環介導等溫擴增技術檢測鼠疫感染動物敏感性的應用性研究※

謝 輝，祁芝珍，楊曉艷，趙海紅，劉中凱，李 勝，張 琪

(青海省地方病預防控制所，青海 西寧 811602)

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型恒溫核酸擴增技術，能否應用于鼠疫現場觀點不一，本研究擬考察環介導等溫擴增技術(LAMP)檢測鼠疫實驗感染動物的敏感性及檢測時間，探討在鼠疫流行現場應用LAMP技術的可行性。現將有關研究情況報告如下。

1.材料與方法

1.1 材料

試劑及儀器：LAMP引物由北京擎科生物有限公司合成，Loopamp?朗報?DNA擴增試劑盒(批號98004)、Loopamp熒光目視檢測試劑盒(批號98002)由北京成志科為生物科技有限公司提供；鼠疫膠體金免疫層析試紙(批號202001)由中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供；中國細菌濁度標準吧管(批號2018-1)由中國藥品生物制品檢定所提供；恒溫水浴箱ZC-22Q由杭州卓馳儀器有限公司提供。

實驗動物：小白鼠、 豚鼠、大耳白兔由重慶鵬鑫生物科技有限公司西安分公司提供。

培養基：赫氏培養基由青海省地方病預防控制所培養基室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物感染

1.2.2 鼠疫耶爾森菌反向血凝試驗(RIHA)：

分別取制備的臟器懸液，按照鼠疫診斷標準(WS279-2008)[1]方法進行反向血凝試驗。

1.2.3 細菌檢測

按照鼠疫診斷標準(WS279-2008)方法進行細菌學檢測。

1.2.4 鼠疫膠體金免疫層析法(RGICA)試驗

按1.2.1方法制備臟器懸液取上清液200 μL加入膠體金免疫層析試紙條檢測孔內，15 min后觀察結果：見兩條顯色帶視為陽性結果，僅見一條顯色帶視為陰性結果。同時做空白對照。

1.2.5 模板制備

采用煮沸法，取動物臟器懸液于100 ℃水浴加熱10 min，離心(12000r/min)取上清液作為DNA模板。將模板置-20 ℃冰箱保存。

1.2.6 鼠疫耶爾森菌環介導等溫擴增技術(LAMP)試驗

引物合成根據NCBI數據庫(GenBank登錄號AF350075)公布的鼠疫耶爾森菌3a基因序列，用Priner Explorer version 4在線軟件設計LAMP引物，包括外引物F3、B3和內引物FIP、BIP以及相應的環引物(表1)。模板制備方法同1.2.5所示方法。

表1 引物序列

LAMP反應體系及反應條件：反應體系(25μL)包括：2×Reaction Mix.(12.5μL)、混合引物(1μL。引物濃度：F3、B3為5pmol/μL，BIP、FIP為40pmol/μL)、Bst DNA聚合酶(1μL)、DNA模板(2μL)、熒光染料(1μL)、滅菌純水(補至25μL)；使用恒溫水浴加熱(65℃)1 h。

2.結果

2.1 檢測結果

LAMP檢出率為100%，檢測時間為1 h，細菌學培養檢出率為100%，檢測時間最短需24 h，RIHA檢出率低于細菌學檢驗，檢測時間為2 h，RGICA檢出率最低，檢測時間為15 min(表2)。

表2 各類動物材料檢測結果

2.2 敏感性結果

表3 LAMP與RIHA法檢測動物材料的敏感性試驗結果

1～12是不同稀釋度(40～81920)的LAMP可視化結果；13是陽性對照結果；14～15是陰性對照結果

3.討論

為考察LAMP檢測鼠疫實驗感染動物的敏感性及檢測時間，探討在鼠疫流行現場應用LAMP技術的可行性，我們在研究鼠疫菌的敏感性和特異性基礎上[2-3]，對本研究目的進行了一系列的實驗探索。RIHA試驗是目前應用廣泛的鼠疫診斷方法之一，資料表明該方法最低檢菌量是2.5～5萬個菌/mL[4]，RGICA 是6萬個菌/mL[5]，當菌量低于2.5萬個菌/mL時RIHA、RGICA檢不出陽性結果，LAMP的最低檢菌量是20個菌/mL[2]，實驗結果顯示，LAMP法檢測各種動物臟器的陽性符合率為100%，LAMP 檢出率優于RIHA、RGICA。本試驗陽性結果呈綠色，陰性對照結果為桔紅色，肉眼觀察結果清晰，易判斷。

從檢測時間來看，細菌學培養在材料新鮮情況下可做檢測且檢測時間最短(24h)，而腐敗材料或患者用過抗生素，則不能對突發的鼠疫疫情做出快速判定；RIHA試驗受反應溫度等條件制約，結果判定依賴檢驗人員專業層次及累積經驗因素的限制，最快的結果需2 h；RGICA檢測時間最短(15min)，其方法是采用鼠疫單克隆抗體作為探針，捕捉特異性的FI抗原[6]，具有較強的特異性，但敏感性不高，易漏診[7]；LAMP法的特點在于不需要特殊儀器設備，在1 h內即可觀察結果，結果直觀可靠，適合在野外疫區快速診斷。

本研究結果顯示，LAMP技術具有高度敏感性，1 h內肉眼可判讀結果，在鼠疫流行現場應用LAMP技術具有可行性。