日本落葉松LaSPL2和LaSPL3在體細胞胚發育中的表達分析

范艷如，蘭 倩，韓素英，齊力旺，張立峰*

(1.中國林業科學研究院林業研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業和草原局林木育種與培育重點實驗室，北京 100091；2.中國林業科學研究院林業科技信息研究所，北京 100091；3.中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所，北京 100091)

SQUAMOSA PROMOTER-BINDING PROTEINLIKE(SPL) 是植物中廣泛存在且特有的一類轉錄因子，具有高度保守的SBP 結構域，該結構域包含2 個Zn2+結合位點和1 個核定位信號序列[1-2]。擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.）17 個SPL家族成員中，11 個基因是miR156 的靶基因[3]。SPL基因家族成員的編碼區或3′非編碼區（UTR）中miR156 的識別位點非常保守[4]。系統發育分析表明，這些SPL基因分為5 組，分別為AtSPL3（AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5）、AtSPL9（AtSPL9和AtSPL15）、AtSPL2（AtSPL2、AtSPL10和AtSPL11）、AtSPL6和AtSPL13[5-7]。根據其在擬南芥中的功能，上述SPL基因劃分為三組：（1）AtSPL9、AtSPL15、AtSPL2、AtSPL10、AtSPL11和AtSPL13與營養和生殖階段的轉變相關，其中，AtSPL9、AtSPL15和AtSPL13起著最重要的作用；（2）AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5促進花分生組織特性的轉變；（3）AtSPL6影響某些生理過程[8]。眾多研究表明，miR156/SPL調控系統影響植物的多種生物學過程，包括營養和生殖階段的轉變、葉毛發育、分蘗/分枝、果實成熟、脅迫反應、胚胎發育和花青素生物合成等[8-20]。擬南芥DICER-LIKE1（DCL1）突變體的八細胞胚胎時期，miR156 的2 個靶基因AtSPL10、AtSPL11上調最高[21]。過表達csi-miR156a 或單獨敲除2 個靶基因CsSPL3和CsSPL14，可以顯著提高柑橘愈傷組織的體細胞胚發生能力[22]。上述研究表明，miR156/SPL 調控系統可能參與植物的胚胎發育。

落葉松（Larixspp.）體細胞胚體系的建立為現代分子育種技術進行遺傳改良奠定了基礎，也是研究植物胚胎發育及細胞全能性的理想實驗材料。針對落葉松體細胞胚再生體系中，諸如胚性細胞誘導困難、體細胞胚同步化發育、生根率低等問題，選取落葉松原胚ESMs（embryonal-suspensor mass）、單胚和子葉胚材料，利用基因芯片、高通量測序和qRT-PCR 等技術，通過預測與分析鑒定了許多已知和未知的MicroRNAs 及其靶基因[23-26]，根據其表達模式研究[25,27-28]，證明了miRNAs 作為調控因子，參與了落葉松體細胞胚的發育過程，其中，發現miR156 表達次高峰出現在早期子葉胚，最高峰在后期子葉胚[26]。另外，還發現miR156 在同步胚中的表達遠高于非同步胚[23]。上述研究表明，miR156 的表達調控可能在落葉松體細胞胚發生過程中起重要作用。

為了闡明miR156/SPL 調控系統在落葉松體細胞胚發育中的作用，筆者克隆了2 個SPL基因的cDNA 序列，將其命名為LaSPL2和LaSPL3。通過生物信息學分析及亞細胞定位研究，結合其在落葉松體細胞胚發育中的表達模式，揭示miR156 如何調節靶向SPLs基因的表達，進而調控體細胞胚的發育進程。

1 材料與方法

1.1 材料

以日本落葉松（Larix kaempferi(Lamb.) Carr）胚性細胞系S287 為試驗材料，于黑暗條件下22 ±2℃培養，每3 周繼代1 次。挑取一部分繼代培養3 周的材料并迅速放入液氮冷凍，用于總RNA 提取和基因克隆；將另一部分ESMs 分為兩組，一組轉到成熟培養基，并在誘導后0、2、5、7、10、14、21、28、35、42 d 取材，共取10 個時期；另一組轉到ABA 缺失的成熟培養基，分別在0、2、5 d 取材，置于?80℃冰箱備用。

1.2 LaSPL2 和LaSPL3 全長cDNA 克隆

落葉松各組織總RNA，參照TaKaRa 的Fruitmate? for RNA Purification 說明書提取。取1 μg總RNA，按照TransScript?II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR 反轉錄試劑盒操作說明書合成cDNA。研究表明，火炬松（Pinus taedaLinn.）TC68758 和TC75581 可能是miR156 的靶基因[29]。根據TC68758 序列設計引物LaSPL2-F/LaSPL2-R，從落葉松中擴增到947 bp 的同源序列；將TC75581 作為種子序列，搜索到1 條落葉松同源序列（JR171955）。根據上述獲得的2 條落葉松同源序列，設計4 組引物：3′RLaSPL2-1/3′RLaSPL2-2、5 ′ RLaSPL2-1/5 ′ RLaSPL2-2、3 ′ RLaSPL3-1/3 ′ RLaSPL3-2、5 ′ RLaSPL3-1/5 ′RLaSPL3-2（表1），用于RACE 克隆LaSPL2和LaSPL3的全長cDNA 序列（參照Clontech 公司的SMARTer RACE 5′/3′ Kit 說明書進行）。

1.3 LaSPL2 和LaSPL3 生物信息學分析

利用NCBI ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，搜索LaSPL2和LaSPL3的開放閱讀框（ORF），并分析其氨基酸序列及UTR，鑒定miR156 的識別位點；用ClustalX 2.1（https://clustalx.software.informer.com/2.1/），將推導的LaSPL2和LaSPL3 氨基酸序列與擬南芥AtSPLs 比對；利用EXPASY-PROSITE（http://prosite.expasy.org/）對其特征序列進行預測；通過MEGAX，采用鄰接法構建系統發育樹。

1.4 LaSPL2 和LaSPL3 亞細胞定位研究

通過EXPASY-PSORT（http://psort.hgc.jp/）預測LaSPL2和LaSPL3亞細胞定位情況。根據LaSPL2和LaSPL3cDNA 序列，設計引物并添加限制性酶切位點（表1），用于ORF 的PCR 擴增。用T4 連接酶連接目的片段和pSuper1300-GFP。對陽性克隆鑒定并測序以確保序列的正確性。將融合表達載體構建完成后轉入農桿菌GV3101，挑取陽性菌到LB 培養基，其中含有25 μg·mL?1利福平（Rif）、40 μg·mL?1卡那霉素（Kan）、30 μg·mL?1慶大霉素（Gen），28℃振蕩培養，最佳OD600為0.6～0.8；然后在4℃，6 000 g 的條件下將菌液離心10 min，用轉化液10 mmol·L?1氯化鎂（MgCl2），10 mmol·L?12-(N-嗎啡啉)-乙基磺酸（MES），pH 5.7，200 μmol·L?1乙酰丁香酮（AS）重懸菌體，室溫條件下放置3 h。用小型注射器將重懸菌液注入煙草葉片，置于培養箱內培養2 d。取部分煙草葉片，置于1 μg·mL?14′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液中浸泡，分別于405 nm 和488 nm 觀察DAPI 染色和GFP 融合蛋白的表達情況。

表1 PCR 擴增引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used for PCR in the study

1.5 落葉松體細胞胚發育過程中LaSPL2 和LaSPL3的表達模式

根據LaSPL2和LaSPL3序列比對結果，設計2 對引物qLaSPL2-F/qLaSPL2-R、qLaSPL3-F/qLaSPL3-R（表1）。通過PCR 擴增，將LaSPL2和LaSPL3的目的條帶進行測序并驗證其準確性。利用CFX96 熒光定量PCR 儀檢測LaSPL2和LaSPL3在落葉松體細胞胚不同發育階段的表達水平，使用的試劑盒為TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMkit，內參基因為LaEF1A1（GenBank accession:JR153706）[26]。

2 結果與分析

2.1 LaSPL2和LaSPL3全長cDNA克隆及生物信息學分析

火炬松中預測了2 條miR156 的靶基因序列TC68758 和TC75581[29]。根據TC68758 序列設計引物LaSPL2-F/LaSPL2-R，進行RT-PCR 擴增，從落葉松中擴增到947 bp 的同源序列，并在落葉松轉錄組中搜索到TC75581 的同源序列JR171955。4 組RACE 擴增的引物是以上述2 條落葉松的同源序列為模板，經過2 輪巢式PCR，分別獲得了287、1268、365 和755 bp。經序列組裝后獲得了2 條全長cDNA 序列，并分別命名為LaSPL2(GenBank Accession No.:MN315910)和LaSPL3(GenBank Accession No.:MN315911)。經NCBI ORF finder 搜索發現，LaSPL2和LaSPL3分別編碼532 個和191 個氨基酸，預測蛋白分子量分別為57 213.77、21 726.37 Da，等電點分別為8.90、9.33。進一步分析發現，LaSPL2和LaSPL3mRNA中均存在miR156 識別位點（圖1），其中，LaSPL2的識別位點位于編碼區，而LaSPL3位于3′UTR 區域，表明其可能受miR156 的調控。

圖1 落葉松LaSPL2 和LaSPL3 預測的miR156 結合位點（A）和序列比對（B）Fig.1 Predicted miR156 position in LaSPL2 and LaSPL3 (A) and alignment of miR156 and LaSPL2 and LaSPL3 transcript sequences (B)

從UniProt 數據庫搜集擬南芥AtSPLs 家族成員的蛋白序列，并將其與推導的蛋白序列進行比對。結果表明，LaSPL2 和LaSPL3 具有非常保守的SBP結構域（ZF_SBP，Zinc finger SBP-type profile）（圖2）。通過EXPASY-PROSITE 搜索，氨基酸序列124-201[LaSPL2，V(124)PRCQVEGCK TELTTAKDYHRRHKVCELHSKSPKVIVNGIEQRF CQQCSRFHILSEFDEGKRSCRRRLAGHNERRRKP(201)]、65-142[LaSPL3，A(65)PSCQVEKCAADLAD AKEYYRRHRVCEQHSKARIVLVLGLQQRFCQQ CSRFHELEEFDEAKRSCRRRLAGHNERRRKT(14 2)]，與SBP 結構域的典型特征序列(C-x4-C-x16-C-x2-[HC]-x15-C-x2-C-x3-H-x11-C)相匹配，證明其具有SPL 家族蛋白的特征序列。

圖2 落葉松LaSPL2 和LaSPL3 與AtSPLs 序列比對Fig.2 ClustalX 2.1 alignment of the deduced protein sequence encoded by the Japanese larch (Larix leptolepis) LaSPL2 and LaSPL3 and the proteins encoded by the members of the Arabidopsis thaliana SPL family regulated by miR156.

利用MEGAX，構建了SPL 蛋白家族的系統發育樹（圖3）。結果表明，LaSPL2和LaSPL3分別與擬南芥的AtSPL2/10/11、AtSPL3/4/5最相似。擬南芥中AtSPL2、AtSPL10、和AtSPL11與營養和生殖階段的轉變相關，而AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5與花分生組織的轉變相關[8]。因此在基因的結構和功能上，推測LaSPL2和LaSPL3分別與AtSPL2和AtSPL3具有相似性。

圖3 落葉松LaSPL2 和LaSPL3 與AtSPLs 的系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of LaSPL2 and LaSPL3 and the Arabidopsis thalianaSPL family members.

2.2 LaSPL2 和LaSPL3 亞細胞定位研究

前人研究表明，擬南芥AtSPLs 定位于細胞核[30]。ExPASy-PSORT 預測LaSPL2 和LaSPL3 定位于細胞核。為了明確其在細胞中發揮功能的具體部位，引物在LaSPL2和LaSPL3ORF 兩端設計，并添加Hind III 和SpeI 酶切位點（表1），用于擴增其ORF 序列；用T4 連接酶將PCR 產物和pSuper 1300-GFP連接，構建pSuper1300-LaSPL2-GFP 和pSuper1300-LaSPL3-GFP 融合表達載體。將序列正確的表達載體，轉入農桿菌GV3101，空質粒pSuper1300-GFP 作為陰性對照（C）。用注射器將農桿菌重懸液注入煙草葉片，將其置于培養箱內繼續培養2 d。取部分煙草葉片，置于1 μg·mL?1DAPI 溶液中浸泡，用激光共聚焦掃描顯微鏡在488 nm 觀察GFP 的綠色熒光信號，并在405 nm下觀察DAPI 染細胞核的藍色熒光信號。LaSPL2-GFP 和LaSPL3-GFP 僅在細胞核內觀察到有綠色熒光信號，而對照則呈現彌散的熒光信號（圖4）。表明LaSPL2 和LaSPL3 是核定位蛋白，與其作為轉錄因子的功能相一致。

圖4 落葉松LaSPL2 和LaSPL3 亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization ofLaSPL2 and LaSPL3

2.3 LaSPL2 和LaSPL3 在落葉松體細胞胚發育中的表達模式

為了研究LaSPL2和LaSPL3在胚胎發育中的作用，檢測了其在落葉松體細胞胚發育過程的表達模式。當ESMs 轉接到成熟培養基后，在植物生長調節劑（PGRs）的撤除和ABA 共同作用下，促進了早期胚胎的形成。結果表明，隨著PGRs 的撤除及ABA 處理，LaSPL2和LaSPL3均有不同程度的響應。當ESMs 轉到成熟培養基（PGRs 撤除）的前5 d，即在體細胞胚發育早期，LaSPL2和LaSPL3的表達均有所下調（圖5A、C），其中，LaSPL3下調程度較多（圖5C）；而在ABA 缺失的情況下，其表達水平略有上調（圖5B、D）。

圖5 落葉松體細胞胚胎發生早期LaSPL2 (A、B)和LaSPL3(C、D)對ABA(A、C)和ABA 缺失(B、D)的應答模式Fig.5 Accumulation of LaSPL2 (A,B)and LaSPL3 (C,D)transcripts in ABA-treated (A,C) and no ABA-treated ESMs (B,D) ESMs during the early somatic embryogenesis stage.

當ESMs 轉接到成熟培養基后，第7～10 天時出現黃色胚頭[31]。qRT-PCR 結果（圖6）表明：隨著體細胞胚的進一步發育，LaSPL2的表達水平在10 d 達到最高峰，14～35 d 表達下降，期間變化不明顯，42 d 降到最低值；LaSPL3的表達水平在7～14 d 逐漸升高，隨后下調，42 d 達到最低值；表明這2 個基因可能與早期胚胎發生相關。

圖6 落葉松體細胞胚發育過程中LaSPL2 (A) 和LaSPL3 (B)的表達模式Fig.6 Expression patterns of LaSPL2 (A) and LaSPL3 (B) during somatic embryogenesis.

3 討論

miR156 通過識別SPL基因家族編碼區或3′非翻譯區（UTR）中保守的識別位點，進行轉錄后或翻譯水平調控[4]。擬南芥AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5的miR156 識別位點位于3′UTR 區域，其余AtSPLs的miR156識別位點位于編碼區[3,32]。本研究從落葉松中鑒定了2 個SPL同源基因，系統發育樹分析表明，它們分別與擬南芥AtSPL2/10/11、AtSPL3/4/5最相似（圖3），將其命名為LaSPL2和LaSPL3。多序列比對發現，該基因編碼的蛋白質具有SPL 家族蛋白的典型特征，具有保守的SBP 結構域（圖2），表明LaSPL2和LaSPL3與SPL家族同源。LaSPL2和LaSPL3mRNA 具有miR156識別位點（圖1），其中，LaSPL2的識別位點位于編碼區，而LaSPL3的識別位點位于3′UTR，這與擬南芥中的研究結果相一致，其表達在一定程度上可能受miR156 調控。本研究構建了pSuper1300-LaSPL2-GFP 和 pSuper1300-LaSPL3-GFP 融合表達載體，通過煙草瞬時表達體系進行亞細胞定位，結果顯示LaSPL2和LaSPL3定位于細胞核中（圖4），因具有保守的SBP 結構域，表明LaSPL2 和LaSPL3 是SPL 家族蛋白，故而推測它們的編碼產物為SPL類轉錄因子。

ABA 在落葉松體細胞胚發育中起重要調控作用[33]，可以誘導H2O2和ROS 的產生，并調節CAT、SOD和APX的表達[34]。H2O2可能通過細胞信號轉導系統影響基因表達，進而誘導體細胞胚發育[34]。研究表明，擬南芥過表達miR156 可以降低H2O2水平和SA 信號通路相關基因的轉錄水平[35]，同時降低植物對真菌的免疫抗性。上述結果表明，miR156/SPLs 系統影響ROS 的積累，并控制SA 信號通路的激活或失活[35]。通過分析ABA 缺失對LaSPL2和LaSPL3表達的影響（圖5），表明ABA可能是落葉松體細胞胚發育早期LaSPL2和LaSPL3下調表達的主要因子。

miRNAs 通過影響植物激素的生物合成、轉運和信號轉導途徑而成為植物生長發育的關鍵調控因子[36]。生長素在植物體胚細胞重編程和體細胞胚胎發育中發揮重要作用[37-39]。前期研究表明，LaGH3的表達在一定程度上反映了落葉松體細胞胚發育過程中內源生長素的動態變化，體細胞胚發育前6 d，ABA 是迅速下調LaGH3的主要因子，反應此時在ABA 作用下生長素水平可能會下調，以降低細胞分裂速度，實現ESMs 從快速增殖狀態到胚胎發育的轉變，進而促進體細胞胚的進一步發育[40]。上述研究表明，ABA 可能通過調控生長素的水平而影響LaSPL2和LaSPL3的表達。在ABA 缺失的情況下，LaSPL2和LaSPL3表達水平略有上調（圖5B、D）。前期研究發現，在ABA缺失的培養基上生長的ESMs 中H2O2含量升高，細胞由白色逐漸轉變為褐色，體細胞胚發育受阻[31]，這可能與ABA 缺失導致的早期脅迫有關。

隨著體細胞胚的進一步發育，LaGH3轉錄水平逐漸增加，在28 d 達到高峰，表明生長素在體細胞胚的進一步發育中具有重要作用[40]。此時，LaSPL2和LaSPL3的表達水平，分別在10 d 和14 d達到峰值，表明其可能與早期胚胎形成相關（圖6），同時H2O2含量在10 d 左右時處于低谷期[34]。因此，認為此時LaSPL2和LaSPL3的高表達可能與生長素、H2O2調控相關，進而參與體細胞胚的早期形成。

擬南芥miR156 有助于促進胚胎形態建成[21,41-42]。DICER-LIKE1（DCL1）突變體中，除了AtSPL10、AtSPL11外，AtSPL2表達水平上調了5.33 倍[21]。柑橘中敲除CsSPL3可以顯著提高柑橘愈傷組織的體細胞胚發生能力[22]。上述結果表明，miR156/SPL調控系統可能參與植物的胚胎發育。前期研究表明，在落葉松早期子葉胚發育的前6 個階段，miR156b前體和成熟體表達水平逐漸升高[26,43]，表明其表達可能與ABA 的調控相關。擬南芥的原位雜交分析中，發現miR156 信號隨著合子胚胎的發育而逐漸增強[21]，與落葉松體細胞胚發育中的表達模式相一致[26]。本研究發現，隨著體細胞胚發育成熟，LaSPL2和LaSPL3表達量逐漸下降，并在42 d 達到最低值（圖6）。這與筆者前期發現miR156 水平在成熟體細胞胚中達到峰值相一致[26]。因此，落葉松中ABA 可能通過miR156 下調LaSPL2和LaSPL3，提高體細胞胚發生能力，進而促進胚胎發育及成熟休眠。

4 結論

本研究從落葉松中克隆了2 個SPL同源基因LaSPL2和LaSPL3，均具有保守的SBP 結構域，其cDNA 序列中存在miR56 的識別位點；亞細胞定位結果表明LaSPL2和LaSPL3定位于細胞核；qRT-PCR 結果表明，ABA 可能是落葉松體細胞胚發育早期LaSPL2和LaSPL3下調表達的主要因子；LaSPL2和LaSPL3在體細胞胚發育的早期階段達到最高峰，提示其可能參與體細胞胚的早期形成。隨著體細胞胚發育成熟，LaSPL2 和LaSPL3表達可能受miR156 的調控，在體細胞胎的成熟休眠中具有重要意義。