黃連素通過激活AMPK改善同型半胱氨酸誘導的大鼠癡呆和Tau蛋白過度磷酸化*

王 林， 丁 見， 吳 超， 張 翠， 李 曙， 胡澤波， 周新文

（1皖南醫學院基礎醫學院，安徽蕪湖241002；2華中科技大學病理生理學系，湖北武漢430030）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種不可逆、且進行性的神經退行性疾病，約占所有老年癡呆癥病例的 60%～80%［1］。AD 兩大主要特征性病理改變為β 淀粉樣多肽（amyloid beta peptide，Aβ）沉積形成的老年斑和神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs），NFTs 主要由過度磷酸化的 Tau 蛋白形成［2］。Tau 蛋白可以在多個絲氨酸（serine，Ser）或蘇氨酸（threonine，Thr）位點被磷酸化，例如 Ser396（pS396）和 Thr205（pT205）等。高同型半胱氨酸血癥、高血糖、神經炎癥、氧化應激和高膽固醇血癥等都與AD 發生發展密切相關［3］，我們前期建立的尾靜脈注射同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）大鼠AD樣模型顯示，模型大鼠的認知功能受損，海馬區Tau蛋白過度磷酸化［4］。AD 的病因和發病機制復雜，藥物開發至今為止多以失敗告終。

中藥黃連素（berberine，BBR）是一種廣泛應用的異喹啉生物堿，具有抗病毒、抗菌和抗炎等多種生物活性［5］。研究表明黃連素對多種中樞神經系統疾病，如帕金森病、亨廷頓病和AD 等具有神經保護作用［6-8］。在糖尿病大鼠中，黃連素可抑制炎癥、氧化應激和改善腦中胰島素抵抗進而改善大鼠的認知功能［9］；在 APP/Tau/PS1 AD 轉基因鼠中給予黃連素治療后，可降低Aβ1-42的水平和改善認知障礙［10］。以上研究結果表明黃連素在AD 發病機制的多個環節起作用，但是黃連素如何調控Tau 蛋白磷酸化水平的具體機制尚不明確。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由一個催化亞基α、兩個調節亞基β 和γ 組成的異源三聚體復合物，上游可通過磷酸化AMPK α 亞基上Thr172 位點（p-AMPK）激活AMPK［11］。AMPK 可調節細胞內的一些代謝途徑，如葡萄糖的攝取和運輸，脂肪酸和蛋白質的合成，以及脂肪酸的β-氧化等。本課題組前期研究已證實，隨著年齡增加，小鼠海馬中AMPK 的活性逐漸降低，而激活AMPK 可降低Tau 蛋白的磷酸化水平［12］。在細胞水平上黃連素可激活AMPK［13］，在 AD 動物模型中，黃連素能否通過激活AMPK 改善認知功能障礙和降低Tau 蛋白磷酸化水平值得研究。因此，本研究利用尾靜脈注射Hcy 建立AD 樣大鼠模型，探究黃連素的神經保護作用及機制。

材料和方法

1 實驗動物及處理方法

36 只 SPF 級 3 月齡 SD 大鼠，雄性，體重 200～250 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0014。實驗前適應性飼養1 周，自由飲食、飲水，溫度（23±1）℃，濕度（50±10）%，光照和黑暗交替各12 h。36 只大鼠隨機分為3 組：對照組（NS 組）、模型組（Hcy+NS 組）及治療組（Hcy+BBR組），每組12 只。模型組和治療組大鼠尾靜脈注射Hcy（400 μg·kg-1·d-1）14 d，對照組大鼠尾靜脈注射相同劑量的生理鹽水（normal saline，NS）14 d。隨后治療組大鼠用黃連素灌胃（100 mg·kg-1·d-1）10 周，對照組和模型組大鼠用相同體積的NS 灌胃10 周。具體流程圖見圖1A。所有動物實驗均經過皖南醫學院實驗動物福利與倫理委員會批準。

2 細胞培養

HEK293-Tau 細胞（穩定轉染人類全長Tau 蛋白的人胚腎母細胞瘤細胞）由華中科技大學同濟醫學院病理生理學系周新文老師課題組惠贈，細胞于5%CO2、37 ℃恒溫恒濕的細胞培養箱中，用含10%胎牛血清和G418 的DMEM 高糖培養液培養。先檢測不同濃度（2.5、5、10 和 20 μmol/L）BBR 對細胞活力和AMPK 活性的影響，最終確定用于后續實驗的濃度為 5 μmol/L。細胞實驗分組為 3 組：對照（control，CON）組：單獨 DMSO 處理 24 h；BBR 組：5 μmol/L BBR 和 DMSO 共同處理 24 h；BBR+Compound C 組：5 μmol/L BBR 和 20 μmol/L Compound C 共 同 處 理24 h。

3 主要藥品試劑和儀器

Hcy 和 Compound C 購自 Sigma；BBR 購自上海源葉生物科技有限公司；兔抗AMPK、p-AMPK、PSD93、PSD95、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）和GSK-3β Ser9 位點磷酸化（GSK3β-S9）多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗pT205 和pS396 多克隆抗體購自Biosource；鼠抗蛋白磷酸酶2A 催化亞基（protein phosphatase 2A catalytic subunit，PP2Ac）和 PP2Ac 亮氨酸 309 位點去甲基化（DM-PP2Ac）單克隆抗體購自 Sigma；鼠抗 PP2Ac 的酪氨酸307 位點磷酸化（p-PP2Ac）單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology；鼠抗 β-actin 和 Tau5 單克隆抗體購自Abcam；CCK-8 試劑盒、羊抗兔IgG 和羊抗鼠IgG購自碧云天生物技術有限公司；高爾基染色試劑盒購自FD Neuro Technologies；胎牛血清、DMEM高糖培養基、G418 和胰酶購自Gibco。培養瓶和培養板等細胞培養耗材購自NEST；SDS-PAGE 電泳儀及成像分析儀購自Bio-Rad；倒置顯微鏡購自Olympus；水迷宮實驗設備購自泰盟公司。

4 主要實驗方法

4.1 Morris 水迷宮實驗 用Morris 水迷宮實驗評價大鼠的空間學習記憶能力。前5 d 訓練大鼠在水迷宮設備中尋找一個隱藏的平臺（低于水面1 cm），每天訓練4 次，在每次實驗中，當大鼠爬上平臺并保持15 s 時，實驗結束；如果大鼠在90 s 內沒有找到隱藏的平臺，它們會被引導到平臺上，并停留15 s。記錄大鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期）。在檢測記憶能力之前，讓大鼠休息1 d，第7天移走平臺進行空間探索實驗，大鼠自由游泳90 s，記錄大鼠游過原平臺的次數、大鼠在原平臺所在象限的時間及大鼠游泳的速度。采用裝置自帶跟蹤軟件記錄大鼠的運動軌跡。實驗期間保持固定的實驗人員和安靜的實驗環境。

4.2 Western blot 于Morris 水迷宮實驗后收集大鼠腦組織，BBR處理24 h后收集細胞樣品，BCA 法檢測各樣品蛋白濃度，隨后加入上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白充分變性。變性后的蛋白（20 μg）進行SDS-PAGE 分離蛋白，將凝膠中的蛋白轉移至NC 膜上，并用脫脂奶粉溶液進行封閉，封閉完成后用Ⅰ抗孵育，4 ℃過夜，再加入Ⅱ抗室溫孵育2 h，最后在凝膠成像儀上曝光顯影。顯影后以β-actin 為內參照，用ImageJ軟件量化目的蛋白的表達水平。

4.3 免疫組化實驗 4%多聚甲醛灌流后快速取腦組織，繼續浸泡4%多聚甲醛溶液48 h，隨后用30%蔗糖溶液脫水，冰凍切片（片厚30 μm），將腦片放入4℃冰箱保存。挑取腦片PBS 漂洗后加入3%H2O2溶液消除內源性過氧化物酶活性，加入枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復，5% BSA 室溫封閉60 min，加入Ⅰ抗pS396（稀釋比為1：100），4℃孵育過夜。回收Ⅰ抗，PBS 漂洗后加入生物素標記的組化Ⅱ抗（羊抗兔IgG），37℃孵育1 h。最后加入DAB 顯色液，避光顯色3 min 左右用PBS 沖洗終止顯色。貼片，室溫干燥后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片，顯微鏡下觀察和拍照。

4.4 高爾基染色 生理鹽水灌流后立即取腦組織，浸泡于試劑盒中A、B 混合液中，24 h 后更換新鮮A、B混合液，室溫，避光放置21 d，隔2 d更換AB混合液一次。21 d 后腦組織放入C 液中，24 h 后更換新鮮C液，繼續避光放置2 d。震蕩切片機（50 μm）切片，腦片室溫避光晾干。腦片用雙蒸水沖洗后放入D、E 混合液中染色10 min，染色過程中始終保持腦片濕潤。梯度乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片。低倍鏡下先確定海馬CA3 區神經元，在油鏡下選擇距胞體90～110 μm（近端）和190～210 μm（遠端）的2 個樹突段進行拍照，用ImageJ 計算每個神經元10 μm 樹突長度上的樹突棘數量，即樹突棘密度。

4.5 CCK-8 法檢測BBR 對細胞活力的影響 將制備好的細胞懸液接種到96 孔板中，每孔約100 μL，將96孔板放入培養箱中培養24 h。各孔中加入不同濃度的黃連素，同時設置空白對照組和正常對照組，每組樣本做6 個復孔，繼續孵育24 h 后更換含10%CCK-8 的新鮮培養基，加樣的過程中盡量不要產生氣泡。最后再放入培養箱中孵育30 min，用酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A）值并計算細胞活力。

5 統計學處理

使用SPSS17.0 統計軟件處理數據，數據用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法），以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 黃連素對Hcy大鼠空間學習記憶能力的影響

Morris 水迷宮結果顯示，在訓練第5 天，與NS 組相比，Hcy+NS 組大鼠的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05）；與 Hcy+NS 組相比，Hcy+BBR 組大鼠逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），見圖 1B；與 NS 組相比，Hcy+NS 組大鼠穿越原平臺次數顯著減少（P＜0.05），在原平臺所在象限停留時間也顯著縮短（P＜0.05）；與Hcy+NS 組相比，Hcy+BBR 組大鼠穿越原平臺次數顯著增加（P＜0.05），并且在原平臺所在象限停留時間也顯著延長（P＜0.05），見圖1D、E；同時記錄大鼠的游泳速度，結果顯示3 組大鼠游泳速度并無顯著差異（P＞0.05），見圖1C；各組大鼠運動軌跡見圖1F。

Figure 1. The therapeutic effects of BBR on the cognitive decline of Hcy rats. A：diagram of the experimental procedure；B：the escape latency to find the hidden platform；C：the swim speed on day 7；D：the number of crossing the platform region；E：the time spent in the target quadrant；F：the representative swimming paths on day 5. Mean±SD. n=12.*P＜0.05 vs NS group；#P＜0.05 vs Hcy+NS group.圖1 黃連素對Hcy大鼠認知功能的影響

2 黃連素對Hcy 大鼠海馬區突觸蛋白和樹突棘密度的影響

Western blot 實驗結果顯示，與 NS 組相比，Hcy+NS 組大鼠海馬區突觸蛋白（PSD93 和PSD95）的表達水平顯著降低（P＜0.01）；與Hcy+NS 組相比，Hcy+BBR 組大鼠海馬中PSD93 和PSD95 的表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖2A。高爾基染色結果顯示，與NS 組相比，Hcy+NS 組大鼠海馬CA3 區樹突棘密度顯著降低（P＜0.01）；與Hcy+NS 組相比，Hcy+BBR 組大鼠海馬CA3 區樹突棘密度顯著升高（P＜0.05），見圖2B。

Figure 2. The expression of synaptic protein and spine density in the hippocampal of the rats in each group. A：comparison of PSD93 and PSD95 protein levels in the hippocampal of rats in each group（n=6）；B：representative shaft dendrites in hippocampal neurons of the CA3 region in each group by Golgi staining and quantitative analysis（n=3）. Mean±SD.**P＜0.01 vs NS group；#P＜0.05 vs Hcy+NS group.圖2 各組大鼠海馬區突觸蛋白的表達和樹突棘密度

3 黃連素對Hcy 大鼠海馬區Tau 蛋白磷酸化水平的影響

Western blot 實驗結果顯示，與NS 組相比，在Hcy+NS 組大鼠的海馬區pT205 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與Hcy+NS 組相比，Hcy+BBR 組大鼠海馬中 pT205 表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖 3A。Western blot 和免疫組化實驗結果均顯示，與NS組相比，Hcy+NS 組大鼠海馬區pS396 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與Hcy+NS 組相比，Hcy+BBR 組的大鼠海馬區pS396 表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖3B。但是總Tau 蛋白（Tau5）的表達水平在各組大鼠海馬中無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

4 黃連素對Hcy 大鼠海馬區Tau 蛋白激酶和磷酸酶的影響

Western blot 實驗結果顯示，與 NS 組相比，Hcy+NS 組大鼠海馬區p-AMPK 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與 Hcy+NS 組相比，Hcy+BBR 組的大鼠海馬區p-AMPK表達水平顯著升高（P＜0.01）；但是AMPK的表達水平在各組大鼠海馬中并無顯著差異（P＞0.05）。GSK3β-S9和GSK3β 的表達水平在各組大鼠海馬中并無顯著差異（P＞0.05）。與NS組相比，Hcy+NS 組大鼠海馬區p-PP2Ac 和DM-PP2Ac 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與Hcy+NS 組相比，Hcy+BBR 組的大鼠海馬中p-PP2Ac 和DM-PP2Ac 的表達水平顯著降低（P＜0.05）；但是在各組大鼠海馬中，PP2Ac 的表達水平無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

Figure 3. The expression level of phosphorylated Tau protein in the hippocampal of the rats in each group. A：the levels of total Tau（Tau5）and phosphorylated Tau（pT205，pS396）in the hippocampal of rats in each group were measured by Western blot；B：representative images of brain slice immunostained with pS396 and quantitative analysis of pS396 staining. Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NS group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Hcy+NS group.圖3 各組大鼠海馬區Tau蛋白磷酸化水平

5 不同濃度的黃連素對HEK293-Tau 細胞活力和AMPK活性的影響

在HEK293-Tau細胞中，給予不同濃度BBR作用24 h，CCK-8法檢測結果顯示，與對照組相比，BBR 分別在 10 μmol/L 和 20 μmol/L 時對細胞的活力抑制有統計學差異（P＜0.05），見圖5A。Western blot 實驗結果顯示，BBR（2.5 μmol/L）組p-AMPK 表達水平與對照組相比無顯著性差異，而BBR（5 μmol/L）組中p-AMPK 表達水平較對照組顯著升高（P＜0.01），見圖5B。AMPK 的表達水平在各組中并無顯著差異（P＞0.05），見圖5B。

6 黃連素通過AMPK/PP2Ac降低HEK293-Tau細胞中Tau蛋白磷酸化水平

實驗結果顯示，與 CON 組相比，BBR 組 pT205 和pS396 表達水平顯著降低（P＜0.01），與BBR 組相比，BBR+Compound C 組pT205和pS396表達水平顯著升高（P＜0.05），Tau5 的表達水平在各組間無顯著差異（P＞0.05）。與CON 組相比，BBR 組中 p-AMPK 表達水平顯著升高（P＜0.05），與BBR 組相比，BBR+Compound C 組中p-AMPK 表達水平顯著降低（P＜0.05），AMPK 的表達水平在各組間無顯著差異（P＞0.05）。與 CON 組相比，BBR 組 p-PP2Ac 和 DM-PP2Ac 表達水平顯著降低（P＜0.05），與BBR 組相比，BBR+Compound C 組 p-PP2Ac 和 DM-PP2Ac 表達水平顯著升高（P＜0.05），PP2Ac 的表達水平在各組間無顯著差異（P＞0.05），見圖6。

Figure 4. Comparison the activity of AMPK，GSK3β and PP2Ac in the hippocampal of the rats in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NS group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Hcy+NS group.圖4 比較各組大鼠海馬區AMPK、GSK3β和PP2Ac的活性

討 論

研究報道，增加大鼠血漿中Hcy 濃度，可以誘導AD 樣認知功能障礙、Aβ 沉積和Tau 蛋白過度磷酸化［14-16］。本研究與以往研究結果相似，水迷宮實驗結果顯示Hcy 大鼠的學習記憶能力受損。Hcy 通過多種途徑分解代謝，其中之一是葉酸/維生素B12 依賴的再甲基化。雖然維生素B12 和葉酸的補充可有效的降低血漿中Hcy 濃度，但與安慰劑相比，葉酸和維生素B12 的補充并沒有改善健康或認知障礙患者的認知功能［17］。這一結果表明Hcy 可能通過血管或神經毒性等多種途徑引起腦功能障礙。

黃連素可改善AD 轉基因鼠（3×Tg AD 小鼠）和2型糖尿病大鼠的認知功能障礙［18-19］，但黃連素能否改善Hcy 誘導的大鼠認知功能障礙目前并沒有被詳細探討。本研究水迷宮實驗結果顯示黃連素（100 mg·kg-1·d-1）灌胃 10 周后，可顯著改善 Hcy 大鼠的空間學習記憶能力。突觸是學習和記憶的基本單位，在輕度認知損傷患者和AD 患者的早期階段已觀察到突觸功能受損［20］；在AD 轉基因鼠（APP/PS1 小鼠）海馬中，突觸蛋白PSD93 和PSD95 的含量顯著降低，提高突觸蛋白的表達水平可改善認知功能［21］。Hcy 可引起 PSD93 和 PSD95 的表達水平降低［15］。為解釋黃連素顯著改善Hcy 大鼠的空間學習記憶能力的機制，我們檢測了樹突棘密度和突觸蛋白的表達水平，結果顯示黃連素治療后Hcy 大鼠海馬區PSD93 和PSD95 表達水平顯著升高，樹突棘密度顯著增加。表明黃連素改善Hcy 大鼠的認知功能可能與增加突觸蛋白和樹突棘密度有關。

Figure 5. Effect of BBR on viability and AMPK activity in HEK293-Tau cells. A：the viability of HEK293-Tau cells after BBR treatment was tested by CCK-8；B：the levels of AMPK and p-AMPK in HEK293-Tau cells after BBR treatment were measured by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖5 BBR對HEK293-Tau細胞活力和AMPK活性的影響

黃連素通過激活糖尿病模型動物的AMPK 活性，從而提高胰島素的敏感性和降低全身肥胖［22］。神經母細胞瘤細胞和皮層神經元的實驗結果顯示，黃連素通過激活AMPK 減少Aβ 的生成并降低APP裂解酶（BACE1）的表達［13］。本研究的動物實驗結果顯示Hcy 模型大鼠的AMPK 活性降低、Tau 蛋白磷酸化水平增加，而黃連素治療后，AMPK 的活性升高而且伴隨著Tau 蛋白磷酸化水平降低。我們前期研究結果顯示，激活AMPK 可以顯著降低糖尿病小鼠海馬區Tau 蛋白磷酸化水平［12］。為了闡明黃連素是否通過激活AMPK降低Tau蛋白磷酸化水平，我們用黃連素處理HEK293-Tau 細胞，同時給予（或不給）AMPK 抑制劑（Compound C），結果顯示AMPK 抑制劑特異性的阻斷黃連素對抗Tau 蛋白磷酸化的作用。該實驗證實黃連素通過激活AMPK 而降低Tau蛋白的磷酸化水平。

GSK3β 是Tau 蛋白過度磷酸化的最重要的激酶，其活性位點Ser9 位點的磷酸化水平降低時，GSK3β 活性增加，引起 Tau 蛋白磷酸化水平增加［23］。PP2A 是降低 Tau 蛋白磷酸化水平的重要磷酸酶［24］，其活性主要受催化亞基（PP2Ac）的酪氨酸307 位點（Tyr307）磷酸化水平和亮氨酸309 位點（Leu309）甲基化水平調節，磷酸化水平增加和/或甲基化水平降低使PP2Ac 酶活性降低［25］。課題組前期研究結果顯示，AMPK 可抑制 GSK3β 的活性，同時降低 Tau 蛋白的磷酸化水平［12］。因此，我們檢測 GSK3β 和 PP2Ac表達和其活性依賴的磷酸化水平。本研究結果顯示，各組大鼠海馬中GSK3β 活性沒有變化，說明GSK3β 沒有參與黃連素對抗Tau 蛋白磷酸化水平的過程中。動物實驗結果顯示Hcy 模型大鼠PP2Ac 活性顯著降低，黃連素治療后PP2Ac 活性顯著升高，提示PP2Ac 參與黃連素對抗Hcy 誘導的Tau 蛋白過度磷酸化。細胞實驗結果顯示，黃連素和Compound C共同處理細胞時，AMPK 和PP2Ac 的活性降低，Tau蛋白磷酸化水平也增加，進一步證實黃連素通過激活AMPK 進而增加PP2Ac活性，從而阻止Tau蛋白過度磷酸化。

綜上所述，黃連素通過調節AMPK/PP2Ac 通路，顯著改善Hcy 大鼠的學習記憶能力和降低Tau 蛋白磷酸化水平，從而發揮神經保護作用。

Figure 6. BBR could reduce phosphorylation of Tau via AMPK/PP2Ac pathway in HEK293-Tau cells. Levels of pT205，pS396 ，p-AMPK，p-PP2Ac and DM-PP2Ac in HEK293-Tau cells after BBR with or without Compound C treating were measured by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs BBR group.圖6 在HEK293-Tau細胞中，BBR通過AMPK/PP2Ac降低Tau蛋白的磷酸化水平