雖然COVID-19 的發病機制尚未明確，但已有文獻報道，其發病和進展與細胞免疫和細胞因子有很密切的關系［1］。既往的研究表明，淋巴細胞及T 淋巴細胞亞群與SARS、中東呼吸綜合征（MERS）等病毒感染性疾病的發生和發展有關［5-7］。那么它們在COVID-19的致病過程中又是怎樣的呢？因此，為了明確它們之間的關系，本文收集了廣東省第二人民醫院收治的35 例COVID-19 患者的臨床資料，對其外周血血常規及T 淋巴細胞亞群的動態變化進行了分析研究。

本組研究結果顯示，在住院第1 天時，同正常參考值比較，患者白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、血小板計數均明顯降低，這同 Wang 等［1］和 Huang 等［8］所報道的非入住 ICU 患者一致；但白細胞、中性粒細胞平均值偏低，考慮可能與本組病例絕大多數為輕型、普通型患者以及發病至住院時間間隔短有關（本組平均為4.79 d，分別為6 d、7 d）。另外，我們發現中性粒細胞比率、淋巴細胞比率以及單核細胞比率與參考值比較差異均無統計學意義，這表明SARS-CoV-2 是不分差異全面影響機體的各個細胞免疫系統。但是，我們發現住院第15、20 天淋巴細胞絕對值計數與住院第1 天比較，差異均有統計學意義，而中性粒細胞和單核細胞差異均無統計學意義，這說明SARS-CoV-2 的重點攻擊對象是淋巴細胞，這和尸檢報告的淋巴細胞明顯減少一致［9］。如表1所示，淋巴細胞絕對值計數以及血小板絕對值計數在住院第3 天時處于最低值，這表明在發病約第7天時，機體的細胞免疫系統已經開始修復。

T淋巴細胞是淋巴細胞的一個重要組成部分，它在機體免疫系統中發揮著細胞免疫以及免疫調節等重要功能，是最為重要的一種淋巴細胞亞群，其主要由CD4+、CD8+T細胞組成，這兩種細胞亞群的適當比例對維持和穩定人體細胞免疫內環境起著重要的作用［10］。有研究表明，SARS患者在發病初期CD3+、CD4+、CD8+T 細胞計數均明顯降低，在病程第 2～3 周降至最低［11-13］。Xu 等［14］發現 1 例 COVID-19 的外周血CD4+、CD8+T細胞計數明顯降低，并且推測淋巴細胞減少可能是疾病嚴重程度和病死率相關的一個關鍵因子。本組研究顯示，COVID-19 在病程前 2 周，CD3+、CD4+、CD8+T細胞計數也均明顯降低，且在第1 周時同SARS 患者相比，CD3+、CD4+、CD8+T 細 胞 平 均 計 數 相 差 不 大［12］，但 是COVID-19 患者的T 淋巴細胞亞群計數總體上隨著病程的延長而逐漸恢復升高，并沒有出現SARS 患者在病程第2～3 周中的T 淋巴細胞亞群計數低谷。這也許可以在一定程度上解釋SARS-CoV-2的致病性弱于SARS-nCoV［15］。本組患者在病程4 周內，CD4+T 細胞比率、CD8+T 細胞比率以及CD4+/CD8+比值差異均無統計學意義，這同SARS 患者一致［12］。Chu等［16］發現MERS-nCoV 也可明顯降低機體CD4+、CD8+T 細胞的含量。同HIV 對CD4+T 細胞的持續攻擊不同，SARS-CoV、MERS-CoV 以及 SARS-CoV-2 對機體的細胞免疫功能均為一次性攻擊；HIV 只攻擊CD4+T細胞，而不攻擊CD8+T 細胞，CD4+/CD8+比值持續降低，而SARS-CoV、MERS-CoV 以及SARS-CoV-2 雖然降低CD4+T 細胞更加明顯［17］，但是也同樣會導致CD8+T 細胞降低，這提示冠狀病毒是不分亞群對所有T淋巴細胞成員展開影響［6］。

對輕型和普通型患者的血常規比較，發現在住院第1 天時，普通型患者的淋巴細胞比率已明顯低于輕型患者，這更加說明了病毒對機體免疫系統的攻擊主要是針對淋巴細胞。同時也提示監測淋巴細胞比率可能有益于預測患者的分型及嚴重程度。在病程第1 周，輕型和普通型患者的CD3+、CD4+、CD8+T 細胞平均計數差異均無統計學意義，而在第2 周時，普通型患者卻明顯低于輕型患者，這說明在第2 周時，SARS-CoV-2 對普通型患者細胞免疫系統發起了二次攻擊，這也印證了第2 周是患者最危險的時期這一觀點［8］，是患者病情分型不同的開始。因此，為了避免第2 周的病毒再次攻擊，在病程第1 周時及時給予有效的抗病毒藥物和維持細胞免疫系統的穩定至關重要［18］。增加T 淋巴細胞數量的方法，比如促進T淋巴細胞增生以及克隆增加T淋巴細胞亞群數量，也許能成為治療COVID-19 患者的一種途徑。另外，在第2 周時，對于T 淋巴細胞亞群明顯降低的高危患者可適當給予抗生素治療，以預防機會性感染。

目前，SARS-CoV-2引起T淋巴細胞亞群的機制尚不明確，但根據尸檢以及以往對SARS、MERS 的研究，可能有以下幾種途徑。第一、病毒直接攻擊淋巴細胞。尸檢發現脾臟及淋巴結淋巴細胞數量明顯減少，免疫組化染色顯示CD4+、CD8+T 細胞均減少，并可見細胞壞死，這可能是病毒直接攻擊淋巴細胞及其亞群的結果或者病毒在淋巴細胞內繁殖，導致淋巴細胞被破壞有關［9］。第二、T 淋巴細胞異常分布。尸檢發現，在肺泡間隔、心肌間質、肝血管竇匯管區等部位均可見淋巴細胞浸潤，這是否跟淋巴細胞在病變部位異常聚集，從而導致外周血中數量減少有關，仍需要進一步研究確認［9］。第三、骨髓抑制。同SARS 患者尸檢一樣，COVID-19患者也發現骨髓三系細胞數量均減少，這可能與病毒全面抑制骨髓增生，從而導致淋巴細胞下降有關［9，19-20］。第四、誘導細胞凋亡。鄢然等［21］通過觀察 Vero E6 細胞感染SARS-CoV 后的生化特征、形態特征以及DNA含量，證明 SARS-CoV 可引起 Vero E6 細胞凋亡。陳波［22］利用細胞脂質體介導轉染技術發現COS-7 細胞在轉染了SARS-CoV X2 蛋白后凋亡率明顯升高。Chu 等［16］發現MERS-CoV 可以通過內、外兩種途徑導致T 淋巴細胞凋亡。那么SARS-CoV-2 會不會誘導T 淋巴細胞亞群凋亡以及采用何種方式，都有待進一步研究。

總之，SARS-CoV-2會導致淋巴細胞以及T淋巴細胞亞群數量的降低，對它們動態變化的研究對COVID-19 患者及早臨床分型、治療方案、療效判斷、預后預測以及發病機制的探討都有一定幫助。但是本文也有一定的研究缺陷。首先本組研究為回顧性研究，臨床觀察指標缺失較多。其次，病例總數偏少，尤其在比較輕型和普通型患者時，輕型患者較少，這就有可能導致結果以偏概全，結論有失偏頗。第三，在比較輕、普通型患者T 淋巴細胞亞群時，沒有排除6例普通型患者使用糖皮質激素對T 淋巴細胞亞群的影響。最后，沒有檢測COVID-19 患者的病毒載量，不能判斷病毒載量和T 淋巴細胞亞群以及病情變化之間的關系。為了明確T 淋巴細胞減少的原因以及其臨床意義，仍然需要進行更多的研究。