大鯢膠原蛋白肽制備工藝的優化

于 洋，王東方，王 欣，白義化，邢曉明，馮 靜

（威海市宇王集團海洋生物工程有限公司，山東威海 264200）

大鯢又稱娃娃魚，是世界上現存兩棲類動物中壽命最長的動物。野生大鯢作為我國珍稀名貴特產，已被列為國家二級保護動物[1-2]，經現代營養成分分析研究結果表明：其含有18種氨基酸，是人體營養需求的優質蛋白源，具有極高的營養價值和藥用價值，被譽為“水中人參”[3]。大鯢喜棲息于山區清澈溪流以及山溪的石隙間，洞穴位于水面以下。其是中國特有物種，產于華北華中、華南和西南各省。近年來，由于人為因素，尤其是生存環境喪失、棲息地破壞以及過度利用，使野生大鯢物種數量銳減，大鯢的分布區成倍縮小。其生存地點多為人們難以達到的石灰巖溶洞或者地下暗河。溶洞或者暗河這些惡劣的環境下，大鯢生存受到嚴峻的脅迫?，F因國家批準許可小部分養殖專業戶利用人工養殖子二代以下的個體進行科研、加工和利用，故涌現大量人工養殖和馴化大鯢的景象。目前，大鯢主要被粗加工成菜肴，但大鯢的深加工產品寥寥無幾。所以為了充分有效地開發利用人工養殖子二代大鯢和提高其附加值，其營養價值等問題的研究非常重要。

膠原蛋白廣泛存在于自然界的動物組織中，并且具有重要的作用。因其結構的多樣性和良好的生物相容性，在日常生活中，膠原蛋白被廣泛地應用于食品、化妝品、生物醫學等領域，而它的生產來源主要依賴于陸地生物（主要為豬和牛）。由于氨基酸組成和交聯度等方面的差異，使得大鯢所含有的豐富膠原蛋白具有很多牲畜膠原蛋白所沒有的優點，例如大鯢膠原蛋白肽具有膠原蛋白含量高、分子量低、生物污染物少和毒素微量、低抗原性、低過敏性等優點。傳統大鯢膠原蛋白肽提取工藝是先將大鯢經過高溫提取，在最適pH條件下，加入適量的酶解劑，進行酶解提取，即成肽，完成后進行精細過濾；濾液進入蒸發濃縮系統濃縮脫水，經濃縮后的液體達到一定濃度后，進入噴霧干燥設備，所得粉末即為大鯢膠原蛋白肽。但是這樣制得的傳統大鯢膠原蛋白肽，過濾傳統工藝有以下缺點：①提取液體積較大，產品的生產周期較長；②酶解液除雜不徹底，影響產品品質；③所得成品往往具有苦腥味，口感差?；诖?，本文以人工養殖子二代大鯢為原料，對大鯢膠原蛋白肽的工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢，威海市宇王集團海洋生物工程有限公司提供；水解蛋白酶（40萬U/g）、中性蛋白酶（20萬U/g）、風味蛋白酶（10萬U/g），諾維信（中國）生物技術有限公司。

膠原蛋白肽生產線，威海市宇王集團海洋生物工程有限公司；生物膜過濾系統，合肥科佳高分子材料科技有限公司；高效液相色譜儀，日本島津公司；恒溫干燥箱，上?，槴\實驗設備有限公司；超聲水浴箱，昆山美美超聲儀器有限公司；超聲波振蕩器，昆山美美超聲儀器有限公司；分析天平，奧豪斯儀器常州有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鯢膠原蛋白肽制備工藝的優化

本研究在前期研究的基礎上，針對大鯢膠原蛋白肽質量不高、純度低、異味重、過敏原難去除以及分子量分布不均等許多共性問題和難題，精確研究分子量均一可控的酶解關鍵技術，以及生物膜過濾純化核心配套技術，實現規?；a高純度、高效率、低能耗、分子量均一可控的大鯢膠原蛋白肽產品自主創新技術。大鯢膠原蛋白肽提取優化工藝為人工養殖子二代大鯢→宰殺去膽囊和脂肪組織→預處理→脫脂→絞碎→提取→酶解催化→脫腥脫味→多級生物膜過濾分離技術→濃縮→噴霧干燥。

1.2.2 試驗步驟

①樣品處理：將活的人工養殖子二代大鯢停食數天使其排空腸道，再宰殺，去膽囊和部分脂肪組織。②預處理：將大鯢清洗干凈，并切成1～3 cm大鯢塊，備用。③脫脂：用氫氧化鈉溶液對大鯢塊進行脫脂處理，脫脂溫度為20～25 ℃，時間1 h。④絞碎：將脫脂后的大鯢塊投入絞肉機中，絞成肉糜。⑤提?。簩⒚撝幚砗蟮拇篥F塊加水提取，提取過程中控制溫度95～100 ℃，熬煮時間1 h。⑥酶解催化：待提取液冷卻后，加入水解蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶組成的復合蛋白酶進行酶解。酶解溫度為50～55 ℃，酶解時的pH控制在7.5～8.5左右，酶解時間4 h。⑦滅活：酶解完成后將酶解液升溫滅活，滅火溫度為90～100 ℃，滅火時間20～30 min。⑧脫腥脫味：將酶解液經過多級過濾后，加入活性炭和助濾劑進行脫炭處理30 min，得到澄清透亮的大鯢酶解液。⑨多級生物膜過濾分離技術：在常溫下對物料進行有效的過濾，分離時不發生相變化，適用對膠原蛋白肽進行分離，去除雜質、菌絲。對于大鯢酶解液中分子量為150～1 000 Dalton小分子肽有分離性能；對于無機鹽的分離則存在Donnan效應。⑩濃縮：利用雙效濃縮器對大鯢膠原蛋白肽液進行濃縮。?離心噴霧：離心噴霧干燥得到大鯢膠原蛋白肽粉。

2 結果與分析

工藝改進前后生產的大鯢膠原蛋白肽的分子量如圖1、圖2所示。傳統工藝生產的大鯢膠原蛋白肽相對分子量小于1 000 D的水解物所占比例為36.2%；而水解物中≥80%的肽段相對分子質量為643.7，如表1所示。工藝改進后生產的大鯢膠原蛋白肽中相對分子量＜1 000 D的肽段占比達到95.04%，≥80%肽段的相對分子質量為317.14，如表2所示。因此，通過多級逆流萃取技術和納濾膜分離技術的共同改進，生產出的大鯢膠原蛋白肽粉的分子量由原來的1 000 D～2 000 D變成現在均一穩定、易于人體吸收且低于1 000 D的低聚肽。高溫催化、風味酶的添加、管膜、納濾膜過濾等方法避免了膠原蛋白肽在酶解過程中產生的苦味肽，使得現在生產的大鯢膠原蛋白肽的口感更優，并且無明顯的腥苦味，為以后以大鯢膠原蛋白肽為基礎生產不同劑型的保健品、飲品、糖果等提供了保障，可滿足不同客戶人群的需求。

圖1 傳統工藝生產大鯢膠原蛋白肽的分子量分布圖

圖2 工藝改進后生產大鯢膠原蛋白肽的分子量分布圖

表1 傳統工藝生產大鯢膠原蛋白肽分子量分布范圍

表2 工藝改進后生產大鯢膠原蛋白肽分子量分布范圍

3 結論

本研究采用堿處理對大鯢進行脫脂預處理，通過三重生物酶復合酶解和多級逆流固液萃取技術以及生物濾膜過濾技術，將原來分子量大部分為1 000～2 000 D的大鯢膠原蛋白肽更新為分子量在1 000 D以下的低分子量的產品，獲得了高純度、無異味、易于人體吸收的低分子量的大鯢膠原蛋白肽，為不同人群、不同需求供應不同產品提供了技術支持。并且有文獻記載，小分子量多肽更有利于人體吸收和抗氧化活性的增強［4-5］，這表明大鯢活性肽作為保健食品具有潛在的優勢。

經過提取工藝的改進和采用多級生物膜過濾分離技術，大鯢膠原蛋白肽的分子量由原來小于1 000 D的蛋白質水解物所占比例為36.2%轉變為現在95.04%。解決了大鯢膠原蛋白肽產品質量不高、純度低、異味重、過敏原難去除以及分子量分布不均等許多共性問題和難題，實現了規?；a高純度、高效率、低能耗、分子量均一可控的大鯢膠原蛋白肽產品自主創新技術。