BMSCs來源的外泌體對髁突軟骨細胞蛋白多糖表達的影響

邢超 徐靈巧 葉鐘泰 張志光

1深圳市寶安區人民醫院口腔科 518101；2中山大學光華口腔醫學院附屬口腔醫院口腔頜面外科，廣州 510055

由于軟骨缺乏血管營養供應，特殊的生理特性一旦發生表層缺損難以自愈，導致骨關節病的發生［1］。隨著病變的不斷進展，關節功能退化、咀嚼功能受損，嚴重影響生活質量。當前修復顳下頜關節軟骨缺損尚無有效的治療手段，如保守治療緩解疼痛，阻止病程進展，但在恢復軟骨再生方面作用有限［2-4］。自體軟骨移植，開辟第二術區造成供區缺損，且來源有限；人工關節費用高，存在并發癥，嚴格適應癥選擇［5-6］。目前，再生醫學的發展為關節軟骨的修復再生提供新的選擇，間充質干細胞（mesenchyme stem cell，MSCs）來源于體內多種組織，包括骨髓腔、關節滑膜組織、牙周膜、牙髓組織等，在體內外均具有軟骨分化潛能［7］。外泌體是一類直徑40～100 nm 的細胞外囊泡，攜帶核酸和蛋白質等多種生物活性內容物，參與細胞間信號傳遞、信號轉導和信息交流。已有研究表明干細胞來源的外泌體具有與干細胞相似功能，可以輔助組織修復再生、抑制細胞凋亡、發揮免疫調節和抗炎作用［8］。干細胞來源的外泌體在腦與神經系統損傷、心血管系統、肝臟損傷、腎臟損傷、骨骼與肌肉系統等方面表現出強大的修復和再生能力，甚至能夠替代干細胞開啟“無細胞”治療［9-12］。蛋白多糖是軟骨細胞生長代謝、發揮功能的一個重要指標［13］。本研究旨在探索外泌體與髁突軟骨細胞蛋白多糖之間的關系，觀察在外泌體的作用下，髁突軟骨細胞單位DNA 中氨基聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的含量及基因表達，從而為外泌體修復髁突軟骨缺損提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1、 材料與試劑 研究時間為2019年1月至2021年1月（其中動物實驗部分2014年做）。實驗用100 g左右SPF級雄性SD 大鼠，動物由中山大學北校區動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2011-0029，實驗方法符合動物倫理學要求。鯊魚硫酸軟骨素（Sigma，美國）；FBS（Gibico，美國）；Anti-Collagen Type I Rabbit pAb（Calbiochem?，德國）；Anti-Collagen II（SIGMA-ALDRICHTM，美國）；DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit gG（H+L）（ EARTHoX.LLC，美國）；小牛胸腺 DNA（Sigma，美國）；L-cysteine（Sigma，美國）；Hoechst 33258（Sigma，美 國）；TRIzol? Reagent（Ambion，美國）；cDNA 逆轉錄試劑盒（Roche，瑞士）；SYBR Green Mix（Roche，瑞 士）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，美國）；倒置顯微鏡下（Axiovert 40，Zeiss，德國）RT-PCR Primer（Invitrogen，美國）；Real-time PCR 儀（Roche，德國）；全自動酶標儀（Tecan Infinite200，瑞士）。

1.2 細胞獲取與鑒定

1.2.1 大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）的獲取及鑒定 從大鼠腹腔注入1%戊巴比妥鈉麻醉劑0.5 ml，手術分離雙側下肢股骨，去除骨頭兩側的骨骺端，使用含10%FBS的a-MEM 沖洗骨髓腔，將沖洗出的液體置于25 cm2無菌的培養瓶中，48 h 后換液將未貼壁的血細胞沖洗去掉。每隔3～4 d換液1次，細胞長滿培養瓶的80%后1∶3傳代。分別進行成骨、成脂及成軟骨誘導，驗證其多向分化能力。

1.2.2 大鼠髁突軟骨細胞的獲取及鑒定 在麻醉狀態下，將髁突及其附著物取出［14］。切取半透明的軟骨中央部分，放入0.25%的胰酶的培養瓶中消化30 min（每5～10 min震蕩混勻1 次），0.2%II 型膠原酶消化3 h，將所有收集的細胞轉移至25 cm2無菌的培養瓶中，10% FBS 的低糖型培養基（L-DMEM）培養，每隔3～4 d 換液，待細胞長滿培養瓶80%后傳代。將獲取的細胞進行II型膠原抗體免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 外泌體的提取、鑒定及分組 培養皿中骨髓間充質干細胞量達到80%時，去除上清液并加入無血清培養基培養72 h，收集上清液。在4 ℃條件下，進行差速離心：2 000 g離心 30 min，20 000 g 離心60 min，100 000 g 離心60 min，收集離心管底部沉淀，PBS 稀釋，100 000 g 離心 60 min，100 μl PBS 重懸沉淀物，放入-80 °C 冰箱保存備用。透射電子顯微鏡觀察外泌體形態，納米顆粒追蹤分析外泌體粒徑，蛋白印跡檢測外泌體標記物。取P1 代髁突軟骨細胞置于不含FBS 的 L-DMEM 培養 24 h，實驗組加入 100 μl 包含外泌體的PBS，對照組加入100 μl PBS，分別置于37 ℃，含5%二氧化碳，95%空氣飽和濕度的細胞培養箱中培養，每周換液2～3次。

1.4 髁突軟骨細胞GAG 含量測定 取100 μl 質量濃度分別為：20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml 鯊魚硫酸軟骨素標準液，空白對照組加入ddH2O，每孔各加入2 ml 二甲基亞甲藍（DMMB）混勻，酶標儀525 nm下測吸光度值，繪制GAG 含量的標準曲線［15］。以鯊魚硫酸軟骨素標準液的濃度為Y，吸光度值為X，做線性回歸得一標準曲線方程（Y=a·X+b，a、b為常數）。

取兩組髁突軟骨細胞，加入1 ml 的木瓜蛋白酶60 ℃水浴箱過夜（＞16 h）。取100 μl消化液（每個樣本設置3個平行對照組），加入2 ml DMMB，酶標儀525 nm下測吸光度值。根據標準曲線方程計算出細胞內GAG 含量，細胞內GAG 含量=a·吸光度值+b。

1.5 髁突軟骨細胞DNA 含量測定 取牛胸腺DNA 作為標準液分別稀釋成0、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml溶解于TNE緩沖液中，取40 μl不同濃度的牛胸腺DNA標準液加入到 96 孔板。室溫避光條件下加入 Hoechst 33258（10 μg/ml）160 μl，熒光酶標儀下測 excitation 358 nm 、emission 458 nm吸光度值［16］。以牛胸腺DNA 標準液的濃度為Y，吸光度值為 X，做線性回歸得一標準曲線方程（Y=a·X+b，a、b 為常數）。

取兩組髁突軟骨細胞，加入1 ml 的木瓜蛋白酶60 ℃水浴箱過夜（＞16 h）。取40 μl 消化液，加入160 μl Hoechst 33258（10 ug/ml），熒 光 酶 標 儀 下 測 excitation 358 nm 、emission 458 nm 吸光度值，根據標準曲線方程計算出細胞內DNA含量（細胞內DNA含量=a·吸光度值+b）

1.6 反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR） 按2×105/瓶接種P1 代髁突軟骨細胞至25 cm 培養瓶，Trizol 分別提取培養7、14 d 髁突軟骨細胞RNA 并測定濃度。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行反轉錄合成cDNA，SYBRGreen QPCR Master Mix 試劑盒進行定量PCR。結果分析按照Livak 等［17］的方法計算實驗組與對照組相對CT 值（2-△△Ct），每個樣本重復 3 次，采用 GAPDH 作為管家基因，分析GAG 基因表達情況，基因引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成（表1）。

表1 反轉錄聚合酶鏈反應引物序列

1.7 統計學方法 用SPSS 17.0 軟件對實驗結果進行統 計 分 析 ，計 量 資 料 以 均 數 ±標 準 差（）表 示 ，Shapiro-wilk 檢驗數據正態性，若方差齊、符合正態分布采用獨立樣本t檢驗，方差不齊或偏態分布采用Mann.Whitney test 非參數檢驗法。每組實驗重復3 次，檢驗水準為雙側α=0.05，P＜0.05說明差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs 的培養及多向分化能力鑒定 利用干細胞貼壁生長的特性，可見部分小圓形細胞漂浮于培養基表面，貼壁細胞大小不等，多為短梭形，核橢圓形，有的可呈雙核（圖1-A）。成骨誘導組細胞周圍可見有鈣化結節形成，茜素紅染色可見紅色鈣化結節形成（圖1-B）。成脂誘導組細胞周圍可見大量脂滴形成，油紅O 染色低倍鏡下觀察可見大量紅色脂滴形成（圖1-C）。軟骨誘導液培養3周后，可見有乳白色軟骨塊形成（圖1-D）。

圖1 骨髓間充質干細胞形態學觀察及三向分化能力。A 為顯微鏡下BMSCs 形態（50 倍放大）；B 為成骨誘導茜素紅染色（50 倍放大）；C 為成脂誘導油紅O 染色（50 倍放大）；D 為成軟骨誘導形成的軟骨塊

2.2 大鼠髁突軟骨細胞的培養及鑒定 髁突軟骨細胞成簇分布，形態多角形，隨著細胞數量密集，細胞形態成圓形或多邊形，逐漸融合形成“鋪路石”樣結構（圖2-A）。激光共聚焦顯微鏡下，可見細胞質內II 型膠原呈綠色熒光表達，藍色為細胞核DAPI染色（圖2-B）。

圖2 髁突軟骨細胞形態學觀察及II 型膠原熒光染色。A 為大鼠髁突軟骨細胞形態（50 倍放大）；B 為II 型膠原免疫熒光（200倍放大）

2.3 外泌體鑒定 透射電鏡下觀察BMSCs-外泌體形態和大小（圖3 A）：外泌體結構完整，呈圓形囊泡狀，伴有“茶托樣”特征外形。納米顆粒追蹤分析（圖3 B）：所提取的BMSCs-外泌體粒子直徑眾數87 nm，平均直徑100 nm，提示成功提取到BMSC-外泌體。Western blot 檢測（圖3 C）：外泌體特異性標記蛋白CD9 和TSG101 的表達，但不表達3-磷酸甘油醛脫氫酶。

圖3 外泌體的鑒定。A 為透射電鏡下觀察外泌體結構完整；B為納米顆粒追蹤分析；C為Western blot顯示，外泌體表面標志物CD9、TSG101呈陽性表達，但不表達3-磷酸甘油醛脫氫酶

2.4 細胞GAG 含量測定 鯊魚硫酸軟骨素標準溶液的質量濃度X 對其吸光度Y 作線性回歸，擬合一標準曲線方程Y=0.01X-0.3814，相關系數R2=0.996 7。結果表明吸光度總變異的99.67%與標準品的濃度有關，具體見圖4。根據標準曲線方程計算出細胞內GAG含量，實驗組GAG含量在第3天高于對照組［（0.95±0.03）μg/ml 比（0.58±0.02）μg/ml］，差異有統計學意義（t=10.36，P＜0.001）；第7 天實驗組高于對照組［（2.68±0.06）μg/ml 比（1.63±0.04）μg/ml］，差異有統計學意義（t=12.01，P＜0.001）；第14 天實驗組高于對照組［（3.59±0.07）μg/ml 比（1.86±0.07）μg/ml］，差異有統計學意義（t=10.61，P＜0.001）。

圖4 硫酸軟骨素標準曲線

2.5 細胞DNA 含量測定 牛胸腺DNA 溶液的質量濃度X 對其吸光度Y 作線性回歸，擬合一標準曲線方程Y=1.929 9X-727.77，相關系數R2=0.971 3。結果表明，吸光度總變異的97.13%與標準品的濃度有關，具體見圖5。根據標準曲線方程計算出細胞內DNA含量，第3天實驗組DNA含量顯著高于對照組［（30.14±9.59）μg/ml比（23.45±3.33）μg/ml］，差異有統計學意義（t=3.625，P=0.037）；第7 天實驗組與對照組基本一致［（42.82±3.74）μg/ml 比（40.46±7.01）μg/ml］，差異無統計學意義（t=0.447，P＞0.05）；第14 天實驗組與對照組基本一致［（54.70±1.36）μg/ml 比（54.70±1.80）μg/ml］，差異無統計學意義（t=0.286，P＞0.05）。

圖5 牛胸腺DNA標準曲線

2.6 單位DNA 中GAG 含量測定（GAG/DNA） 第 3 天GAG/DNA 含量實驗組高于對照組［（0.0320 ±0.007 1）比（0.023 0±0.003 5）］，差異有統計學意義（t=4.921，P=0.018）；第 7 天實驗組高于對照組［（0.063 0±0.006 5）比（0.039 0±0.006 7）］，差異有統計學意義（t=17.78，P＜0.001）；第14 天實驗組高于對照組［（0.063 0±0.007 3）比（0.032 0±0.005 8）］，差異有統計學意義（t=15.59，P＜0.001）。結果表明實驗組中的外泌體可以促進軟骨細胞單位DNA中GAG含量表達。

2.7 RT-PCR 檢測細胞中GAG 基因的表達水平 第7 天GAG mRNA 的含量表達水平實驗組高于對照組［（2.610±0.018）比（1.000±0.150）］，差異有統計學意義（t=12.31，P＜0.001）；第14天實驗組高于對照組［（5.560±0.018）比（2.550±0.090）］，差異有統計學意義（t=14.78，P＜0.001）。結果表明實驗組中的外泌體可以促進軟骨細胞GAG 基因表達。

3 討論

干細胞來源的外泌體在各個領域均有應用，作為MSCs分泌物的主要成份，在組織修復中發揮重要作用。目前外泌體的提取方法主要有：超速離心法、密度梯度離心法、聚合沉淀法、超濾法、免疫捕獲法等。這些方法均具有含量低或純度低等缺點，缺乏統一的鑒定標準。提取方法并非本實驗的研究重點，因此按照國際細胞外囊泡協會提出方法為指導提取外泌體［18-19］。

蛋白多糖是一類由核心蛋白與GAG 以共價和非共價鍵所組成的糖復合物，其含糖量可高達95%以上。氨基聚糖通過一個或多個共價鍵與羧基（-COOH）、硫酸基（-OSO3H）和磺基（-SO3H），重要的GAG 有透明質酸（HA）、硫酸軟骨素、硫酸角質酸、硫酸皮膚素、硫酸肝素等［13］。按照蛋白聚糖的組織分布和功能分為3 類：（1）細胞膜PG，各種組織均有表達，與生理功能合病理變化有關；（2）基底膜結合PG，主要在血管上皮細胞基底膜，調節血管分化和調控腫瘤發展有關；（3）細胞外基質PG，主要功能維持細胞外基質結構，最常見的是多聚蛋白聚糖（aggrecan，AG），與HA充填于軟骨細胞間隙，是關節軟骨主要成份［20］。

通過RT-PCR 檢測軟骨相關基因的表達水平，GAG 的含量在第7、14 天時，實驗組均明顯高于對照組，表明BMSCs-外泌體中含有的生物活性因子通過促進GAG 基因的表達。有學者在兔子骨關節病模型中，通過關節腔注射骨髓間充質干細來源的外泌體聯合HA，術后進行組織學和免疫組化分析，發現外泌體可以促進蛋白聚糖的合成進而加快軟骨損傷的修復，并且新形成的軟骨組織與天然軟骨具有相近的機械性能［21］。

為了進一步檢測軟骨細胞中GAG 含量的表達情況，我們通過分析細胞內的蛋白多糖含量，實驗組第3、7、14 天均明顯高于對照組，說明BMSCs-外泌體促進蛋白多糖表達，這些結果與上述RT-PCR 結果一致。為了排除細胞數量增加的干擾，我們檢測單位DNA 中GAG 含量表達的變化，結果顯示第7、14 天時實驗組GAG/DNA 含量明顯高于對照組。所有的這些證實了BMSCs-外泌體促進軟骨細胞GAG含量的表達，對維持軟骨的表型發揮重要的作用。這與Zhang 等［22］將 MSCs 來源的外泌體與軟骨共培養，促進軟骨基質合成，植入動物缺損模型后促進軟骨缺損愈合結果一致。有學者發現外泌體中的一些miRNA 可以調控軟骨基質合成，比如 miR-125b 和 miR-320 通過下調 aggrecanse 和MMP-13 表達，從 而 減 輕 ECM 破壞，miR-92a 可以通過PI3K/AKT/mTOR 通路靶向noggin 3 上調軟骨基質合成，介導MSC外泌體促進軟骨修復［23-24］。

綜上所述，干細胞來源的外泌體增加單位DNA 中GAG含量表達，有助于增加髁突軟骨細胞的蛋白多糖表達，這將為顳下頜骨關節病的治療開辟新的思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。