同型半胱氨酸通過上調Rap1A表達促進小鼠巨噬細胞增殖及M1極化*

楊亞麗 ， 田 榮 ， 袁 茵 ， 王艷佳 ， 楊曉玲 △

（1寧夏醫科大學基礎醫學院，2國家衛生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室，3寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室，寧夏銀川750004）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是體內甲硫氨酸和蛋氨酸循環的代謝產物，在正常情況下一般維持在較低的水平。目前研究已證實，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）可以作為多種疾病如心腦血管疾病、腎損傷和腦卒中等的獨立危險因素［1］，尤其是冠心病和腦卒中等，其致病機制與促進血管平滑肌細胞增殖、增加血小板聚集、損傷血管內皮和激活免疫反應等有關［2-3］。Ras 相關蛋白1（Ras-related protein 1，Rap1）是小分子 G 蛋白 Ras超家族成員之一，在各種因子刺激下，與細胞膜上的受體結合，對細胞的增殖、遷移和分化等進行調控，已成為疾病防治的新靶標［4］。Pei 等［5］發現，腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）通過觸發腺苷酸環化酶激活gp91phox，而該過程涉及Rap1A 激活，提示Rap1A 通過免疫炎癥反應參與了疾病的調控。但Rap1A 在Hcy 致巨噬細胞增殖及其在免疫應答中的作用尚不清楚。本研究以ANA-1小鼠巨噬細胞為研究對象，探討Rap1A 在Hcy 致ANA-1 細胞增殖及M1 極化中的作用，為Hcy 相關疾病的預防和治療提供理論依據。

材料和方法

1 主要試劑

ANA-1 小鼠巨噬細胞購自中國醫學科學院細胞培養中心。Hcy（Sigma）；胎牛血清購自 Gibco；蛋白提取試劑盒和蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司）；總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（TaKa-Ra）；抗Rap1A 單克隆抗體和抗p27 單克隆抗體（Abcam）；抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（Affinity）；EdU 染色試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司）；小鼠ELISA 檢測試劑盒（伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；Rap1A干擾腺病毒（Ad-shRNA/Rap1A）由漢恒生物科技有限公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。

2 實驗儀器

超凈工作臺（江蘇安泰）；CO2培養箱（Heraeus）；5415D 型微量臺式離心機（Eppendorf）；BS110S 型精密天平（Sartorius）；熒光定量PCR 儀、垂直電泳儀和Model 680全自動酶標儀（Bio-Rad）。

3 實驗方法

3.1 細胞培養 將ANA-1 細胞以1×106個接種于25T透氣培養瓶中，用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的 RPMI-1640 培養液，于 37 ℃、含5% CO2的培養箱中常規培養，隔日換液，根據細胞的生長狀態，當細胞數約每瓶2×106個時傳代。用含終濃度100 μmol/L 的 Hcy 培養液干預細胞 24 h，建立 HHcy 細胞模型，用于后續實驗。

3.2 細胞分組及Rap1A 干擾腺病毒轉染 將3.1培養的處于對數生長期的細胞鋪于6 孔板，用100 μmol/L 的 Hcy 干預 24 h 后，記為 Hcy 組；正常對照（control）組僅加入等量的完全培養基；將10 μL 感染復數為100 的Ad-shRNA/Rap1A 及其陰性對照（AdshRNA/GFP），分別轉染至ANA-1 巨噬細胞后用100 μmol/L Hcy 處理，分別記為Hcy+Ad-shRNA/Rap1A組和Hcy+Ad-shRNA/GFP組；6 h后換正常培養基，由于腺病毒載體中含有GFP基因，48 h 后熒光顯微鏡觀察轉染效率，實驗重復3次。

3.3 CCK-8 檢測ANA-1 細胞活力 取指數增殖期的ANA-1 細胞接種于96 孔板（每孔3×103個）。將培養板放在37 ℃、5% CO2培養箱內培養孵育過夜，待細胞密度達60%～70%時，用100 μmol/L Hcy 刺激24 h 后，分別向 96 孔板每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液，繼續培養2 h，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度（A）值，實驗重復3次。

3.4 EdU 染色法檢測細胞增殖 細胞處理方法同3.3，將處理后的細胞按照每孔1×104的密度接種到24 孔板，刺激24 h 后，根據EdU 染色試劑盒檢測DNA 增殖活性，向細胞中加入 50 μmol/L EdU 試劑，孵育 2 h 后，PBS 洗掉未滲入 DNA 的 EdU 并加入 4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS 洗除固定液，加入Apollo 染液室溫避光孵育30 min，PBS 洗除染液并用Hochest染核30 min。于熒光顯微鏡觀察并隨機獲取5個視野的熒光圖像，采用ImageJ軟件對EdU陽性細胞計數，實驗重復3次。

3.5 RT-qPCR 檢測 mRNA 表達 細胞培養 24 h 后，收集細胞，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，測定樣品純度與濃度后將RNA逆轉錄為cDNA。在NCBI查詢各基因的CDS，用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，序列見表1。以cDNA 為模板擴增各目的基因，反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40 個循環，最后延伸10 min。目的基因的相對表達用2-ΔΔCt法分析。

表1 CD80、CD86、CD163、CD200R、Rap1A、PCNA、p27及GAPDH的引物序列Table 1. Primer sequences of CD80，CD86，CD163，CD200R，Rap1A，PCNA，p27 and GAPDH

3.6 Western blot 檢測 p27、PCNA 和 Rap1A 蛋白的表達 細胞培養24 h 后提取細胞總蛋白，BCA 法檢測樣品中的蛋白濃度，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE，再將蛋白轉移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗膜10 min×3次，加入Ⅰ抗（p27、PCNA、Rap1A和β-actin 抗體，均按1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，次日回收Ⅰ抗，PBST 洗膜 10 min×3 次，再加入 HRP 標記的Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，充分洗膜后，加入ECL 發光液，顯色、曝光，保存圖片，以β-actin 為內參照，Image Lab軟件進行定量分析。

3.7 ELISA法檢測炎癥因子IL-6和TNF-α濃度 收集細胞培養上清液，按照ELISA 說明書，在包被IL-6和TNF-α 抗體的96 孔板中前2 列每孔依次加入100 μL 標準工作液，其他每孔加入 100 μL 待測樣品，給酶標板覆膜，37 ℃孵育90 min。將25×的濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋后進行洗滌，隨后每孔加入100 μL 生物素抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗滌后每孔加入100 μL酶結合工作液，進行孵育和洗滌，加入顯色劑90 μL，混勻后37 ℃孵育30 min，最后每孔加終止液50 μL，終止反應，450 nm波長處檢測各孔吸光度（A）值，根據標準曲線計算細胞內IL-6和TNF-α的濃度。

4 統計學處理

用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計學分析，所有數據均以均數±標準差（mean±SD）表示。先評估數據是否為正態分布，再進行正態分布數據的方差齊性檢驗，方差齊的兩組數據采用非配對t檢驗，多組數據的單因素比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Hcy對ANA-1細胞增殖的影響

ANA-1 細 胞 經 100 μmol/L Hcy 刺 激 24 h 后 ，CCK-8 實驗結果顯示，Hcy 組的吸光度顯著高于control組（P＜0.05），見圖1A；EdU 染色結果顯示，Hcy 組EdU 摻入 ANA-1 細胞核的量最多（P＜0.01），見圖1B。

2 ANA-1 細胞中 p27 和 PCNA 的 mRNA 及蛋白表達變化

RT-qPCR 及 Western blot 結果顯示，與 control 組相比，Hcy 組 p27 的 mRNA 及蛋白水平明顯降低（P＜0.05），PCNA 的 mRNA 及蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），見圖2。以上數據均表明Hcy促進ANA-1巨噬細胞增殖。

3 ANA-1細胞培養上清液中IL-6和TNF-α濃度

ELISA 結果顯示，與 control 相比，Hcy 組 ANA-1細胞分泌IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），見圖3。這提示Hcy 促進ANA-1 細胞分泌炎癥細胞因子IL-6和TNF-α。

4 Hcy對ANA-1細胞M1和M2極化標志物的影響

RT-qPCR 結果顯示，與 control 相比，Hcy 組細胞的 M1 表型標志物 CD80 和 CD86 的 mRNA 表達顯著增加（P＜0.05），見圖4A、B，而M2 表型標志物CD163和CD200R 的 mRNA 表達顯著減少（P＜0.05），見圖4C、D，提示Hcy可有效促進ANA-1細胞M1極化。

Figure 1. Effects of Hcy on the proliferation of ANA-1 cells were detected by CCK-8 assay（A）and EdU staining（B；×200）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 Hcy對ANA-1細胞增殖能力的影響

Figure 2. Expression of p27 and PCNA in Hcy-treated ANA-1 macrophages. RT-qPCR（A）and Western blot（B）were used to detect the expression of p27 and PCNA. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 Hcy處理的ANA-1細胞中p27和PCNA的表達情況

Figure 3. Effects of Hcy on the production of inflammatory cytokines from ANA-1 cells. A：the level of interleukin-6（IL-6）；B：the level of tumor necrosis factor-α（TNF-α）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 Hcy對ANA-1細胞產生炎性細胞因子的影響

Figure 4. Effects of Hcy on the polarization of ANA-1 cells. A and B：the mRNA levels of CD80 and CD86（M1 polarization markers）；C and D：the mRNA levels of CD163 and CD200R（M2 polarization markers）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 Hcy對ANA-1細胞M1和M2極化標志物的影響

5 Rap1A在ANA-1細胞中的表達變化

RT-qPCR 和 Western blot 結果顯示，與 control 組相比，Hcy組Rap1A的mRNA和蛋白表達均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），見圖5。以上結果說明，Hcy 能夠促進Rap1A在ANA-1巨噬細胞中表達。

Figure 5. Effects of Hcy on the expression of Rap1A in ANA-1 cells. RT-qPCR（A）and Western blot（B）were used to detect the expression of Rap1A. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 Hcy對ANA-1細胞中Rap1A表達的影響

6 Rap1A在Hcy誘導的ANA-1細胞增殖中的作用

為進一步驗證Rap1A 是否調控Hcy 誘導的ANA-1 細胞增殖過程，將ANA-1 巨噬細胞轉染AdshRNA/Rap1A，熒光顯微鏡觀察感染效率達80%以上收集細胞進行下一步實驗（圖6A）；RT-qPCR 和Western blot 檢測ANA-1細胞中Rap1A被干擾后自身表達的改變，結果如圖6B、C 所示，ANA-1 細胞AdshRNA/Rap1A 轉染成功。通過 CCK-8 實驗和 EdU 染色檢測ANA-1 細胞的增殖情況，結果顯示，與Hcy+Ad-shRNA/GFP 組相比，Hcy+Ad-shRNA/Rap1A 組細胞增殖能力減弱，EdU 陽性細胞摻入量減少（P＜0.01），見圖6D、E。進一步使用RT-qPCR 和Western blot 檢測增殖相關蛋白p27 和PCNA 的表達改變，結果顯示，與Hcy+Ad-shRNA/GFP 組相比，Hcy+AdshRNA/Rap1A 組細胞中 p27 的表達增加，PCNA 的表達降低（P＜0.05 或P＜0.01），見圖7。該結果表明敲減Rap1A表達可緩解Hcy引起的ANA-1細胞增殖。

7 敲減Rap1A表達后ANA-1細胞M1及M2極化標志物的變化情況

為進一步明確Hcy 通過Rap1A 調控ANA-1 細胞的M1 極化，在ANA-1 細胞轉染Ad-shRNA/Rap1A后，RT-qPCR 檢測 M1 和 M2 極化標志物的 mRNA 水平。檢測結果顯示，與Hcy+Ad-shRNA/GFP 組相比，Hcy+Ad-shRNA/Rap1A 組的 M1 極化標志物 CD80 和CD86 表達水平顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05），見圖8A、B，M2 極化標志物CD200R 的表達水平顯著升高（P＜0.05），而 CD163 表達無明顯變化，見圖8C、D。該結果表明敲減Rap1A表達能夠抑制ANA-1 細胞發生 M1 極化，說明 Hcy 通過 Rap1A 調控 ANA-1 細胞的M1極化。

Figure 6. Effect of Rap1A knockdown on the proliferation of ANA-1 cells. A：fluorescence microscopic observation of Ad-shRNA/Rap1A infection efficiency（×200）；B and C：RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of Rap1A in ANA-1 cells transfected with Ad-shRNA/Rap1A；D and E：CCK-8 assay and EdU staining（×200）were used to detect the effect of Rap1A on the proliferation of ANA-1 cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.圖6 敲減Rap1A表達對ANA-1細胞增殖的影響

討 論

Figure 7. Effects of Rap1A knockdown on the expression of proliferation-related proteins in ANA-1 cells. RT-qPCR（A and B）and Western blot（C and D）were used to detect the expression of p27（A and C）and PCNA（B and D）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.圖7 敲減Rap1A的表達對ANA-1細胞增殖相關蛋白表達的影響

Hcy 是一種在必需氨基酸甲硫氨酸代謝過程中形成的含硫氨基酸。正常情況下，血清Hcy 水平低于 5 μmol/L，當血清 Hcy 水平超過 15 μmol/L 時被稱為HHcy［6］。Hcy 被認為是動脈粥樣硬化和心血管疾病的獨立危險因素［7-8］。Hcy有2種代謝途徑，即轉硫途徑和轉甲基途徑，這也是Hcy 致病的病理生理學基礎，其中，Hcy 通過轉硫途徑引起的氧化應激和免疫應答是Hcy 的致病機制之一［9］。由于巨噬細胞增殖和吞噬脂質變成泡沫細胞是As 的重要環節［10］，因此探討Hcy 在巨噬細胞增殖中的機制具有重要的意義。本研究以ANA-1 巨噬細胞細胞為研究對象，以100 μmol/ L Hcy 刺激 ANA-1 巨噬細胞 24 h，成功構建巨噬細胞增殖模型。巨噬細胞增殖能力的增強與多種增殖基因表達的變化有關。p27 是細胞周期的負性調控分子，能夠阻礙多種cyclin分子與激酶形成復合體，進而阻礙細胞周期進程、抑制細胞增殖［11］，PCNA 既是細胞核內DNA 多聚酶δ的輔因子、也是細胞周期發展的正性調控蛋白，能夠加速DNA 復制及細胞周期進程，進而促進細胞增殖［12］。結果顯示Hcy刺激ANA-1巨噬細胞后，p27的mRNA及蛋白表達水平顯著降低，而PCNA的mRNA及蛋白表達水平顯著升高，與文獻報道一致。

巨噬細胞是免疫系統的重要組成部分，可通過吞噬外來微生物并提呈抗原［13］，在維持機體的內穩態平衡、對抗炎癥反應、防御修復等過程中發揮重要作用，巨噬細胞表現出顯著的可塑性，在不同的局部微環境下極化為不同的亞型，促炎的M1 型，即經典活化巨噬細胞；抗炎的M2型，即替代活化巨噬細胞。巨噬細胞這種不同表型的轉換調控者炎癥相關疾病的發生、發展和轉歸［14］。CD80、CD86 和MHCⅡ等細胞表面分子在M1 型巨噬細胞高表達，M1 型細胞激活后可以分泌TNF-α 和IL-6 等炎癥因子，通過產生趨化因子激活Th1 型免疫反應，誘導炎癥反應［15］；而CD200R、CD163 和 CCL13 等細胞表面分子在 M2 型巨噬細胞高表達，M2 型細胞激活后釋放大量抑炎型細胞因子如IL-4 和IL-10 等，激活Th2 型免疫反應，促進炎癥的消除和組織損傷修復［16］，本研究結果顯示，M1 型巨噬細胞表面分子CD80 和CD86 的表達也明顯增加，而M2 型細胞表面分子CD200R 和CD163表達顯著降低，表明Hcy 能夠促進ANA-1 巨噬細胞釋放炎癥因子，并誘導其發生M1極化。

Figure 8. Effects of Rap1A knockdown on M1 and M2 polarization of ANA-1 cells. A and B：the mRNA levels of CD80 and CD86（M1 polarization markers）；C and D：the mRNA levels of CD163 and CD200R（M2 polarization markers）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.圖8 敲減Rap1A表達對ANA-1細胞M1及M2極化標志物表達的影響

Rap是腫瘤基因家族成員之一，廣泛分布于各種組織細胞中，與細胞的增殖、極性的形成、分化、粘附、運動等多種生物學功能密切相關［17-18］。Rap 是一種小GTP酶，可以通過活性改變調控其功能［19］。Rap家族有兩個亞類，Rap1 和Rap2，其中Rap1 有含有2個亞型，Rap1A 和Rap1B，二者序列存在95%的同源性［20］。研究發現，miRNA 抑制 Rap1A 的表達則能促進肝癌細胞凋亡，表明Rap1A 參與細胞的增殖過程［21］。另有研究發現，PI3 激酶 γ 促進 Rap1A 介導的髓系細胞整合素α4β1 活化，導致腫瘤炎癥和生長［22］；HBV 感染通過上調 miR-203a 從而靶向抑制Rap1A 的表達，影響 PI3K/ERK/p38/NFκB 通路，誘發肝炎，提示Rap1A 參與了機體的免疫應答過程［23］。本研究結果顯示：Hcy 干預ANA-1 巨噬細胞后，Rap1A 的表達明顯增加，表明Rap1A 可能參與Hcy導致的巨噬細胞免疫應答過程。為了進一步明確Rap1A 在Hcy 誘導的巨噬細胞增殖和極化中的作用，我們將Rap1A干擾腺病毒轉染至ANA-1 巨噬細胞，結果發現，干擾Rap1A的表達不僅可以逆轉由Hcy 誘導的巨噬細胞增殖，還可以使M1 型巨噬細胞表面分子CD80 和CD86 的表達減少，M2 型細胞表面分子CD200R 表達顯著增加，但M2 標志物CD163 表達無明顯變化，表明Rap1A 是Hcy 致巨噬細胞增殖及M1極化的重要機制。

綜上所述，Hcy 能夠促進ANA-1 巨噬細胞增殖和M1 極化，其機制可能與Hcy 上調Rap1A 的表達有關，我們的研究提示，以Rap1A 為靶標調控巨噬細胞的增殖與炎癥反應，可能對臨床HHcy相關疾病的治療提供理論依據。