一株洱海來源產尿酸氧化酶菌株的分離、鑒定及其酶學性質研究

楊潤芬， 楊力權， 劉紅艷， 李 蕾， 李馨偉， 桑 鵬， 尹以瑞

（大理大學農學與生物科學學院，云南大理 671003）

尿酸為三氧基嘌呤（C5H4N4O3)，是生物體嘌呤代謝的產物，微溶于水，易形成晶體，過高的血尿酸濃度對機體來說是有害的， 尿酸代謝不平衡會導致痛風、 腎結石和血管類等疾病 （孫澤銳等，2021) 。 尿酸氧化酶作為生物體內嘌呤降解代謝途徑的關鍵酶， 能催化尿酸氧化為尿囊素和過氧化氫。 許多生物，如狒狒、豬等，都能利用尿酸氧化酶將其分解為易溶于水的尿囊素（熊潤松等，2012），尿囊素在體內具有良好的溶解性， 溶解度是尿酸（0.5 mmol/L，37 ℃） 的 5 ~ 10 倍， 約為 5 mmol/L（37 ℃），不發生積累而直接排出體外（Bosly 等，2003；章茹等，1997）。

尿酸氧化酶在自然界廣泛存在，動物、植物、真菌和細菌中均有發現（張金龍等，2010；劉勁等，2008）。 目前上市的尿酸氧化酶藥物有豬-狒狒尿酸氧化酶嵌合體和重組黃曲霉尿酸氧化酶兩種， 而國內還鮮見有進入臨床的尿酸氧化酶類藥（張榮欣等，2008）。 有研究表明，微生物如鼠李糖乳酸桿菌（L.rhamnosus）經過誘導后具有較強的尿酸降解能力（黃琳秋等，2016），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）基因組中含有尿酸氧化酶基因（張曉暉，2019；白運煥等，2018）。 其中， 微生物來源的尿酸氧化酶如Aspergillus flavus （葉澤，2019） 和 Bacillus fastidiosus（Roda等，2006），活性均在 10 U/mg 以上，而來自豆類植物的尿酸氧化酶活性為2 ~ 6 U/mg （ Montalbini 等，1999），來自哺乳動物的尿酸氧化酶如豬和狒狒的活性分別為5 U/mg 和1 U/mg（陳勁春等，2015；Kelly 等，2001）。 微生物來源的尿酸氧化酶活性明顯高于其他來源，因此，微生物成為了新的尿酸氧化酶的重要來源。

本研究以云南大理洱海底泥為試驗材料，經過富集培養、篩選分離出尿酸降解菌，并對所獲得的一株尿酸降解菌進行發酵培養， 獲得胞內的酶進行酶學性質研究， 旨在為今后洱海尿酸氧化酶的研究和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本次試驗樣品來自大理洱海，在采樣點 （N25°36′ ~ 25°58 ′，E100°06′ ~ 100°18′）采集20 g 底泥作為試驗材料。

1.2 培養基及試劑

1.2.1 培養基 尿酸基礎培養基（g/L）：MgSO40.5，NaCl 0.1，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO20.5，尿酸2，pH 7.0；固體分離培養基添加 2% 的瓊脂。

產尿酸氧化酶發酵培養基（g/L）：蛋白胨10，蔗 糖 20，NaCl 0.5，MgSO41，KH2PO41，FeSO4·7H2O 0.01，尿酸 1.5，pH 7.0。

1.2.2 試驗儀器 電子分析天平、 高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；艾柯超純水生成儀、紫外可見光分光光度計（上海菁華儀器公司）；高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器公司）；SPX-250B-D 型恒溫振蕩培養箱 （上海一恒科學儀器有限公司）；Eppendorf PCR 儀、BIORAD 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 產尿酸氧化酶菌株的富集與篩選 取10 g洱海底泥樣品，加入到尿酸基礎培養基中，振蕩富集培養3 d。 梯度稀釋分別做5 個稀釋梯度，分別稀釋 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5后涂布于含有尿酸基礎培養基上培養，挑選單菌落，轉接到尿酸氧化酶發酵平板中進一步純化， 獲得一株純培養菌株保存于甘油管凍存，待用。

1.3.2 菌株生長和胞內、 胞外尿酸氧化酶活性檢測 挑取上述產尿酸氧化酶菌株單菌落接種于200 mL 的尿酸發酵培養基中，25 ℃、180 r/min振蕩培養， 每隔12 h 取發酵液檢測菌體濃度（OD600nm）和發酵液中尿酸的殘余量（OD290nm）。 每次檢測取1 mL 發酵液用于測菌體濃度， 取50 mL發酵液8000 g，室溫離心20 min 取上清發酵液為胞外酶，并測發酵液尿酸含量，收集菌體加50 mL PBS 緩沖液（pH 8.0）懸浮后超聲波破碎 20 min，裂解液在4 ℃、12000 g，離心 20 min，取裂解上清液為胞內酶。 以濃度為0.06 mmol/L 的尿酸為底物，加入50 μL 粗酶液，反應 15 min 后使用紫外光分光光度計測定OD290nm吸光值。酶活力計算公式如下：

1.3.3 產酶菌株16S rRNA 基因測序及鑒定 收集尿酸降解菌純培養菌體，根據北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進行DNA 的提取。 使用通用引物 27F：5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R：5 ’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’擴增細菌 16S rDNA。PCR 擴增條件為：預變性 94 ℃，4 min；變性 94 ℃，30 s；退火55 ℃，35 s；延伸 72 ℃，90 s；32 個循環后，最后延伸 72 ℃，5 min。 PCR 產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 使用膠回收試劑盒進行PCR 產物回收。 將PCR 回收產物送至昆明擎科生物科技有限責任公司進行測序， 測序結果上傳至 GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）， 并在 BLAST 數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行比對， 根據細菌 16S rRNA 基因序列相似性， 利用MEGA 7.1 軟件進行系統進化分析。

1.3.4 最適反應溫度的測定 以0.06 mmol/L 的尿酸為底物，加 50 μL 粗酶液，分別在 20、25、30、35、40、45、50、55 ℃下測該酶的活性，每組試驗設置 3個平行試驗組，一個對照組（加入100 ℃高溫酶活酶），反應15 min 后分別測定在OD290nm的吸光度值。

1.3.5 最適反應pH 用不同的pH 緩沖液（pH 3~8 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 8 ~ 9 甘氨酸-NaOH 緩沖液） 溶解尿酸至濃度為0.06 mmol/L，在最適溫度下反應15 min 后，測OD290nm的吸光度值。

1.3.6 溫度和pH 對粗酶液穩定性的影響 將1 mL粗酶液分別置于不同的溫度（30、35、40 ℃）下保溫， 在保溫 20、40、60、80、100、120 min 時測定酶活。以保溫0 min 溫度下所測得的酶活為對照組，其余溫度下所測得的酶活與其相比， 并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩定性曲線。每組試驗設置3 個平行。

取適量0.5 mL 粗酶液分別加入1.5 mL 不同pH 緩沖液（pH 3 ~ 10）孵育 12 h 或 24 h 后作為反應的酶液加入反應體系中， 以生理鹽水（0.9%NaCl）稀釋的粗酶液作為對照組。在最適溫度下反應15 min，測吸光度值。

2 結果

2.1 菌株生長與發酵液中尿酸的降解 在發酵培養基中培養，DLEH-68 的生長情況（OD600nm）和對尿酸的降解情況（OD290nm）如圖1 所示。 結果表明，隨著菌體量增加，尿酸逐漸被降解；培養前36 h 菌株DLEH-68 處于對數生長期， 尿酸含量迅速下降；至48 h 時，菌株進入穩定期，尿酸含量趨于穩定。 這說明菌株DLEH-68 能產生尿酸降解相關酶，利用尿酸提供生長所需碳源和氮源。

圖1 菌體生長與尿酸降解

2.2 胞內、 胞外尿酸氧化酶活性測定 如圖2 所示，胞內的活性無論在各個培養時間段（12~48 h）都高于胞外，胞內的活性在培養12 h 時最高，由此確定該菌株所產尿酸氧化酶以胞內酶為主，12 h時活性達到最高。

圖2 不同培養時間胞內和胞外尿酸氧化酶活性

2.3 菌株DLEH-68 分子生物學鑒定 通過16S rRNA 序列通用引物PCR 和測序， 獲得1437 bp 16S rRNA 基因核苷酸序列， 序列在線上傳至GenBank， 登錄號：NO.MW090727， 與菌株 Klebsiella oxytoca N8 （登錄號：KM349413.1）親緣關系最近，同源性為 99.65%（圖 3），基于 16S rRNA 序列同源性構建系統進化樹， 菌株DLEH-68 與Klebsiella 屬聚在一枝，故通過分子生物學鑒定該菌株為克雷伯氏菌屬菌株， 命名為Klebsiella sp.DLEH-68。

圖3 基于16S rRNA 序列同源性構建菌株DLEH-68 的系統進化樹

2.4 最適溫度和pH 如圖4a 所示， 菌株DLEH-68 來源尿酸氧化酶的最適溫度為35 ℃。 在20 ℃時基本無活性，隨著溫度升高活性漸漸的增長，在35 ℃時達到最高， 隨后逐漸降低直至55 ℃徹底失去活性。 如圖4b 所示，其最適反應pH 為7.0，在pH 3.6 開始有活性，越接近中性pH 活性越高，在pH 7.0 時達到最高，pH>7.0，活性逐漸降低，在pH 6.6 ~ 7.6 保持60%以上。

圖4 溫度（a）和 pH（b）對菌株 DLEH-68來源尿酸氧化酶活性的影響

2.5 溫度對酶穩定性的影響 在30、35、40 ℃三個溫度下熱處理， 結果如圖5 所示，35 ℃下處理20 min 后達到最高， 隨著熱處理時間的延長，活性逐漸降低，在處理80 min 時降低至60%并處于穩定至100 min， 在處理120 min 后急劇下降至13%。 在溫度為30 ℃和40 ℃下熱處理酶喪失活性的速度較快， 在處理60 min 后均下降至75%，隨著處理時間的延長，40 ℃下下降的最快，30 ℃下降速率較慢，當處理120 min 后降至30%。

圖5 溫度對菌株DLEH-68來源尿酸氧化酶穩定性的影響

2.6 pH 對酶穩定性的影響 菌株DLEH-68 來源尿酸氧化酶分別在pH 3 ~ 10 中處理12 h 和24 h，結果如圖 6 所示。 在處理 12 h 后，該酶從pH 3 開始有活性，pH 越接近中性活性越高，并在中性pH 7 時達到最大， 有最初的43%升高到92%， 之后隨 pH 從 7 升高到 10， 酶活性逐漸降低，在 pH 10 時降至 40%。 在處理 24 h 后，pH 3、pH 3.6 均沒有活性，從pH 4 開始有35%的活性，也是隨著pH 越接近于中性，酶活性越高，但都低于處理12 h 的活性。 在pH 7 ~ 10， 活性逐漸降低，當pH 到10 時活性降到14%。

圖6 pH 對菌株DLEH-68來源尿酸氧化酶穩定性的影響

3 討論

尿酸氧化酶作為治療高尿酸癥的最有發展優勢和最具有潛力的一類藥， 越來越受到人們的重視和關注， 而微生物具有易于培養和代謝類型多樣的特點。由此產生很多對人類有益的代謝產物，是尿酸氧化酶的一個重要來源，為現代醫藥的發展做出了重大貢獻。 對現有微生物資源進行高通量篩選， 有可能找到性能上更適合醫藥應用的酶（咸靜女等，2018；張玉然等，2016）。 近年來不斷有研究在挖掘和探究產尿酸氧化酶的細菌、真菌，目前已知的產尿酸氧化酶微生物有產朊假絲酵母屬，芽孢桿菌屬，曲霉屬，微桿菌屬，節桿菌屬等（ 薛璟等，2011；程新等，2009）。有報道表明Klebsiella pneumoniae 來源的尿酸氧化酶是一種新型的黃素腺嘌呤二核甘酸（FDA）依賴的尿酸氧化酶 （Hpxo）（Hicks 等，2013；Katherine等，2009）。 這預示著菌株 Klebsiella sp. DLEH-68 來源的尿酸氧化酶可能也是一種FAD 依賴的尿酸氧化酶，在檢測其活性過程中，所需FAD可能來自細胞裂解液。

本研究從洱海底泥篩選出的這株尿酸降解菌， 通過發酵發現其為產尿酸氧化酶菌株-克雷伯氏菌（Klebsiella sp. DLEH-68），對其活性進行試驗測定， 最終確定獲得的降解尿酸胞內酶的最適pH 為7， 最適溫度為35 ℃， 處于人體體溫范圍， 對未來開發用于痛風病人的臨床診斷與注射治療有很大的潛力和研究價值。