丹蔞片通過鐵死亡途徑減輕非酒精性脂肪性肝病模型小鼠肝臟氧化損傷*

張 新， 陳文娜， 宋 囡， 朱敬軒， 劉雨彤

（遼寧中醫藥大學 1研究生院，2醫學檢驗學院，遼寧沈陽110000）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種臨床常見的代謝性疾病，主要特征為除酒精以外的其他因素引起的肝細胞脂肪變性，其已經成為21 世紀全球公認的公共健康問題之一［1］。近年來，隨著居民飲食結構的變化，NAFLD的發病率呈現逐年上升且年輕化的趨勢。流行病學調查研究表明，NAFLD的全球患病率約為24%，嚴重危害了人類的健康［2］，因此積極尋求治療NAFLD 的藥物至關重要。由于中草藥副作用較弱，且療效較好，使得中草藥成為人們尋求來治療NAFLD 的理想藥物。近來的研究多采用高脂喂飼ApoE-/-小鼠制備NAFLD 模型來探討鐵死亡在NAFLD 模型中的作用機制［3-4］。研究顯示，鐵死亡與脂代謝類疾病密切相關，鐵死亡可能是導致NAFLD 發生的重要病理機制之一［5］。鐵死亡是一種不同于壞死、凋亡和自噬等的新型程序性死亡方式，其主要病理特征為Fe2+催化的芬頓化學反應促進了脂質過氧化的發生，引起細胞氧化損傷破壞細胞膜導致細胞死亡［6］。

丹蔞片主要是由川芎、丹參、瓜蔞、薤白、葛根、赤芍、郁金、骨碎補、澤瀉和黃芪十味中藥組成，以益氣通陽、化瘀散結功效組方。方中瓜蔞、薤白、骨碎補和郁金有降低血脂水平和抗動脈粥樣硬化等作用［7-8］；澤瀉、黃芪和葛根有抗氧化應激損傷保護血管內皮細胞作用［9-10］；丹參、川芎和赤芍有改善降低毛細血管通透性、改善血液流變、調節血小板抗凝功能、降低血液黏度等作用［11］。同時，現代藥理學研究表明，丹蔞片也有降低血脂水平、改善血管內皮功能、肝臟脂質沉積及治療動脈粥樣硬化等作用［12］。但丹蔞片能否通過鐵死亡途徑調節NAFLD 模型小鼠肝臟氧化損傷，以往研究中卻鮮有報道。故本研究采用高脂飼料飼喂ApoE-/-小鼠的方法復制NAFLD模型，探討丹蔞片通過鐵死亡途徑調節NAFLD 模型小鼠肝臟氧化損傷的機制，以期為治療NAFLD 的深入研究提供實驗依據。

材料和方法

1 實驗動物

SPF 級ApoE-/-雄性小鼠 16 只，C57BL/6J 小鼠 8只，8 周齡，體質量18～22 g，均購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2012-0001。飼養于全封閉SPF級狀態下的遼寧中醫藥大學實驗動物中心，保證動物自由進食與飲水。動物實驗經遼寧中醫藥大學動物倫理委員會批準，并按照《實驗動物飼養管理和使用指南》進行。

2 試劑與儀器

丹蔞片（吉林康乃爾藥業有限公司）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（四川邁克生物科技股份有限公司）；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（南京建成生物有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、腫瘤壞死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和Fe2+檢測試劑盒（Elabscience）；鐵反應元件結合蛋白2（iron-responsive element-binding protein 2，IREB2）和鐵蛋白重鏈 1（ferritin heavy chain 1，FTH1）抗體（Immunoway）；谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體（Abcam）；引物（Sangon Biotech）。Tanon 5200 化學發光成像系統（上海天能科技有限公司）；AU5800 全自動生化分析儀（Beckman Coulter）；電泳槽和轉膜儀（Bio-Rad）；實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

3 主要方法

3.1 模型制備、分組及干預 取16只ApoE-/-小鼠隨機分為模型（model）組和丹蔞片組，每組8 只，另取8只C57BL/6J 小鼠作為正常對照（control）組。適應性喂養1 周后，正常對照組每日飼喂基礎飼料，模型組和丹蔞片組每日給予高脂飼料喂飼8 周，之后每組隨機抽取2只ApoE-/-小鼠解剖觀察小鼠肝臟特征，同時多聚甲醛固定后 HE 染色［13-14］。確定 NAFLD 造模成功后，丹蔞片組參考人和動物體表面積折算的等效劑量比率表換算小鼠每日需用量為680 mg/kg，于是丹蔞片組小鼠按照680 mg·kg-1·d-1連續灌胃干預4周，正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃4周［15-16］，12周后取材并置于-80 ℃冰箱保存。

3.2 小鼠血脂、AST 和ALT 檢測水平 利用眼球采血法收集小鼠血液，置于含有4%檸檬酸鈉抗凝管中靜置 30 min 后，594×g離心 25 min 后，按照試劑說明書步驟操作檢測血清LDL-C、HDL-C、TC、TG、AST 和ALT水平，最后對數據進行統計分析。

3.3 HE 染色觀察肝組織的病理形態 將小鼠肝臟固定于4%多聚甲醛中72 h，按常規HE 染色方法進行染色。組織經梯度脫水、透明后進行石蠟包埋，切片；之后經二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水后，蘇木精染色、70%鹽酸乙醇分化、伊紅復染，再次梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，光鏡下觀察肝組織形態。

3.4 油紅O 染色觀察肝臟脂質沉積 將各組小鼠肝臟依次放入15%和30%的蔗糖中脫水，OCT 包埋做成冰凍切片，油紅O 染色10 min，75%的乙醇分化，水洗后蘇木素復染，流水沖洗，甘油明膠封片，光鏡下觀察肝臟脂質沉積情況。

3.5 比色法檢測各組小鼠肝組織Fe2+水平 將肝組織研磨勻漿稀釋為10%組織勻漿液，根據比色法按照試劑盒說明檢測各組小鼠肝組織Fe2+水平。

3.6 免疫組化檢測肝臟FTH1、IREB2 和GPX4 蛋白表達 將石蠟切片按照常規操作，進行脫蠟、微波爐修復、封閉后，分別加入 GPX4、IREB2 和 FTH1 Ⅰ抗孵育過夜、Ⅱ抗孵育、顯色、蘇木素復染、1%鹽酸乙醇分化、水洗返藍、脫水透明，中性樹脂封片后光鏡下觀察。

3.7 各組小鼠肝組織SOD 活性及MDA 和GSH 含量的檢測 取0.1 g 的小鼠肝組織研磨成勻漿液，用預冷的PBS 將其稀釋為10%肝臟組織勻漿液待用。4 ℃、10 000×g離心10 min 取上清置于冰上待測。按照試劑盒說明書測定SOD 活性及MDA 和GSH水平。

3.8 Western blot 法檢測肝臟組織 GPX4、IREB2 和FTH1 蛋白表達 隨機數表法選取各組小鼠3 只，取其肝臟組織中加入RIPA 蛋白裂解液，研磨棒充分研磨后置于冰上30 min，4 ℃、13 684×g離心10 min，取上清測定蛋白濃度。取適量蛋白加入SDS-PAGE 上樣緩沖液混勻，100 ℃變性5 min。按照60 μg上樣量算出各組樣本上樣體積進行電泳并恒壓濕轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。孵育Ⅰ抗過夜，TBST 洗膜3 次后，加入對應Ⅱ抗，孵育1 h；重復洗膜步驟，ECL 化學發光顯色，分析灰度值，用目的蛋白與內參蛋白比值作為目的蛋白表達水平。

3.9 RT-qPCR 法檢測肝組織 GPX4、IREB2 和 FTH1的mRNA 表達水平 稱取小鼠肝臟組織30 mg，Trizol 法提取組織RNA，具體步驟按照試劑盒說明書操作，用核酸/蛋白定量儀來檢測RNA 的濃度和A260/A280值，以判斷RNA 提取純度。利用Prime-Script?RT Enzyme Mix 試 劑 盒 將 RNA 逆 轉 錄 成cDNA，加入擴增反應體系運用實時熒光定量PCR法擴增，40 個循環反應結束后用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，檢測基因mRNA 相對表達水平。以GAPDH為內參照，引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物的序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.10 ELISA 法檢測小鼠肝臟 TNF-α 和 IL-6 表達水平 將肝組織和PBS 按1∶9 的比例進行研磨勻漿稀釋為10%組織勻漿液，根據ELISA 試劑盒說明書，檢測各小鼠肝臟TNF-α和IL-6水平。

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析。計量數據均以（mean±SD）表示。多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠血脂水平及AST和ALT水平比較

與正常對照組相比，模型組小鼠血清LDL-C、TG、TC、ALT 和 AST 水平顯著升高，HDL-C 水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，丹蔞片組小鼠血清LDLC、TG、TC、ALT 和 AST 水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C 水平升高，但差異無統計學意義，見圖1A～F。

Figure 1. Effect of Danlou tablets on the serum levels of lipids，AST，ALT and Fe2+ in the mice of each group. A：TG；B：TC；C：HDL-C；D：LDL-C；E：AST；F：ALT；G：Fe2+. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs Danlou tablet group.圖1 丹蔞片對各組小鼠血脂、AST、ALT及Fe2+水平影響

2 各組小鼠肝臟病理學變化

正常對照組小鼠肝小葉結構正常，細胞核圓且居中，細胞質內未見脂滴，肝索條理清晰且肝竇未見狹窄；模型組肝細胞腫脹變性明顯，體積明顯增大，細胞質內有大量的脂滴空泡，肝竇狹窄或消失；丹蔞片組脂滴明顯減少，肝細胞脂肪變性程度減輕，肝細胞體積部分恢復正常，肝竇狹窄有所減輕，見圖2。

3 油紅O染色結果

正常對照組小鼠細胞核染為藍色，肝細胞內未見橘紅色脂滴，肝竇結構正常；模型組小鼠肝細胞細胞質內可見彌漫性橘紅色脂滴，脂質嚴重蓄積；與模型組相比，丹蔞片組小鼠肝細胞細胞質內橘紅色脂滴明顯減少，脂質蓄積程度減輕，見圖3。

4 各組小鼠肝組織Fe2+水平

Figure 2. Pathomorphological changes of mouse liver tissues in each group（HE staining，scale bar=50 μm）. The more lipid droplet vacuoles in the cytoplasm，the more obvious swelling and degeneration of hepatocytes. A：control group；B：model group；C：Danlou tablet group.圖2 各組小鼠肝組織的病理形態結果

Figure 3. Results of liver lipid deposition in the mice of each group（oil red O staining，scale bar=50 μm）. Blue：nucleus；orange：lipid droplet. More orange lipid droplets mean more serious lipid accumulation. A：control group；B：model group；C：Danlou tablet group.圖3 各組小鼠肝臟脂質沉積情況

與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織Fe2+水平顯著升高；與模型組相比，丹蔞片組小鼠肝組織Fe2+水平顯著降低，見圖1G。

5 各組小鼠肝組織形態學變化和鐵死亡相關蛋白表達的免疫組化檢測結果

與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織GPX4和FTH1 蛋白表達水平減低，細胞核呈藍色，細胞質呈棕黃色且顏色較淺，IREB2 蛋白表達水平升高，棕黃色較深，肝細胞腫脹變性顯著，細胞質內有大量脂肪空泡；丹蔞片干預后，GPX4和FTH1蛋白表達水平升高，細胞質呈棕黃色且顏色較深，IREB2 蛋白表達水平減低，棕黃色較淺，肝細胞腫脹變性情況減輕，脂肪空泡數量顯著減少，見圖4。

6 各組小鼠肝組織GSH、MDA和SOD表達水平

與正常對照組相比，模型組肝組織GSH 和SOD水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；在丹蔞片的干預下，肝組織GSH 和SOD 水平顯著升高，MDA水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

7 各組小鼠肝組織中IREB2、GPX4 及FTH1 蛋白表達情況

與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織GPX4和FTH1 蛋白表達水平呈現下降趨勢，但IREB2 蛋白表達水平呈現上升趨勢（P＜0.05）；丹蔞片干預后GPX4和FTH1 蛋白表達水平顯著升高，IREB2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖6。

8 各組小鼠肝組織相關mRNA的表達水平

與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織GPX4和FTH1 的 mRNA 表達水平顯著降低，IREB2 的 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；丹蔞片干預后GPX4和 FTH1 的 mRNA 表 達 水 平顯著升高，IREB2 的mRNA表達水平顯著減低（P＜0.05），見圖7。

9 各組小鼠肝組織TNF-α和IL-6的表達情況

模型組肝組織TNF-α 和IL-6 表達水平與正常對照組相比升高（P＜0.05），丹蔞片干預后TNF-α 和IL-6表達水平減低（P＜0.05），見圖8。

討 論

NAFLD在飲食結構的變化及高強度壓力等多重因素作用下，發病率逐年攀升，嚴重危害人們的健康，故對其防治具有重要意義。而中醫學中并無“脂肪肝”這一病名，但依據其臨床表現，將其歸為“脂濁”“濁阻”“痰濕”“血瘀”等病癥范疇?！蹲C治匯補》云；“脾胃受虧，濁氣含痰，未能運化即為患。”常食肥甘厚味者，水谷精微運化失常，肝失疏泄，脾失健運，則氣機不暢，津液內聚則痰濁內蘊，阻塞于脈，日久積為膏脂。

Figure 4. Morphological changes and ferroptosis-related protein expression in mouse liver tissues in each group（immunohistochemical staining，scale bar=40 μm）. Blue represents the nucleus，while yellow represents the cytoplasm. The darker in the cytoplasm，the higher protein expression.圖4 免疫組化檢測各組小鼠肝組織形態學變化和鐵死亡相關蛋白表達

Figure 5. Effect of Danlou tablets on oxidative stress indexes in each group. A：MDA；B：GSH；C：SOD. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs Danlou tablet group.圖5 丹蔞片對各組小鼠氧化應激指標水平的影響

丹蔞片方中的薤白和瓜蔞，寬胸散結，化瘀通陽，為君藥，取自張仲景的《金匱要略》治療胸痹心痛之名方“瓜蔞薤白白酒湯”；赤芍、丹參、川芎和葛根，活血化瘀通絡，為臣藥；澤瀉和黃芪，利水滲濕，補氣健脾行血，為佐藥；骨碎補，活血補腎，郁金、川芎和丹參專入心肝二經，皆有引經報使之功效。如此君臣佐使相輔相成，集宣痹、化痰、化瘀、通滯、理氣、養血于一體，從而達到治療NAFLD的目的。

細胞鐵死亡及其引起的肝細胞氧化損傷是NAFLD 發病的重要環節［17］。而 Fe2+作為誘發細胞鐵死亡和NAFLD 發生發展的主要致病因素，可導致肝臟氧化應激和炎癥反應［18-19］，而本研究利用鑒定細胞鐵死亡發生的常用指標 GPX4［20］，初步證實了 Fe2+可顯著誘導肝細胞鐵死亡。本研究通過觀察NAFLD模型小鼠的Fe2+水平，同樣觀察到NAFLD 模型小鼠中Fe2+的升高可引起細胞鐵死亡及肝臟氧化損傷，此結果與相關研究報道相一致［21-22］。因此，抑制Fe2+誘導的細胞鐵死亡是NAFLD防治的重要策略。

Figure 6. Effects of Danlou tablets on the protein expression of FTH1，GPX4 and IREB2 in each group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs model group.圖6 丹蔞片對各組小鼠FTH1、GPX4和IREB2蛋白表達的影響

Figure 7. Effect of Danlou tablets on the mRNA levels of indicators of ferroptosis，FTH1（A），GPX4（B）and IREB2（C），in each group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs Danlou tablet group.圖7 丹蔞片對各組小鼠鐵死亡指標FTH1、GPX4和IREB2 mRNA水平影響

細胞鐵死亡發生的關鍵分子機制是Fe2+水平的升高促進IREB2 蛋白泛素降解，與鐵調節蛋白親和力減弱，抑制FTH1 的表達，引起細胞鐵死亡并向胞外釋放出 IL-6 和 TNF-α 等炎癥介質及 MDA 等氧化應激因子而引發更為嚴重的氧化損傷反應［23-25］。目前體內和體外實驗研究已充分表明高脂飲食和其他NAFLD 發病危險因素如Fe2+均可通過調控鐵死亡因子引起細胞鐵死亡而引發肝臟氧化損傷及NAFLD的發生發展［17，20-21］。在本研究中，我們也觀察到Fe2+可通過上調IREB2，下調FTH1 和GPX4 的表達促使IL-6、TNF-α 和 MDA 水平升高，SOD 及 GSH 水平降低。因此，本研究結果進一步表明鐵死亡通路的激活可能引起炎癥反應和氧化應激反應，進而參與了NAFLD 的進程，并且Fe2+誘導的肝細胞鐵死亡對于探討NAFLD的關鍵機制具有重要意義。

Figure 8. Effects of Danlou tablets on inflammatory indexes in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 model group.圖8 丹蔞片對各組小鼠炎癥指標影響

丹蔞片作為一種復方片劑，可通過調節不同生物學過程發揮抗脂、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用［8，11］，然而丹蔞片是否可調控細胞鐵死亡介導的NAFLD 的發生發展尚未完全清楚。在本研究中，我們利用丹蔞片深入研究了其對Fe2+誘導的細胞鐵死亡和鐵死亡標志蛋白表達的影響。結果顯示丹蔞片可通過下調IREB2，上調FTH1 和GPX4 蛋白及mRNA 的表達而抑制Fe2+誘導的細胞鐵死亡。雖然已有研究表明可通過調控鐵死亡通路標志蛋白（FTH1、GPX4 或胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白）的表達而發揮治療 NAFLD 作用［17，21，26］，但以上研究因缺乏細胞鐵死亡關鍵指標（鐵代謝蛋白IREB2）的檢測而未能充分闡明對細胞鐵死亡的調控作用。而本研究結果不僅顯示出丹蔞片對Fe2+誘導的細胞鐵死亡有抑制作用，且還通過對細胞鐵死亡指標FTH1、GPX4 及IREB2 蛋白與mRNA 的表達檢測進一步闡明了丹蔞片可通過鐵死亡途徑調控NAFLD 模型小鼠肝臟氧化損傷的機制。

綜上所述，丹蔞片對NAFLD 模型小鼠的防治可能是通過抑制肝細胞鐵死亡，降低肝臟氧化應激水平和炎癥因子水平來實現的。