β-E2對大鼠低氧性肺動脈高壓的改善作用

韓志富

(聯(lián)勤保障部隊第九四一醫(yī)院，西寧 810000)

女性易發(fā)原發(fā)性肺小動脈高壓 (pulmonary hypertension，PH)，具有明顯的性別差異性。已有很多研究發(fā)現(xiàn)雌激素對肺動脈具有保護作用[1，2]，但在低氧性肺動脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的發(fā)生、發(fā)展過程中，β-E2是否具有保護作用尚未定論。本研究擬明確β-E2對大鼠HPH的相關作用及可能作用機制。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠(體重：150±20g)購自蘭州大學醫(yī)學動物中心，合格證號：SYXK(甘)2018-0003。

1.1.2 儀器及試劑

JY92-II超聲波細胞粉碎儀購自寧波新芝生物儀器公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Hy-Clone公司；Eppendorf-5430型臺式超高速低溫離心機購自德國Eppendorf公司；萊卡RM224-5型石蠟切片機購自德國萊卡生物儀器公司；Motic SMZ140解剖顯微鏡購自香港MOTIC公司；ZTE-202型恒溫干燥箱購自上海器特儀器有限責任公司；M-MuLV反轉錄試劑盒購自英國Invitrogen公司；瓊脂糖及嗅化乙錠(EB)購自美國Amresco公司；β-E2購自美國SA公司；DNA Ladder Marker 2000購自西安舟鼎生物試劑有限責任公司；酶標儀購自美國POWERWAVE公司；GeneAmp 9700型RT-PCR儀購自美國Life Technologies公司；Biosens SC810型凝膠成像系統(tǒng)購自上海Biosens公司；PowerPac Basic電泳儀購自美國Bio-Rad公司?？勾笫驪27kip 1抗體購自美國Millipore公司；抗大鼠Skp-2抗體購自英國Abcam公司；抗大鼠AKT-P抗體購自美國Ce1lSignaling公司；抗大鼠p-actin抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；HRP標記的山羊-抗鼠二抗及商品化免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物試劑有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

1.2.1.1 實驗動物分組

將約200 g的成年雄性SD大鼠隨機分為常氧組和低氧組。常氧組大鼠置常氧動物室中(大氣壓強約580mmHg，PO2為120mmHg，O2濃度約為18%)中飼養(yǎng)；低氧組大鼠置低壓低氧艙(大氣壓強約為380mmHg，PO2為79.6mmHg，O2濃度約為10%)中飼養(yǎng)。

1.2.1.2 細胞培養(yǎng)分組

實驗分常氧組(Normoxia)、低氧組(Hypoxia)、β-E2干預組(10-5、10-7、10-9mol/L)。

1.2.2 大鼠PASMCs原代培養(yǎng)與鑒定

取各組大鼠原代肺小動脈平滑肌細胞行細胞貼壁法培養(yǎng)。一周后在顯微鏡下可見肺小動脈組織周圍有呈梭形的肺動脈平滑肌細胞生長(圖1 A )，且融合生長的原代PASMCs在對數(shù)期的細胞呈長梭形，且細胞形態(tài)較整齊、透光性良好，細胞群在對數(shù)期內都呈現(xiàn)渦旋狀分布 (圖1B )。通過a-SM-actin免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)多數(shù)肺動脈平滑肌細胞熒光染色為深紅色，表達為陽性(+)，說明本次培養(yǎng)的細胞就是肺小動脈平滑肌細胞，而且陽性率高達95%以上(圖1a )。

(A)PASMCs grew from lung arterial explants；(B)Confluence PASMCs(×100)(a)Fluorescence staining of a-SMA in rat PASMCs(×400)；(b)Hoechst Staining of cell PASMCs；(c)Mix picture of(a)/(b)

1.2.3 平滑肌細胞增殖實驗

將對數(shù)生長期的肺小動脈平滑肌細胞用胰蛋白酶消化混勻后，按4×104個/孔的濃度接種在96孔板中，運用血清饑餓法誘導細胞同步分裂，即先行饑餓培養(yǎng)48 h，再加入1640培養(yǎng)液(含有5%血清)和不同濃度的β-E2培養(yǎng)，在常氧條件和低氧條件下進行細胞原代培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后分別加入MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO(每孔150μL)震蕩10 min，在490 nm波長處檢測吸光度值。

1.2.4 檢測

1.2.4.1 Western Blot實驗

在1.2.3的實驗中，收集細胞后提取總蛋白，用Western Blot檢測Skp-2、P27kip1的蛋白表達水平。

1.2.4.2 RT-PCR實驗

在1.2.3的實驗中，收集細胞提取RNA后進行PCR擴增，檢測P27kip1、Skp-2的mRNA表達水平。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析使用SPSS 21.0軟件，分析各組數(shù)據間的差異性選用方差分析法，多組間的差異比較采用LSD法，視P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2.結果

2.1 β-E2對低氧環(huán)境所誘導肺小動脈平滑肌細胞增殖的影響

圖2顯示，較常氧組，低氧組肺動脈平滑肌細胞數(shù)增加了約1.5倍，說明低氧可以明顯刺激肺動脈平滑肌細胞增殖。β-E2干預組的肺動脈平滑肌細胞增殖量顯著低于低氧組，β-E2濃度為10-5mol/L時，較低氧組細胞增殖數(shù)量減少了43%，說明β-E2的干預有效減少了低氧肺動脈平滑肌細胞增殖量。

*：P<0.01，vs normoxia group.#：P<0.01，vs hypoxia group.Values are expressed as

2.2 β-E2對肺小動脈平滑肌細胞Skp-2、P27kip1表達的影響

圖3a顯示，較常氧組，經低氧刺激的細胞的P27kip 1表達水平顯著降低，Skp-2表達水平顯著升高；相比低氧組，經β-E2干預后的細胞P27kip 1、Skp-2表達水平呈下降趨勢。

圖3b 顯示，常氧組和低氧組P27kip 1轉錄mRNA的表達差異并不顯著、Skp-2表達差異顯著，說明低氧刺激對P27kip 1的表達水平未產生明顯影響。即β-E2干預對P27kip 1轉錄的mRNA的量無顯著影響，對Skp-2的表達存在影響。

2.3 β-E2對肺小動脈平滑肌細胞中的磷酸化AKT水平的影響

(a)Representative Western blotting analysis of P27kip1 and Skp-2 protein levels in rat lungs(b)Representative RT-PCR analysis of P27kip1 and Skp-2 mRNA levels in rat.*：P<0.05，vs hypoxia group.#：P<0.05，vs normoxia group

圖4顯示，低氧組肺小動脈平滑肌細胞中的磷酸化AKT的表達水平明顯高于常氧組，而經β-E2干預后，有效降低了低氧刺激后的磷酸化AKT水平。

Representative Western blotting analysis of AKT-P protein levels in cultured rat PASMCs.*：P<0.01，vs hypoxia group.#：P<0.05，vs normoxia group.Values are expressed as mean±SD(n=3)

3.討論

在HPH的發(fā)生發(fā)展過程中會出現(xiàn)肺小動脈小血管的重構，且肺小動脈血管的重構機制非常復雜，目前尚未完全闡明。已有研究發(fā)現(xiàn)在治療血管性疾病時，可以把控制細胞周期作為一個重要的方法[3]。近年來P27kip1引起了很多學者的關注，作為影響細胞周期抑制因子和表達抑癌蛋白，其具有抑制癌細胞增殖和刺激血管增生的作用[4]。Diez等研究發(fā)現(xiàn)P27kip 1具有抑制動脈粥樣硬化和血管平滑肌細胞增殖的作用[5]。由于Skp-2既是P27kip 1的降解酶，同時也是一種致癌基因蛋白，因而備受關注[6-8]。目前已經將Skp-2作為癌癥及心血管疾病的治療靶點[9-10]。本實驗結果表明，經低氧刺激后，血管平滑肌細胞P27kip 1、Skp-2和磷酸化AKT的表達增多，而采取β-E2干預后，P27kip 1、Skp-2和磷酸化AKT水平都較低氧組有了明顯改善，出現(xiàn)了表達逆轉現(xiàn)象。因此，通過調節(jié)Skp2、P27kip1、AKT信號通路抑制肺動脈肌細胞的增殖是β-E2發(fā)揮保護作用的一個可能機制。