丁苯酞軟膠囊通過下調(diào)miR-137促進(jìn)線粒體自噬對(duì)帕金森病大鼠發(fā)揮保護(hù)作用*

王文文， 邵彥江， 張新樂， 張金蘋， 馬 琪， 徐國衛(wèi)

（1鄭州市第七人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州450000；2鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450001；3鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南鄭州450000；4鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南鄭州450007）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一種進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)障礙，由紋狀體-黑質(zhì)致密部中多巴胺能神經(jīng)元逐漸丟失引起［1］。PD 的主要特征是運(yùn)動(dòng)功能障礙和其他非運(yùn)動(dòng)癥狀，如情緒和認(rèn)知變化、自主神經(jīng)功能障礙及睡眠障礙等；α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）的錯(cuò)誤折疊和聚集、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)清除受損、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激［2-3］等是其主要的致病機(jī)制。自噬是線粒體清除受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的主要途徑，對(duì)于維持線粒體的自穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞的存活至關(guān)重要，據(jù)報(bào)道線粒體和自噬障礙與PD 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，已被認(rèn)為是PD治療的潛在治療靶標(biāo)［4-5］。

丁苯酞（DL-3-n-butylphthalide，NBP）是神經(jīng)內(nèi)科常用的藥物，具有保護(hù)線粒體功能、改善微循環(huán)、提高抗氧化酶活性及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等多種神經(jīng)保護(hù)作用［6-7］，其治療 PD 效果良好，可安全有效地改善PD患者的運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)癥狀［8-9］，但其作用機(jī)制尚不清楚。NBP 可通過提高泛素連接酶parkin 的泛素化活性促進(jìn)線粒體自噬，改善阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）小鼠認(rèn)知障礙［10］。微小 RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類小的非編碼RNA，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miR-137 能夠靶向作用于多巴胺受體，參與多巴胺能神經(jīng)元的增殖、凋亡和分化等反應(yīng)［11］。近年來研究顯示，miR-137 在PD 患者血液樣本中高表達(dá)，并可能通過調(diào)控parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬，參與 PD 的發(fā)生［12-13］。而NBP對(duì)PD的改善作用是否與miR-137介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)，還未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過構(gòu)建PD 大鼠模型，觀察NBP 對(duì)PD 大鼠線粒體自噬的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 120 只，7～8 周齡，體重200～230 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證為SCXK（京）2019-0009。將動(dòng)物在受控的環(huán)境條件［環(huán)境溫度（24±2）℃，濕度（55±5）%，光照12h/黑暗12 h］下飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。研究已由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑及儀器 NBP 軟膠囊（國藥準(zhǔn)字H20050299，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，A14200036205，規(guī)格：0.1 g×24粒）；6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA；Sigma）；腦內(nèi)miR-137 模擬物（Agomir-137）、陰性對(duì)照Agomir-NC 及miR-137引物序列均購自GenePharma；阿樸嗎啡（apomorphine，APO；Sigma）；Trizol RNA 分離試劑及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購自TaKaRa；組織線粒體分離試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 法）、RIPA 裂解液和BCA 試劑盒均購自碧云天生物科技公司；兔抗大鼠酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、α-Syn、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）A/B 和 PTEN 誘導(dǎo)假 定 激 酶 1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）、p62 和 β-actin 抗體，山羊抗兔 IgG H&L（HRP），小鼠抗大鼠parkin 抗體，以及兔抗小鼠IgG H&L（HRP）購自Abcam。

DB006-1型數(shù)顯腦立體定位儀（北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司）；大鼠疲勞轉(zhuǎn)棒儀（UGO BASILE）；H-7500 型透射電子顯微鏡（HITACHI）；蛋白轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad）；BX61電動(dòng)顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 模型制備與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，參考文獻(xiàn)方法采用6-OHDA 兩點(diǎn)注射法制備PD 模型［14-15］。具體操作為：戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，取俯臥位，將頭部固定于腦立體定位儀中，脫去顱頂毛發(fā)，碘伏消毒后剪開頭皮，暴露顱頂前囪，參照《大鼠立體定位圖譜》選取右側(cè)腦部黑質(zhì)坐標(biāo)：A 點(diǎn)（硬膜下7.6 mm，中縫右2.4 mm，前囟后方5.0 mm）、B 點(diǎn)（硬膜下7.8 mm，中縫右側(cè)1.6 mm，前鹵后方5.6 mm），顱骨鉆鉆透顱骨，用10 μL的 Hamilton 注射器在 A、B 兩點(diǎn)注射 2 μL 的 6-OHDA（5 g/L 溶于含0.2 g/L 抗壞血酸的無菌生理鹽水中以防止氧化），以0.5 μL/min 的速度輸送，結(jié)束后留針10 min 再緩慢退針；在兩個(gè)坐標(biāo)上總共注入了20 μg的6-OHDA（每個(gè)位點(diǎn)注入 10 μg）。另選21 只大鼠為假手術(shù)組（sham 組），采用相同方法麻醉、開顱、打孔，兩點(diǎn)分別注射等體積的溶劑（含0.2 g/L 抗壞血酸的無菌生理鹽水）。常規(guī)縫合、消毒，連續(xù)3 d腹腔注射青霉素預(yù)防感染。模型成功的鑒定標(biāo)準(zhǔn)［14］：造模 1 周后，腹腔注射 0.5 mg/mL 的 APO，10 min 后觀察大鼠逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)圈數(shù)；除sham 組外，參與造模的大鼠共99只，造模過程中有5只大鼠死亡，94只大鼠進(jìn)行APO 旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，均造模成功。然后從sham組和造模組大鼠中隨機(jī)抽取3 只進(jìn)行心臟灌注后取腦，免疫組化法檢測大鼠腦黑質(zhì)TH和α-Syn的表達(dá)，以進(jìn)一步確定造模是否成功；若大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥7 次/min，且腦黑質(zhì)TH 陽性表達(dá)顯著降低，α-Syn陽性表達(dá)顯著增加，則為造模成功。

取90 只模型制備成功的大鼠隨機(jī)分為模型（model）組、低劑量（36 mg/kg）NBP（NBP-L）組、高劑量（72 mg/kg）NBP（NBP-H）組 、NBP（72 mg/kg）+Agomir-NC（10 nmol）組 和 NBP（72 mg/kg）+Agomir-137（10 nmol）組，每組 18 只。NBP 各劑量組給予相應(yīng)劑量的NBP 灌胃，每天1 次，連續(xù)給藥21 d；NBP+Agomir-NC 組和 NBP+Agomir-137 組在給予 72 mg/kg NBP 灌胃前，通過側(cè)腦室注射（前囟前0.3 mm，腹側(cè)3.6 mm，左側(cè)1.1 mm）分別將Agomir-NC 和Agomir-137 注射入大鼠的大腦；sham 組和model 組給予等體積生理鹽水側(cè)腦室注射和灌胃。

NBP 給藥劑量換算：根據(jù)臨床給藥劑量（70 kg成人給藥劑量400 mg/d），按種屬間體表面積換算，對(duì)應(yīng)大鼠給藥劑量為成人的6.3 倍，換算大鼠等效劑量為 36 mg·kg-1·d-1，因此，設(shè)置 NBP 低、高劑量為36 和 72 mg·kg-1·d-1。

2.2 旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 治療結(jié)束后，腹腔注射APO進(jìn)行旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)30 min 內(nèi)每只大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，取平均值。

2.3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 進(jìn)一步評(píng)估大鼠的精細(xì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和平衡能力。在測試前3 d 進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。參數(shù)設(shè)置：初始速度，8 r/min；最大速度，在300 s 內(nèi)達(dá)到30～40 r/min。在測試日，用同樣的程序進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)。自動(dòng)記錄大鼠掉落轉(zhuǎn)棒的時(shí)間，計(jì)算3 次實(shí)驗(yàn)的平均時(shí)間。

2.4 免疫組化法檢測黑質(zhì)中TH 和α-Syn 陽性表達(dá) 行為學(xué)檢測完成后，每組隨機(jī)選取6 只大鼠，左心室灌注后取腦，取右側(cè)腦組織固定在4%多聚甲醛中。石蠟包埋后過腦黑質(zhì)致密部（substantia nigra dense part，SNpc）作冠狀切片（3 μm）。切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶后將其用5%BSA 封閉30 min，然后在室溫下與Ⅰ抗（TH 和α-Syn，1∶500）孵育過夜。清洗后，與Ⅱ抗IgG（1∶500）進(jìn)行第2 次孵育1 h，DAB 顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察黑質(zhì)TH 和α-Syn 陽性表達(dá)情況（棕黃色）。每張切片選擇3 個(gè)區(qū)域，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析并測定光密度，取平均值。

2.5 透射電子顯微鏡觀察紋狀體線粒體自噬情況 取左側(cè)腦組織，分離紋狀體，在2.5%戊二醛中固定48 h 后，放入1%鋨酸固定液于4 ℃固定2 h，梯度乙醇脫水，包埋在環(huán)氧樹脂中。在80 ℃下進(jìn)行24 h 聚合，行超薄切片（約60～70 nm），乙酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察并拍照。

2.6 JC-1 法檢測腦黑質(zhì)-紋狀體線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）變化 每組隨機(jī)抽取6 只大鼠，取右側(cè)中腦黑質(zhì)紋狀體，分離線粒體（按照線粒體分離試劑盒說明操作）。將分離的線粒體重懸后，取10 μL 加入96 孔板中，然后每孔中加入90 μL 的JC-1 工作液，混合；用多功能酶標(biāo)儀測定紅、綠熒光強(qiáng)度，計(jì)算紅綠熒光強(qiáng)度比值。激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光為530 nm 時(shí)（綠色熒光，檢測JC-1 單體）的熒光值為A1；激發(fā)光為529 nm，發(fā)射光為590 nm 時(shí)（紅色熒光，檢測JC-1 聚合物）的熒光值為A2。各組的熒光值A(chǔ)=A2/A1，最終以相對(duì)熒光值（實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A）對(duì)MMP進(jìn)行定量分析。

2.7 RT-qPCR 檢測大腦miR-137 表達(dá)水平 剩余每組6 只大鼠，取腦后在冰上迅速分離出紋狀體，分為兩部分，一部分-80 ℃冰箱保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)；另一部分組織剪碎后，加入Trizol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測總RNA 濃度和純度，按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA（200 mg/ L）1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，進(jìn)行40 次循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，相對(duì)miR-137的表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

2.8 Western blot 檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)取-80 ℃冰箱保存的紋狀體組織，在含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA 裂解液中勻漿，12 000×g離心15 min，取上清，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，平衡蛋白濃度、變性后每孔取30 μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶封閉1 h，然后在4 ℃下與Ⅰ抗（PINK1、parkin、LC3A/B、p62 和 β-actin）孵育過夜。TBST 洗滌，加Ⅱ抗在室溫下孵育2 h。洗去Ⅱ抗，ECL顯色，分析膜上蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用SPSS 22.0 和Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間有差異進(jìn)一步采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PD大鼠模型的鑒定

APO 旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sham 組（6.85±0.57）相比，造模大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)（234.28±26.19）顯著增加（P＜0.01）。

免疫組化檢測結(jié)果顯示，與sham 組（1.00±0.00和1.00±0.00）相比，造模大鼠腦黑質(zhì)TH 陽性表達(dá)（0.59±0.07）顯著降低，α-Syn 陽性表達(dá)（1.86±0.21）顯著升高（P＜0.01），見圖 1。這說明PD 模型制備成功。

2 NBP對(duì)PD大鼠行為學(xué)的影響

與sham 組相比，model 組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著增加，掉落潛伏期顯著縮短（P＜0.05）；與model 組相比，NBP-L 組、NBP-H 組和 NBP+Agomir-NC 組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著減少，掉落潛伏期顯著增長（P＜0.05）；與NBP-H 組相比，NBP+Agomir-137 組的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著增加，掉落潛伏期顯著縮短（P＜0.05），見表2。

3 NBP對(duì)PD大鼠黑質(zhì)TH和α-Syn表達(dá)的影響

與sham 組相比，model 組大鼠黑質(zhì)TH 陽性表達(dá)顯著降低，α-Syn 陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與model 組相比，NBP-L 組、NBP-H 組和 NBP+Agomir-NC 組大鼠TH 陽性表達(dá)顯著升高，α-Syn 陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與 NBP-H 組相比，NBP+Agomir-137組大鼠TH陽性表達(dá)顯著降低，α-Syn陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖2、3及表3。

Figure 1. Immunohistochemical staining of TH and α-Syn in substantia nigra of rats in sham and model groups.The scale bar=200 μm.圖1 假手術(shù)組和模型組大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH 和α-Syn 的免疫組化染色

表2 各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和掉落潛伏期的比較Table 2. Comparison of the number of rotations and fall latency of rats in each group（Mean±SD. n=18）

4 NBP對(duì)PD大鼠線粒體自噬的影響

透射電鏡下可見，sham 組大鼠紋狀體細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，線粒體嵴清晰可見并未見斷裂，無明顯自噬體；model組線粒體染色加深、腫脹破裂，內(nèi)部嵴嚴(yán)重?cái)嗔鸦蛳В凶允审w產(chǎn)生；NBP 各劑量組較model 組線粒體腫脹及內(nèi)部嵴斷裂消失現(xiàn)象明顯減輕，線粒體形態(tài)趨于正常；而NBP+Agomir-137 組較NBP-H 組線粒體腫脹變形，內(nèi)部嵴數(shù)量減少、破壞加重，見圖4。

5 NBP對(duì)PD大鼠黑質(zhì)-紋狀體MMP的影響

與 sham 組相比，model 組大鼠 MMP 水平顯著降低（P＜0.05）；與model組相比，NBP-L組、NBP-H組和NBP+Agomir-NC 組大鼠 MMP 水平顯著升高（P＜0.05）；與 NBP-H 組相比，NBP+Agomir-137 組大鼠MMP水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

Figure 2. The results of immunohistochemical staining of TH in the substantia nigra of rats in each group. A：sham group；B：model group；C：NBP-L group；D：NBPH group；E：NBP+Agomir-NC group；F：NBP+Agomir-137 group. The scale bar=50 μm.圖2 各組大鼠黑質(zhì)TH免疫組化染色結(jié)果

Figure 3. The results of immunohistochemical staining of α-Syn in the substantia nigra of rats in each group. A：sham group；B：model group；C：NBP-L group；D：NBPH group；E：NBP+Agomir-NC group；F：NBP+Agomir-137 group. The scale bar=100 μm.圖3 各組大鼠黑質(zhì)α-Syn免疫組化染色結(jié)果

表3 各組大鼠黑質(zhì)TH和α-Syn陽性表達(dá)的比較Table 3. Comparison of the positive expression of TH and α-Syn in the substantia nigra of rats in each group（Mean±SD. n=6）

6 NBP對(duì)PD大鼠紋狀體miR-137表達(dá)的影響

Figure 4. Mitophagy status of rats in each group. A：sham group；B：model group；C：NBP-L group；D：NBPH group；E：NBP+Agomir-NC group；F：NBP+Agomir-137 group. Arrow：autophagosome；pentagram：chapped mitochondria with exudation. The scale bar=1 μm.圖4 各組大鼠線粒體自噬情況

與 sham 組相比，model組大鼠 miR-137 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與 model 組相比，NBP-L 組、NBP-H 組和 NBP+Agomir-NC 組大鼠 miR-137 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與 NBP-H 組相比，NBP+Agomir-137 組大鼠miR-137 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠MMP水平和miR-137表達(dá)的比較Table 4. Comparison of the level of MMP and the expression of miR-137 in each group（Mean±SD. n=6）

7 NBP對(duì)PD大鼠紋狀體線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與 sham 組相比，model組大鼠 PINK1 和parkin 表達(dá)及LC3-II/LC3-I 比值顯著增加，p62 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與 model 組相比，NBP-L 組、NBP-H 組和NBP+Agomir-NC 組大鼠 PINK1 和 parkin 表達(dá)及 LC3-II/LC3-I比值顯著增加，p62表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與 NBP-H 組相比，NBP+Agomir-137 組大鼠 PINK1 和parkin 表達(dá)和 LC3-II/LC3-I 比值顯著降低，p62 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. The expression of mitochondrial autophagy-related proteins in the striatum of rats in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs NBP-H group.圖5 各組大鼠紋狀體線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

討 論

NBP 軟膠囊是我國第1 個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的心血管類Ⅰ類新藥，用于治療缺血性腦卒中，也是我國腦血管病領(lǐng)域第1 個(gè)進(jìn)入美國FDA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）臨床試驗(yàn)的治療急性缺血性腦卒中的藥物，具有一系列的藥理機(jī)制，包括保護(hù)線粒體功能、抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡等［16］。NBP 可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥而發(fā)揮多巴胺能神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)PD 具有良好的治療作用［17］，從機(jī)理上講，NBP 主要通過激活自噬保護(hù)線粒體，降解α-Syn來保護(hù)神經(jīng)元［18］。

6-OHDA 是一種廣泛用于PD動(dòng)物模型的神經(jīng)毒素，可損傷大腦中黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙［19］，是經(jīng)典的構(gòu)建PD模型的方法之一，具有與PD 患者癥狀相似，多巴胺穩(wěn)定丟失，長時(shí)間內(nèi)無自發(fā)恢復(fù)的優(yōu)點(diǎn)［20］。因此，本研究采用6-OHDA 誘導(dǎo)構(gòu)建PD 模型，結(jié)果顯示，6-OHDA 誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)障礙、精細(xì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和平衡能力下降的現(xiàn)象，且TH 陽性表達(dá)減少，α-Syn 表達(dá)增加，與以往的研究結(jié)果一致，說明模型復(fù)制成功。NBP 各劑量組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較PD 大鼠顯著減少，在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間顯著高于PD 大鼠，提示NBP可以緩解PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙。

自噬是線粒體清除受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的主要途徑，對(duì)于維持線粒體的自穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞的存活至關(guān)重要。有報(bào)道顯示，在不同的神經(jīng)毒性PD 模型中均觀察到線粒體受損和自噬失調(diào)［21］。MMP為檢測細(xì)胞線粒體功能的早期指標(biāo)之一；PINK1和parkin是線粒體的標(biāo)志，對(duì)于維持線粒體的功能至關(guān)重要，與PD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［22］。當(dāng)線粒體受損時(shí)，PINK1在線粒體外膜上積累并招募parkin。隨后，parkin 泛素化線粒體，將泛素結(jié)合型自噬受體（如p62）募集到線粒體。最后，受損的線粒體被LC3 陽性自噬體吞噬，啟動(dòng)自噬-溶酶體系統(tǒng)［23］。增強(qiáng)PINK1/parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，可減輕PD 相關(guān)的線粒體功能障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［24］。本研究采用透射電子顯微鏡觀察紋狀體線粒體自噬情況，結(jié)果顯示PD 大鼠線粒體腫脹，內(nèi)部嵴嚴(yán)重?cái)嗔鸦蛳?，并有自噬小體形成，且MMP 降低，說明線粒體出現(xiàn)損傷；而線粒體損傷是引起自噬發(fā)生的主要原因之一。經(jīng)NBP 干預(yù)后，線粒體腫脹及內(nèi)部嵴斷裂明顯減輕，自噬小體數(shù)量增多，MMP 升高；Western blot 結(jié)果也顯示，NBP 可增加 PD 大 鼠 PINK1 和 parkin 表 達(dá) 及 LC3-II/LC3-I 比值，降低 p62 表達(dá)；與 Xu 等［24］的研究結(jié)果一致，提示NBP可促進(jìn)線粒體自噬。

miR-137是大腦中豐富的微小核糖核酸，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化和成熟與miR-137 的表達(dá)及其對(duì)下游靶基因的調(diào)控密切相關(guān)［25-26］。研究顯示，miR-137在PD 患者血液中存在高表達(dá)，miR-137 表達(dá)的降低能增強(qiáng) PD 模型的神經(jīng)保護(hù)特性［11，27］。Li 等［28］的研究顯示miR-137 能夠通過抑制線粒體自噬受體FUNDC1和NIX 的表達(dá)，減少與LC3結(jié)合的線粒體受體的數(shù)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體自噬；另有研究顯示miR-137 可能抑制parkin 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體，并抑制線粒體蛋白如Tom20、Tim23 和VDAC1 的降解及LC3-I型向LC3-II 型的轉(zhuǎn)換，減弱線粒體自噬程度；而細(xì)胞內(nèi)低水平的自噬正是 PD 的誘因之一［12］。NBP 可通過促進(jìn)parkin 及干擾去泛素化酶USP30 的表達(dá)提高parkin 的泛素化活性促進(jìn)線粒體自噬，改善AD 小鼠認(rèn)知障礙［10］，且 parkin 是 NBP 通過調(diào)控線粒體自噬發(fā)揮抗AD 作用的關(guān)鍵效應(yīng)因子［29］。本研究結(jié)果顯示PD 大鼠腦組織miR-137 的表達(dá)水平顯著升高，經(jīng)NBP 干預(yù)后，其表達(dá)水平降低，與線粒體自噬變化趨勢(shì)相反，提示NBP 對(duì)線粒體自噬的促進(jìn)作用可能與miR-137 表達(dá)水平的降低有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此推測，我們采用側(cè)腦室注射的方式將Agomir-137 注射到接受NBP 干預(yù)的PD 大鼠腦組織中，結(jié)果觀察到，NBP 對(duì)PD 大鼠線粒體自噬的促進(jìn)作用被顯著減弱；說明，NBP可能通過降低miR-137的表達(dá)，增強(qiáng)線粒體自噬，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)PD大鼠的保護(hù)作用。

綜上所述，NBP 對(duì)PD 大鼠的保護(hù)作用可能與降低miR-137 的表達(dá)，促進(jìn)線粒體自噬有關(guān)。但本研究尚存在一定不足，對(duì)PD 大鼠的非運(yùn)動(dòng)癥狀如認(rèn)知障礙未進(jìn)行檢測，后續(xù)將進(jìn)行補(bǔ)充研究；此外，本研究僅在動(dòng)物水平上進(jìn)行了初步探究，下一步將采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)此結(jié)論進(jìn)行深入驗(yàn)證。