高效液相色譜法測定飼料中膽固醇

侯林叢，劉麗芳，陸 靜，劉丹丹，蘭尊海＊

（1.河南海瑞正檢測技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院）

膽固醇又稱膽甾醇，一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，膽固醇是動物體維持正常生理活動所必需的物質(zhì)，在動物體內(nèi)經(jīng)過代謝還能轉(zhuǎn)化為膽汁酸、7-脫氫膽固醇，且7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射會轉(zhuǎn)變成為維生素D3，適量的膽固醇對維持機(jī)體正常生理功能具有重要意義。但堆積過多的膽固醇也會影響動物的健康。從20世紀(jì)80年代開始，膽固醇逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［1］。

目前膽固醇的測定方法主要有直接試劑盒法和間接試劑盒法［2］、氣相色譜法［3-6］、短波近紅外光譜法［7］、氣相色譜-質(zhì)譜法［8-12］、高效液相色譜法［13-20］、比色法［21-23］、液相色譜-質(zhì)譜法［24-27］等。其中比色法是傳統(tǒng)方法，操作復(fù)雜，所需試劑較多，結(jié)果有偏差故而不能廣泛應(yīng)用，質(zhì)譜法對儀器和人員的要求較高，在一定程度上增加了檢測的成本。該研究通過與氣相色譜法進(jìn)行試驗(yàn)比對后，在大量試驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化飼料中膽固醇的高效液相色譜法測定條件，以期為基層檢測機(jī)構(gòu)及飼料生產(chǎn)企業(yè)的檢驗(yàn)人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

e2695高效液相色譜儀，配紫外檢測器；BSA224S分析天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、甲醇（色譜純）、無水乙醚（分析純）、抗壞血酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、氫氧化鉀（分析純）；蒸餾水、高純水。

飼料原料、配合飼料、濃縮飼料等均為客戶委托檢測的樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 皂化

稱取適量樣品于250 ml 錐形瓶中，加入1g 抗壞血酸、30 ml 無水乙醇、10 ml 50%氫氧化鉀溶液，混勻，沸水浴回流40 min，期間不斷搖晃錐形瓶，防止樣品粘底。皂化完成，分別用無水乙醇和蒸餾水自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，取出錐形瓶，用冷水迅速沖涼，放置避光處。

1.2.1.2 提取

用蒸餾水將皂化液轉(zhuǎn)移至分液漏斗內(nèi)，分別用40 ml、30 ml、30 ml分3次萃取，棄去水相，合并乙醚層，用蒸餾水洗滌至中性，萃取的過程要防止損失，如產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，可加少量的乙醇進(jìn)行破乳。

智能變電站裝配式建筑造價評價問題的條件假設(shè)數(shù)學(xué)描述如下：假設(shè)智能變電站裝配式建筑工程池中有n個裝配式建筑工程造價水平待綜合評價，則可供選擇的裝配式建筑工程集為N={N1,…,Nk,…,Nn}，其中表示n個造價影響因子，影響因子權(quán)重向量表示為假設(shè)有m位專家參與裝配式建筑造價評價，則將專家集表示為S={S1,S2,…,Sm}，專家權(quán)重向量表示為

1.2.1.3 濃縮

將洗至中性的乙醚提取液通過無水硫酸鈉脫水后放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50 ℃旋蒸至近干，并回收乙醚，用甲醇轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容，并稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋?.45 μm濾膜過濾，用于高效液相色譜儀分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 mg/ml）：準(zhǔn)確稱取100 mg 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇溶解定容，搖勻配制成標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃密封避光保存，有效期6個月。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別移取一定體積的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、500 μg/ml系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待測。

2.2.3 色譜條件

C18柱，長250 mm，內(nèi)徑4.5 mm，粒徑5 μm；甲醇∶水（96∶4，V∶V）。流速1.0 ml/min。檢測波長205 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.2.4 計(jì)算公式

c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣溶液中膽固醇的質(zhì)量濃度，μg/ml；

V—試樣定容體積，ml；

m—試樣質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.1.1 皂化時間的選擇

比較了20 min、40 min、60 min 3種不同時間的皂化效率，皂化效率排序?yàn)?0 min≥40 min＞20 min，在考慮到效率的問題上，選用了40 min 作為皂化時間，3 組樣品不同皂化時間的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果見表1。

表1 不同皂化時間的結(jié)果（n=3）

3.1.2 提取溶劑的選擇

該方法選用同一樣品，采用相同的皂化時間平行測定3次，比較正己烷、無水乙醚、石油醚等3種提取溶劑的影響，發(fā)現(xiàn)提取溶劑對回收率的影響較大。使用正己烷時，回收率較低；無水乙醚和石油醚的回收率基本一致，但使用石油醚作為提取溶劑時，樣品分層較慢，且容易乳化，耗時較長。綜合考慮，選擇無水乙醚作為提取溶劑。不同提取溶劑的回收率及RSD結(jié)果見表2。

表2 不同提取時間的結(jié)果（n=3）

3.1.3 流動相的選擇

該研究使用甲醇∶水（96∶4，V∶V）、甲醇、乙腈∶水（96 ∶4，V ∶V）3 種流動相對標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液進(jìn)行分離測定，通過調(diào)節(jié)流動相中各組分的比例，使流動相的極性發(fā)生變化，改變分離效率。結(jié)果表明，不同流動相的色譜峰保留時間及峰型各有不同，當(dāng)流動相為甲醇∶水時，色譜峰峰型較好，保留時間為21 min左右，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖見圖1、圖2。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 膽固醇樣品溶液色譜圖

3.2 方法線性和檢出限

分別移取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液注入高效液相色譜儀中，以其濃度值為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。濃度范圍在10.0～500.0 μg/ml時，溶液濃度和色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，Y=3092X+4394.4，r2=0.9995。

取空白樣品，按照樣品處理程序處理后上機(jī)測定。另取多份空白樣品，加入不同的較低濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照樣品處理程序處理后上機(jī)測定，對比結(jié)果，將引起3 倍信噪比時的濃度定義為方法檢出限，當(dāng)樣品稱樣量為5 g時，該方法檢出限為1.0 mg/kg，方法靈敏度較高。

3.3 方法精密度

選取飼料原料（雞腸粉）、豬配合飼料、豬濃縮飼料等3 種不同的飼料產(chǎn)品進(jìn)行精密度試驗(yàn)（n=6），測定結(jié)果見表3，可以看出，3種不同飼料產(chǎn)品的RSD均不大于5.0%，說明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表3 精密度測定結(jié)果（n=6）

3.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

取不同基質(zhì)的空白樣品為本底樣品，分別添加2.0 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg 3個不同濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照該方法進(jìn)行試驗(yàn)操作，平行測定3 次，回收率在88.6%～93.2%之間，RSD 為0.89%～3.65%，方法回收率較高，詳見表4。

表4 回收率測定結(jié)果（n=3）

3.5 不同方法結(jié)果的比較

利用該研究建立的方法針對同一樣品與現(xiàn)有的氣相色譜法進(jìn)行了結(jié)果比較，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，兩種方法結(jié)果差異不顯著。

表5 兩種方法的檢測結(jié)果

4 結(jié)論與討論

該研究建立了飼料中膽固醇的高效液相色譜測定方法。通過對皂化時間、提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，分別對飼料原料、配合飼料、濃縮飼料等3 種不同的飼料樣品進(jìn)行了精密度、準(zhǔn)確度及靈敏度試驗(yàn)，測得6 組數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.64%～2.09%，不同添加量的平均回收率為88.6%～93.2%，方法的檢出限為1.0 mg/kg。優(yōu)化后的方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、基質(zhì)干擾小。通過實(shí)際樣品的檢測，說明該方法有較廣泛的適用范圍。