內質網應激信號轉導通路在肺癌發病中的作用研究進展

王菊 張龍舉

內質網是蛋白質合成、運輸、修飾的主要場所，內質網的正常功能對細胞具有重要的意義。許多異常環境均會干擾內質網功能，誘導內質網應激，近年來，有關內質網應激與腫瘤發病相關性也成為研究的熱點之一。肺癌是世界上發病率和死亡率最高的腫瘤，嚴重影響著人們的健康，本文就內質網應激及信號轉導通路在肺癌發病中的作用進行綜述。

內質網概述

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞內最大的膜網格結構，其膜占細胞總膜的一半以上。內質網可分為粗面內質網(rough endoplasmic reticulum stress，RER)和滑面內質網(smooth endoplasmic reticulum stress，SER)。粗面內質網上富含核糖體，主要負責加工蛋白質，越是功能活躍的細胞粗面內質網越發達；滑面內質網主要具有解毒功能。

內質網應激

蛋白質代謝是生命活動的基本過程，內質網是蛋白質合成和加工的場所，是細胞“最大的加工廠”，可精確控制蛋白質運輸全過程，還可處理細胞信號，它的正常功能對細胞至關重要[1]。許多異常狀態，如葡萄糖饑餓、細胞內鈣異常、糖基化修飾紊亂、氧化還原紊亂、缺乏分子伴侶或細胞能量、蛋白質變異和二硫鍵減少等，都會干擾內質網功能，誘導內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)從而影響內質網蛋白質的正確折疊，激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)[2]。未折疊蛋白反應是由內質網腔內未折疊或錯誤折疊的蛋白質超載所引起，是內質網應激的經典信號轉導途徑[2-3]。多項研究表明，UPR與多種疾病發生、發展有關，如肝臟疾病、肺部疾病、心血管系統疾病、糖尿病、神經系統退行性病變、慢性炎癥以及腫瘤[4-6]。

內質網應激信號轉導途徑在肺癌中的作用

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人類生命健康。腫瘤細胞常處于缺血、低氧、營養物質不足等惡劣的條件下，導致內質網未折疊或錯誤折疊蛋白積聚引起內質網應激，使腫瘤細胞耐受外界異常環境；通常內質網應激啟動未折疊蛋白反應以細胞恢復穩態，但持續嚴重的內質網應激可以誘導腫瘤細胞凋亡。目前研究表明，多種天然植物化合物具有抗癌作用，且大多數通過誘導內質網應激發揮作用[7-8]。其作用可通過激活內質網應激的三條通路或者激活單條分支通路。

內質網應激可引起三種不同反應，即未折疊蛋白反應、內質網超負荷反應(endoplasmic reticulum-overload response，EOR)和固醇調節級聯反應。前兩者均可由未折疊或錯誤折疊蛋白質在內質網蓄積所致，內質網超載反應還可由正常蛋白異常積聚引起。甾醇級聯調節反應是由內質網表面合成的膽固醇損耗竭所致。UPR是研究最廣泛的途徑。

內質網非應激狀態下，內質網膜上的GRP78與三種跨膜蛋白結合，即活化轉錄因子6(activating transcription factor，ATF6)、蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase1ike ER kinase，PERK) 以及肌醇需求酶1( inositol requiring enzyme 1，IRE1)。當異常環境刺激細胞誘導內質網應激時，GRP78與三者分離并激活，誘導相應的靶基因，引起一系列生理病理反應。

一、PERK信號轉導通路在肺癌中的作用

當內質網處于應激狀態時，PERK與BIP/GRP78分離，分離的PERK蛋白形成同源二聚體并自身磷酸化激活，與真核生物起始因子2( eukaryotic initiation factor 2，eIF2) 結合并使 eIF2α磷酸化。磷酸化eIF2α可促進轉錄激活因4( activating transcription factor 4，ATF4) 的mRNA表達升高， PERK也會激活CCAAT增強子結合蛋白( C/EBP homologous protein，CHOP) 和細胞生長抑制與DNA損傷誘導基因( growth-arrest and DNA damage-inducial gene 34，GADD34) 等蛋白的表達[9]，引起一系列生理過程。

多項研究表明，PERK通路在肺癌中具有多種作用。Zhu Jie[10]等的研究中，甘草次酸(GA)以劑量-時間依賴方式抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，伴有內質網應激相關蛋白GRP78、PERK表達水平增加，使肺癌細胞阻滯在G0/G1期，但未誘導細胞凋亡，提示其誘導內質網應激抑制細胞增殖，機制可能是激活PERK分支通路。另外，Xie Wenyue[11]等的研究中發現酸性環境通過ROS依賴方式誘導未折疊蛋白反應并激活自噬，對肺癌細胞具有保護作用，伴隨著內質網應激相關蛋白GRP78、PERK、IRE1以及XBP1蛋白水平的增加。然而，Zhang Qicheng[12]等的研究提出，異硫氰酸芐酯誘導內質網應激，通過上調PERK、eIF2α以及鈣離子水平，激活自噬增強其對肺癌細胞的生長抑制作用。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是一種有潛力的抗癌藥物，大多數癌癥對其誘導的凋亡具有耐藥性，但Kim Eun Ok[13]等的研究中發現丹參酮IIA分別通過選擇性激活內質網應激中PERK/ATF4通路，上調DR5和CHOP而增加TRAIL誘導的肺癌細胞死亡，提示丹參酮IIA作為增敏劑可通過內質網應激PERK/ATF4通路發揮抑制作用。Kim Ju Yeon[14]等人的研究中，提出β-不飽和苦鬼臼脂素(β-apopicropodophyllin，APP)有望成為一種新型的抗癌藥物，其對A549、NCI-H1299、NCI-460細胞具有抑制增殖的作用，通過上調BiP、 磷酸化PERK、磷酸化eIF2α、CHOP 以及 ATF4蛋白表達水平，表明其抗癌活性也通過內質網應激途徑所發揮。此外，Di Shouyin[15]等人提出，Butein以劑量依賴的方式降低了NSCLC細胞的活力，抑制NSCLC細胞增殖，同時降低了A549和PC-9細胞的粘附能力、遷移能力和侵襲能力，誘導肺癌細胞阻滯于G2/M期，促進細胞凋亡；此外，Butein處理明顯上調了PERK、eIF2α、ATF4、CHOP以及ROS的表達，同時IRE1α和XBP1的表達略有增加，抑制內質網應激可削弱Butein的促凋亡作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ亞型(PPARγ)起到強大的抗癌作用，抑制腫瘤的生長。Kim Tae Woo[16]等人研究發現PPZ023(一種新型的PPARγ配體)降低NSCLC細胞活力，通過PERK -eif2α-CHOP軸在NSCLC細胞裂解液和外泌體中引起細胞死亡，而沉默PERK和CHOP可顯著阻斷內質網應激介導的細胞凋亡。

PERK是未折疊蛋白反應的經典通路，是內質網應激發揮作用的必須通路，幾乎所有內質網應激的生理過程均涉及激活PERK通路。CHOP是內質網應激誘導凋亡的一個關鍵分子，也是發生內質網應激時的一個特異轉錄因子。內質網應激三條通路均可誘導CHOP，但PERK-eIF2α-ATF4是誘導CHOP所必需的[17-18]。

二、IRE1信號轉導通路在肺癌中的作用

在生理條件下，IRE1α與GRP78結合處于失活狀態，當細胞發生內質網應激時，IRE1α與GRP78分離，IRE1α二聚化并自磷酸化，通過其RNase活性和其激酶活性激活多個下游細胞內信號轉導途徑。 IRE1α激活后可剪切XBP1 mRNA形成產生一個全新的剪接mRNA。切割后的 XBP1 mRNA翻譯出具有活性的XBP1蛋白質，增加內質網折疊蛋白質的能力以適應壓力狀態[19-20]。強烈刺激時，IRE1α也會激活受調控的IRE1依賴性衰減(IRE1-dependent decay, RIDD)以及caspase4或caspase12、ASK1和JNK誘導細胞凋亡[21-22]。

IRE1是哺乳動物中最保守的未折疊蛋白反應通路，最先在酵母菌中發現。Drogat Benjamin[23]等人的研究中發現，IRE1可在低糖、低氧環境中上調血管生成因子的表達，促進肺癌A549、U87、C6等細胞存活，IRE1α缺失的細胞可以抑制低糖低氧引起的 VEGF-A的分泌，使腫瘤血管新生能力降低，抑制腫瘤生長。另外，Hung Jen Yu[24]等人的研究發現天然化合物倍半萜內酯去氫木香內酯(DHE)可抑制人非小細胞肺癌細胞A549、NCI-H460和NCI-H52細胞的增殖，伴隨PERK磷酸化、IRE1、CHOP上調， XBP-1 mRNA剪接，以及IRE1 miRNA轉染抑制DHE介導的細胞凋亡。此外，Joo HyeEun[25]等人研究發現，Arjunic acid對非小細胞肺癌A549和H460細胞具有細胞毒性，顯著增加G1細胞的數量，通過激活Bax和c-JNK磷酸化，并上調IRE1α、ATF4、p-eIF2α和 CHOP的表達。相反，JNK抑制劑SP600125阻斷了Arjunic acid誘導的細胞毒性和IRE1和CHOP上調。表明arjunic acid抗癌活性依賴于JNK介導的IRE1信號轉導通路、。而樓招歡[26]等人研究表明，丹參二萜醌以濃度依賴地促進肺癌細胞凋亡，上調Bip，TRAF2蛋白表達，也上調 Bax、IRE1α、caspase-12的表達水平。提示丹參二萜醌抗肺癌作用與活化ERS介導的IRE1α/caspase-12 凋亡通路有關。然而，Tavernier Quentin[27]等人發現在NSCLC患者中sXBP1 mRNA轉錄水平與腫瘤的大小、程度和腫瘤的分期呈正相關，表明IRE1-XBP1軸的活性與腫瘤的生長平行增加，提示腫瘤內XBP1 mRNA的IRE1剪接活性可能影響腫瘤表型，影響腫瘤的侵襲性和預后。且在NSCLC患者中IRE1-sXBP1軸可調控EMT轉錄因子的表達，這表明IRE1-sXBP1軸可能參與了NSCLC的部分EMT過程，即IRE1下游信號可以作為部分EMT計劃的調節因子。

Caspase-12是caspase家族(天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶家族)的一員，多項研究表明，caspase-12是獨立于線粒體凋亡途徑、死亡受體介導的凋亡途徑的第三大凋亡途徑，且是內質網應激特有的凋亡途徑。IRE1是誘導caspase-12促發凋亡的必要途徑，因此，IRE1對內質網應激調控細胞凋亡非常重要，在抗癌治療中有重要開發意義。

三、ATF6信號轉導通路在肺癌中的作用

ATF6的C端位于內質網腔內，具有多個GRP78結合位點和兩個高爾基體定位信號。在非應激情況下，ATF6α的C端與GRP78結合，使其停留在內質網膜上。當發生內質網應激時，GRP78從ATF6α上解離并促進蛋白質折疊。釋放出ATF6α轉移到高爾基體，由高爾基體蛋白酶(S1P、S2P)對其進行剪切，產生活化的 ATF6α，活化的ATF6α移位至細胞核激活URP靶基因的啟動子[28]。ATF6 可以調控相關轉錄因子的表達，如激活CHOP的轉錄以誘導細胞凋亡和激活未剪接的X盒結合蛋白( X-box binding protein1，XBP1) 的表達，從而與 IRE1α通路進行聯系。

ATF6信號轉導通路也是內質網應激中的重要的一條分支通路。劉啟歐[29]等人提出，益氣除痰方可抑制肺癌A549細胞生長，與順鉑聯用能起到增效作用，其機制可能是通過下調內質網應激反應相關蛋白ATF6、XBP1蛋白的水平，提示內質網應激ATF6信號轉導通路具有促進肺癌細胞生長的作用。布雷菲德菌素 A (Brefeldin A，BFA)是真菌產生的一種大環內酯類抗生素，具有抗菌、抗癌等多種活性。耿娜娜[30]等人則表明Brefeldin A聯合順鉑明顯抑制肺癌GLC-82細胞的增殖，伴隨著GRP94、ATF6蛋白表達水平的增高。另外，Ogata Sho[31]等的研究認為ATF6、GRP78蛋白水平從低級別到高級別非典型腺瘤性增生(AAH)再到肺腺癌(ACA)逐漸增加，同時ATF6蛋白和XBP1蛋白的細胞質IHC染色從低級別到高級別AAH，再到ASA均顯著升高，且ATF6蛋白核表達的細胞數在ACA組高于低級別AAH組。因此，有理由認為ATF6蛋白的激活發生在ACA的發展過程中，并與肺腺瘤-癌序列的進展平行。此外，ATF6蛋白的核表達可能是鑒別非典型腺瘤樣增生和反應性增殖的有用工具。具有靜息樣表型的慢周期癌細胞(SCCs)被認為是導致癌癥復發和進展的重要原因。此外，Cho Jaebeom[32-33]等研究表明在建立化療后殘留的非小細胞肺癌細胞具有SCCs特征的模型中， ATF6可誘導表皮生長因子(EGF)上調，促進血管形成，刺激肺癌細胞遷移和形態變化，從而引起腫瘤復發，相反拮抗ATF6可有效抑制SCCs介導的這些作用，抑制化療后腫瘤復發。這些結果表明，SCCs中的ATF6-EGF信號軸能夠觸發化療后殘留腫瘤的血管生成開關，導致腫瘤復發。表明ATF6通路在肺癌的轉化、復發中具有重要作用。

未折疊蛋白反應的三條通路并不是獨立存在的，而是相互依賴、相互聯系的，共同調節細胞的生理病理過程。由于腫瘤細胞的特異性，常處于應激狀態，因此內質網應激可能是抗癌的新興途徑。且越來越多研究表明，植物提取物及中藥復方制劑在抗癌方面逐漸嶄露頭角，通常在腫瘤治療中起著增效減毒的作用，其抗癌活性常與內質網應激有關。

綜上所述，內質網應激條件下，GRP78表達上調明顯，可作為 ERS 和 UPR 的激活標志。同時，CHOP是內質網應激誘導凋亡的一個關鍵分子，也是發生內質網應激時的一個標志分子。當內質網應激程度溫和，細胞具有處理耐受異常刺激的能力，PERK激活eIF2抑制蛋白質翻譯，ATF6剪切XBP1增加蛋白質折疊能力，IRE1活化增加內質網應激相關靶基因轉錄水平，這些反應使細胞得以恢復穩態。當刺激超過細胞處理能力時，PERK激活eIF2進而激活ATF4，ATF6剪切XBP1， IRE1激活RIDD、ASK1和JNK，最終激活CHOP、Bax，下調Bcl-2，誘導細胞凋亡。

結語與展望

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，2018年，全球約有209萬人罹患肺癌，近180萬人死于肺癌[34-35]。在我國，肺癌是男性發病率和死亡率首位的腫瘤；是女性發病率第二位和死亡率首位的腫瘤[36]。因此，肺癌的防治成為世界重要的熱門研究課題。盡管肺癌的治療手段發展日益進展，但由于肺癌明確診斷時期晚、耐藥性發展快以及復發率高，明確肺癌的發生、發展機制及制定治療策略仍然是亟待解決的問題。

內質網肩負著維持蛋白質穩態的使命，在生理條件下，ER 腔內分子伴侶幫助新合成的天然蛋白質的正確折疊，質量控制系統識別錯誤折疊的蛋白質，通過蛋白酶體、溶酶體和自噬途徑降解錯誤折疊蛋白質。內質網應激的各分支通路均對肺癌的發生、發展具有一定的作用，研究表明調控內質網應激對肺癌的生長、遷移、轉移、復發具有很大作用。且目前越來越多研究許多發現天然化合物具有通過內質網應激發揮出良好抗癌活性，可能成為抗肺癌的潛力藥物。因此，內質網應激有望成為非小細胞肺癌治療的一個新靶點，為臨床開發新的抗癌藥物提供了新的依據。