葛根素通過調(diào)控NF-κB通路減輕高糖誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞炎癥反應(yīng)*

涂世偉 ， 吳太鼎， 李 欣， 鄭 思， 王佳音 ， 陳龍菊△

（1湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，湖北恩施445000；2重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校中醫(yī)學(xué)院，重慶404000）

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病引起的周圍神經(jīng)損傷，損傷過后神經(jīng)的功能難以恢復(fù)［1］。DPN 是糖尿病預(yù)后最差且引發(fā)死亡率最高的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為肢體燒灼樣痛或冷痛，感覺減退或消失，神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)壞疽甚至截肢［2］。DPN 發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前存在炎癥反應(yīng)、終末糖基化產(chǎn)物、多元醇過程、非酶糖化、自由基和氧化應(yīng)激及鈣離子穩(wěn)態(tài)變化等多種機(jī)制學(xué)說［3］。炎癥反應(yīng)被視為是DPN 的重要原因［4］，控制高糖（high glucose，HG）引起的炎癥環(huán)境，是DPN 治療的潛在靶點(diǎn)。葛根素（puerarin，Pue）是來源于葛根的異黃酮類化合物，對周圍神經(jīng)損傷有很好的保護(hù)作用［5］，其機(jī)制可能與抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥有關(guān)［6-7］；同時(shí)抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），降低腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，從減輕神經(jīng)細(xì)胞炎性損傷方面發(fā)揮作用［8］。Pue 能否通過抑制NF-κB 信號通路減輕HG 誘導(dǎo)的大鼠施萬細(xì)胞系RSC96 促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)作用，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文選取RSC96 細(xì)胞為DPN 體外損傷模型細(xì)胞，探討Pue 對HG 環(huán)境誘導(dǎo)施萬細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)的影響，旨在為DPN 的臨床治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑及儀器

1.1 細(xì)胞株、藥物與試劑 大鼠施萬細(xì)胞系RSC96購于ATCC。Pue 購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，溶于460 μL 的DMSO，徹底混勻后配制成100 mmol/L 的Pue 工作液；胎牛血清和DMSO（Sigma）；抗NF-κB p65 和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體（碧云天）；抗β-actin、TNF-α 和mature IL-β 抗體及IL-6 試劑盒（博奧森公司）；抗caspase-3 和cleaved caspase-3 抗體（Cell Signaling Technology）；NF-κB 抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）購自Abcam；蛋白預(yù)染marker（Thermo Fisher）；熒光II抗（LI-COR Biosciences）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材 無菌超凈臺(tái)（博訊）；電泳和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）；培養(yǎng)皿（Corning）；超聲儀（凡帝朗公司）；PVDF 膜（Millipore）等。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將凍存的RSC96 細(xì)胞融化（37 ℃），1 000 r/min 離心 5 min 后觀察積淀情況，必要時(shí)需再次離心，之后吸出廢液，在含細(xì)胞沉淀的凍存管中加入含血清培養(yǎng)液吹勻，取適量接種于培養(yǎng)皿中，最后放入5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)傳代或加藥處理，處理方法為：Pue（1 mmol/L）和PDTC（50 μmol/L）各預(yù)處理15 min，之后加入適當(dāng)濃度的葡萄糖，將培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度配制為400 mmol/L。將細(xì)胞分為對照（control，Con）組、HG 組、Pue 預(yù)處理（HG+Pue）組和 PDTC 預(yù)處理（HG+PDTC）組，組內(nèi)設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞達(dá)到接種條件后移至 96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后，用 50～400 mmol/L 的葡萄糖處理24 h，加藥后每孔加入CCK-8 工作液10 μL，培養(yǎng) 1 h 后，檢測 450 nm 處的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞相對活力以確定最佳葡萄糖濃度。

2.3 Western blot 法檢測蛋白水平 用1 mmol/L 的Pue 或 50 μmol/L 的 PDTC 預(yù)處理 RSC96 細(xì)胞 15 min后，再加400 mmol/L 的葡萄糖孵育6 h。用Western blot 法檢測NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β、TNF-α、caspase-3 和cleaved caspase-3 蛋白水平，步驟如下：提取蛋白，蛋白變性，測蛋白濃度，電泳和轉(zhuǎn)膜，孵Ⅰ抗，孵熒光Ⅱ抗，然后再用Oddsey 紅外線系統(tǒng)顯影，用ImageJ軟件測量條帶的灰度值。

2.4 ELISA 試劑盒檢測IL-1β 和 IL-6 的水平 收集藥物干預(yù)后的細(xì)胞培養(yǎng)液，2 000 r/min 離心取上清，之后按照說明書操作。

2.5 免疫熒光法檢測NF-κB 核易位 RSC96 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，按照比例接種，分組同2.1，干預(yù)方法同2.3。干預(yù)后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，步驟如下：4%多聚甲醛固定，5% Triton X-100 破膜處理，5%牛血清白蛋白封閉，孵Ⅰ抗，孵Cy3 Ⅱ抗，加DAPI，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采圖，F(xiàn)IJI 軟件分析Pearson correlation coefficient以檢測NF-κB的核易位水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 22 和GraphPad Prism 8 分別做數(shù)據(jù)分析和制圖。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 HG 誘導(dǎo)RSC96 細(xì)胞凋亡，提高炎癥細(xì)胞因子表達(dá)

與Con組相比，RSC96細(xì)胞活力隨葡萄糖濃度升高而降低，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，且葡萄糖濃度達(dá)到400 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞生長抑制作用顯著（P＜0.05），見圖 1。與 Con 組相比，400 mmol/L 葡萄糖處理 6 h 后，RSC96 細(xì)胞中凋亡蛋白和炎癥細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖2。

Figure 1. The effect of treatment with different concentrations of glucose for 24 h on the viability of RSC96 cells.Mean±SD. n=5.*P＜0.01 vs control（Con）group.圖1 不同濃度葡萄糖處理24 h對RSC96細(xì)胞活力的影響

2 Pue最佳作用濃度

DPN損傷細(xì)胞模型建立后，檢測不同濃度的Pue預(yù)處理對細(xì)胞活力以及凋亡和炎癥因子蛋白表達(dá)的影響，探討Pue 的最佳作用濃度。實(shí)驗(yàn)分為Con 組、DMSO 組、HG 組和 HG+Pue（0.1、1 和 10 mmol/L）組共6 個(gè)組。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Con 組相比，HG組RSC96 細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與HG 組相比，1 mmol/L 的 Pue 可顯著提高 HG 條件下 RSC96 細(xì)胞的活力（P＜0.05），見圖3。

為了更詳細(xì)確定Pue 的最佳濃度，我們在1 mmol/L 前后設(shè)幾個(gè)不同濃度。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 mmol/L 的Pue 可顯著降低HG 環(huán)境下RSC96 細(xì)胞凋亡蛋白和炎癥因子蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），見圖4。

3 Pue和PDTC提高HG環(huán)境下RSC96細(xì)胞活力

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HG 組 RSC96 細(xì)胞活力顯著低于Con組（P＜0.05）；與HG組相比，HG+Pue組和HG+PDTC 組 RSC96 細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），見圖5。

4 Pue 和 PDTC 降低 HG 環(huán)境下 RSC96 細(xì)胞上清液中促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平

ELISA 結(jié)果顯示，與Con組相比，HG 組RSC96細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6水平顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)Pue 或 PDTC 處理后，RSC96 細(xì)胞上清液中 IL-1β 和IL-6水平顯著降低（P＜0.05），見圖6。

5 Pue 和 PDTC 降低 HG 環(huán)境下 RSC96 細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的蛋白水平

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 Con 組相比，HG組 NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β 和 TNF-α 的蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+Pue和 HG+PDTC 組以上指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05），見圖7。

6 Pue和PDTC抑制NF-κB核易位

免疫熒光染色結(jié)果顯示，HG 使 NF-κB 信號激活，其特征是由細(xì)胞質(zhì)表達(dá)變化為細(xì)胞核表達(dá)，而Pue 和 PDTC 均可抑制 NF-κB 的核易位（P＜0.05），見圖8。

討 論

炎癥反應(yīng)失調(diào)可引發(fā)多種慢性疾病，進(jìn)而導(dǎo)致免疫因子失調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)NF-κB 通路導(dǎo)致胰島素抵抗［9］，炎癥與DPN 發(fā)病相互影響。施萬細(xì)胞對葡萄糖和胰島素水平較敏感，與DPN 的發(fā)病密切相關(guān)。在DPN 發(fā)生過程中，高血糖可引起施萬細(xì)胞凋亡［10-11］。施萬細(xì)胞在DPN 發(fā)病機(jī)制中起重要作用，是糖尿病神經(jīng)病變的重要治療靶點(diǎn)［12］。本文探討的糖尿病周圍神經(jīng)損傷體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图词窃谳^高濃度葡萄糖環(huán)境下，施萬細(xì)胞受損，模擬糖尿病患者施萬細(xì)胞損傷情況。與常規(guī)HG 的葡萄糖濃度（100～200 mmol/L）相比，我們采用更高的葡萄糖濃度（400 mmol/L）模擬超高濃度葡萄糖條件下施萬細(xì)胞的存活狀態(tài)及炎癥細(xì)胞因子分泌水平，再通過藥物預(yù)處理來驗(yàn)證對施萬細(xì)胞的保護(hù)作用。

Figure 2. Effect of 400 mmol/L glucose（high glucose，HG）culture for different time on the expression of apoptotic protein and inflammatory cytokines in the RSC96 cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control（Con）group.圖2 400 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)不同時(shí)間對RSC96細(xì)胞中凋亡蛋白和炎癥因子蛋白水平的影響

Figure 3. Effects of pretreatment with puerarin（Pue）at different concentrations on the viability of RSC96 cells in high glucose（HG；400 mmol/L glucose）environment detected by CCK-8 assay. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs HG group.圖3 不同濃度葛根素預(yù)處理對高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞活力的影響

神經(jīng)元的炎癥損傷導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病，NF-κB和炎癥細(xì)胞因子是神經(jīng)血管損傷和神經(jīng)傳導(dǎo)速度受損的主要原因［13］。有研究顯示，Pue可抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化，下調(diào) IL-1β、TNF-α 和 IL-6 表達(dá)［14］。同時(shí)也有研究證實(shí)，Pue 可抑制 NF-κB 和 Akt 通路，誘導(dǎo) K562/ADR 細(xì)胞自噬功能增強(qiáng)［15］。Pue 還可降低 NF-κB 和IL-1β 蛋白水平，提高 TGF-β 以及 IL-10 的蛋白表達(dá)，進(jìn)而緩解因化療引起的神經(jīng)性疼痛，其作用機(jī)制與通過NF-κB 信號通路維持抗炎和促炎細(xì)胞因子的平衡有關(guān)［16］。以上研究提示 Pue 可能通過阻斷NF-κB引起的促炎效應(yīng)而在其他疾病中有治療作用。本研究顯示，Pue 預(yù)處理可明顯提高HG 環(huán)境下細(xì)胞活力，降低HG環(huán)境下凋亡蛋白caspase-3及NF-κB通路相關(guān)蛋白NF-κB p65、IL-1β 和TNF-α 表達(dá)水平，提示Pue可減輕HG環(huán)境下細(xì)胞凋亡及炎癥損傷。

Figure 4. Effects of pretreatment with puerarin（Pue）at different concentrations on the production of apoptotic protein and inflammatory cytokines in the RSC96 cells in high glucose（HG；400 mmol/L glucose）environment. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs HG group.圖4 不同濃度葛根素預(yù)處理后對高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞中凋亡蛋白和炎性細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. Effects of pretreatment with puerarin（Pue）or PDTC on the viability of RSC96 cells in high glucose（HG）environment. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs HG group.圖5 葛根素或PDTC 預(yù)處理對高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞活力的影響

NF-κB 是一個(gè)經(jīng)典的炎癥相關(guān)信號通路，NF-κB主要被TNF-α 及IL-1β 等促炎細(xì)胞因子激活，同時(shí)可調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，影響細(xì)胞存活，在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和凋亡等病理進(jìn)程中具有重要作用［17］。NF-κB 可誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，而促炎細(xì)胞因子也可活化NF-κB，從而形成級聯(lián)效應(yīng)，放大炎癥損傷［18］。NF-κB 信號通路與 DPN 發(fā)病密切相關(guān)，DPN患者血液中炎癥細(xì)胞因子、黏附分子和趨化因子（如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1 和C-反應(yīng)蛋白）增多，細(xì)胞因子產(chǎn)生的失衡或受體的失衡與多種疾病相關(guān)［19］。神經(jīng)損傷后產(chǎn)生的促炎及抗炎細(xì)胞因子可能在施萬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和促進(jìn)軸突再生過程中保持平衡，提示炎癥細(xì)胞因子或與施萬細(xì)胞受損密切相關(guān)，抑制 NF-κB 或可減輕 DPN［13，20-22］。本文僅針對Pue從調(diào)控促炎細(xì)胞因子方面減輕HG誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞炎癥損傷，而炎癥損傷與抗炎及促炎因子之間的關(guān)系密切相關(guān)，因此可進(jìn)一步研究Pue 是否對抗炎細(xì)胞因子有促進(jìn)作用，以便更深層次探討Pue 通過減輕炎癥反應(yīng)而抑制DPN的機(jī)制。

Figure 6. The levels of IL-1β and IL-6 in the supernatant of RSC96 cells cultured in high glucose（HG）environment after puerarin（Pue）or PDTC pretreatment. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs high glucose group.圖6 葛根素或PDTC預(yù)處理后高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6的表達(dá)

Figure 7. Effect of puerarin（Pue）or PDTC pretreatment on the protein levels of pro-inflammatory cytokines in RSC96 cells in high glucose（HG）environment. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs HG group.圖7 葛根素或PDTC預(yù)處理后高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞促炎細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響

Figure 8. Effects of puerarin（Pue）or PDTC pretreatment on NF-κB nuclear translocation in RSC96 cells in high glucose（HG）environment. Cell images under confocal laser scanning microscope were shown. Red represented NF-κB，blue represented DAPI，and purple represented co-localization. The quantitative analysis of colocalization coefficient was performed. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs HG group.圖8 葛根素或PDTC預(yù)處理對高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞NF-κB核易位的影響

綜上所述，本研究采用HG 誘導(dǎo)RSC96 細(xì)胞，構(gòu)建RSC96細(xì)胞炎癥損傷模型；Pue可減少RSC96細(xì)胞損傷后促炎細(xì)胞因子的釋放，減輕細(xì)胞炎癥損傷，該現(xiàn)象可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。