梓醇通過PPARγ/NF-κB信號通路減輕2型糖尿病大鼠肝臟損傷*

王冉冉， 孫政勤， 劉江月

（1山東大學附屬威海市立醫院消化科，山東威海264200；2濰坊醫學院病理生理教研室，山東濰坊261053）

隨著社會的發展，人們飲食結構的改變，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發病率正在節節攀升。糖尿病患者多伴有多器官并發癥，這也是導致T2DM 患者死亡的主要原因。流行病學調查顯示，糖尿病患者中合并肝臟病變者高達50%以上，其中非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）最常見［1］，若不進行干預治療，可進一步發展成為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化，甚至肝癌［2］。研究顯示，糖尿病患者中終末期肝病的死亡率顯著高于心血管疾病［3］。目前認為，T2DM 糖脂代謝紊亂導致的氧化應激過度及炎癥因子的異常分泌，是糖尿病肝損傷的主要發生機制［4］。NF-κB是多種炎癥信號通路的關鍵因子，NF-κB 激活后可促進多種炎癥因子釋放，介導炎癥反應的發生［5］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）是配體活化型的核轉錄因子，可減少 NF-κB 活化，是 NF-κB 關鍵的負調控因子，具有抑制炎癥因子生成的重要作用［6］。梓醇（catalpol，CAT）屬于環烯醚萜類化合物，是地黃的有效活性成分，具有降低血糖、抗氧化應激和抗炎［7-8］等多種藥理作用。課題組前期研究發現，梓醇能夠減輕糖尿病早期內皮細胞損傷［9-10］，保護糖尿病大血管［11］，但梓醇對2 型糖尿病引起的肝臟損傷是否同樣具有保護作用呢？其作用是否與PPARγ/NF-κB信號通路有關？均未見報道。本研究通過觀察梓醇對 T2DM 大鼠肝臟的影響，并從 PPARγ/NF-κB 信號通路的角度探討其可能機制。

材料和方法

1 動物與飼料

清潔級 SD 大鼠，體重180～220 g，購自濟南金豐實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（魯）2014-0006。普通飼料及高脂飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

2 試劑與儀器

梓醇（純度≥98%）購于成都植標化純生物科技有限公司；二甲雙胍（metformin，MET）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；水飛薊素（silymarin，SIL）購自上海麥克林生化科技有限公司；血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒、抗 NF-κB 和 PPARγ 抗體及 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction 試劑盒均購于碧云天生物技術研究所。PCR 儀、轉膜儀和凝膠成像分析儀購自Bio-Rad。

3 方法

3.1 動物模型的建立與分組 70只清潔級SD 大鼠適應性飼養1周，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）后，選取血糖大于11.1 mmol/L 的60只大鼠，隨機分為糖尿病模型（model，MOD）組、二甲雙胍（MET；100 mg·kg-1·d-1）組、水飛薊素（SIL；100 mg·kg-1·d-1）組 、梓 醇 低 劑 量（low-dose CAT，CAT-L；10 mg·kg-1·d-1）組、梓醇中劑量（middle-dose CAT，CAT-M；50 mg·kg-1·d-1）和梓醇高劑量組（highdose CAT，CAT-H；100 mg·kg-1·d-1）組，高脂飼料喂養，另以10 只健康雄性SD 大鼠為對照（control，CON）組，普通飼料喂養，造模同時灌胃給藥，造模時間8 周。于8 周末麻醉大鼠，稱量體重，腹主動脈快速取血備用，隨后處死大鼠，收集肝臟標本。

3.2 肝臟指數的計算 肝臟指數（%）=肝重（g）/大鼠體重（g）×100%

3.3 血清指標的檢測 采用全自動生化分析儀檢測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、ALT 和 AST 水平；糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）試劑盒檢測糖化血紅蛋白水平，操作嚴格按照說明書進行。

3.4 ELISA法檢測血清IL-6和TNF-α的水平 分離血清，分別采用試劑盒檢測IL-6 及TNF-α 的水平，嚴格按照試劑盒說明進行實驗操作，測定450 nm 處吸光度（A）值。

3.5 HE 染色觀察肝臟的病理變化 取10%福爾馬林固定的肝臟組織，石蠟包埋后，4 μm連續切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟損傷情況，并由2 名病理科醫生同時閱片根據肝臟病理半定量評分標準進行評分［12］。正常肝臟組織為 0 分，肝細胞水腫為 1 分，肝細胞空泡樣變為2 分，肝組織點狀壞死并門靜脈內炎癥細胞浸潤為3分，肝組織片狀壞死為4分。

3.6 油紅O 染色觀察肝臟的變化 取冰凍肝臟組織，于冰凍切片機中，10 μm 連續切片，4%中性甲醛固定10 min后，蒸餾水沖洗，60%異丙醇分化30 s，油紅O 染色，60%異丙醇分化后，蘇木精復染，光鏡下觀察肝臟的變化。

3.7 RT-qPCR 檢測肝臟組織中 IκB 的 mRNA 表達取部分肝臟組織研磨后，Trizol 法提取總RNA，合成cDNA，進行PCR 擴增，嚴格按說明書操作，以GAPDH為內參照，引物序列見表1。

3.8 Western blot 檢測肝臟組織中PPARγ 的蛋白表達及NF-κB p65 蛋白核轉位 取部分肝臟組織研磨后，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction 試劑盒分別提取胞漿和胞核蛋白，所有蛋白電泳、轉膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h 后分別加Ⅰ抗（1∶500），4 ℃過夜，TBST 漂洗3次，加入Ⅱ抗孵育1 h，化學發光反應，圖像分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

4 統計學處理

采用統計學軟件SPSS 18.0進行分析，計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間采用單因素方差分析，組間采用 SNK-q進行比較，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 梓醇對T2DM 大鼠肝臟指數、FBG、HbA1c、TC、TG、ALT和AST的影響

與 CON 組比較，MOD 組的肝臟指數、FBG、HbA1c、TC、TG、ALT 和 AST 等指標均明顯升高（P＜0.05）；與MOD 組比較，CAT-L 組上述指標的差異無統計學顯著顯著性（P＞0.05），MET組、SIL組、CAT-M組和CAT-H 組的各指標均顯著降低（P＜0.05）；其中CAT-H 組的肝臟指數、TC、TG、ALT 和 AST 較 MET 組和SIL 組降低更加明顯（P＜0.05），提示梓醇能夠降低T2DM 大鼠血糖和血脂，減輕肝臟損傷，高劑量組效果優于二甲雙胍和水飛薊素，見表2、3。

表2 梓醇對各組大鼠肝臟指數、FBG和HbA1c的影響Table 2. Effects of catalpol on liver weight index，FBG and HbA1c in rats of different groups（Mean±SD. n=10）

表3 梓醇對各組大鼠TC、TG、ALT和AST的影響Table 3. Effects of catalpol on TC，TG，ALT and AST in rats of different groups（Mean±SD. n=10）

2 梓醇對T2DM大鼠IL-6和TNF-α的水平的影響

與 CON 組比較，MOD 組的 IL-6 和 TNF-α 的水平均明顯升高（P＜0.05）；與MOD 組比較，CAT-L 組上述指標的差異無統計學顯著性（P＞0.05），MET 組、SIL組、CAT-M組和CAT-H組的IL-6和TNF-α的水平均明顯降低（P＜0.05）；其中 CAT-H 組較 MET 組和SIL組各指標變化更加明顯（P＜0.05），提示梓醇能夠降低T2DM 大鼠炎癥因子水平，改善肝臟功能，見圖1、2。

3 梓醇對T2DM大鼠肝臟形態的影響

Figure 1. Effects of catalpol（CAT）on the serum levels of IL-6 in the rats of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖1 梓醇對各組大鼠血清IL-6水平的影響

Figure 2. Effects of catalpol（CAT）on the serum levels of TNF-α in the rats of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖2 梓醇對各組大鼠血清TNF-α水平的影響

HE 染色結果顯示，CON 組的肝細胞排列規則，組織結構清晰；MOD組的肝細胞排列松散，見大量脂肪空泡，肝小葉肝索結構紊亂，炎癥細胞浸潤，偶見點狀壞死；與MOD 組比較，CAT-L 組無明顯改善，MET 組、SIL 組、CAT-M 組和 CAT-H 組的肝細胞排列規則，脂肪空泡、炎癥細胞均明顯減少，形態得到明顯改善。肝臟病理半定量評分統計結果顯示，與MOD 組比較，MET 組、SIL 組、CAT-M 組和 CAT-H 組病理學評分顯著降低（P＜0.05），其中CAT-H 組的病理學評分低于MET組和SIL組（P＜0.05），見圖3、4。

油紅O 染色結果顯示，CON 組的肝細胞形態正常，僅有很少量脂肪細胞被染成紅色，無脂肪變性；MOD 組的肝細胞排列不規則，組織大面積被染成紅色，明顯脂肪變性，有大量脂質沉積；與MOD 組比較，CAT-L 組未見顯著改變，MET 組、SIL 組、CAT-M組和CAT-H 組的肝細胞排列比較規則，脂肪變性程度明顯減輕，提示梓醇能夠改善T2DM 大鼠肝臟的脂肪變性，見圖5。

4 梓醇對T2DM 大鼠肝臟組織中IκB mRNA 表達的影響

與 CON 組比較，MOD 組 IκB 的 mRNA 表達明顯減少（P＜0.05）；與MOD 組比較，CAT-L 組未見明顯增多（P＞0.05），MET 組、SIL 組、CAH-T-M 組和CATH 組 IκB 的 mRNA 表達均明顯增多（P＜0.05）；其中CAT-H 組較 MET 組和 SIL 組 IκB 的 mRNA 表達增多更加顯著（P＜0.05），提示梓醇促進 IκB 的 mRNA 表達且效果優于二甲雙胍和水飛薊素，見圖6。

5 梓醇對T2DM 大鼠肝臟組織中PPARγ蛋白表達的影響

Figure 3. Effects of catalpol（CAT）on the morphological changes of rat liver tissues in different groups（HE staining，×400）.圖3 HE染色觀察梓醇對各組大鼠肝臟形態的影響

Figure 4. Effects of catalpol（CAT）on liver histopathological scores in different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖4 梓醇對各組大鼠肝臟組織病理評分的影響

與CON組比較，MOD組的PPARγ蛋白明顯減少（P＜0.05）；與 MOD 組比較，CAT-L 組未見顯著增多（P＞0.05），MET 組、SIL 組、CAT-M 組和 CAT-H 組的PPARγ 蛋白表達均明顯增多（P＜0.05）；CAT-H 組較MET 組和SIL 組增多更加明顯（P＜0.05），提示梓醇能夠促進PPARγ 蛋白表達且效果優于二甲雙胍和水飛薊素，見圖7。

6 梓醇對T2DM 大鼠肝臟細胞核內NF-κB 表達的影響

與 CON 組比較，MOD 組核內 NF-κB p65 蛋白的表達明顯增多（P＜0.05）；與MOD 組比較，CAT-L 組未見顯著減少（P＞0.05），MET 組、SIL 組、CAT-M 組和CAT-H 組核內NF-κB p65 蛋白的表達均顯著減少；CAT-H 組較 MET 組和 SIL 組減少更加明顯（P＜0.05），提示梓醇能夠抑制NF-κB 活化且效果優于二甲雙胍和水飛薊素，見圖8。

討 論

Figure 5. Effects of catalpol（CAT）on rat liver morphological changes in different groups observed by oil red O staining（×400）.圖5 油紅O染色觀察梓醇對各組大鼠肝臟形態的影響

Figure 6. Effects of catalpol（CAT）on the mRNA expression of IκB in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖6 梓醇對各組大鼠肝臟組織中IκB mRNA表達的影響

T2DM 可引起多臟器并發癥的發生，肝損傷就是其常見并發癥之一，非酒精性脂肪肝是T2DM 肝損傷的早期表現，長期NAFLD 又可引發嚴重的葡萄糖與脂質代謝紊亂，加重糖尿病及其他并發癥的發生。因此，尋找治療糖尿病并預防肝損傷的藥物尤為重要。中草藥本身及其提取物因其具有多靶點、不良反應小等特點已被廣泛用于治療各種疾病，包括糖尿病及其肝損傷的治療，并顯示了較好的療效［13］。本課題組在前期研究中發現，梓醇能夠防治T2DM大鼠大血管病變［10-11］，而梓醇是否能夠防治糖尿病引起的肝損傷未見報道。本研究采用高脂飲食聯合小劑量STZ 注射制備2 型糖尿病大鼠模型，8 周后模型組大鼠肝臟出現明顯的脂肪變性，肝功能明顯受損，而梓醇干預的大鼠肝臟脂肪變性損傷明顯減輕，肝功能也得到明顯改善，說明梓醇能夠減輕T2DM 引起的肝臟損傷。

NF-κB 通路是對氧化應激最敏感的胞內信號傳導途徑之一，從轉錄水平上調控炎癥因子的表達，是調控轉錄多種炎性因子的共同通路。IκB（inhibitor of NF-κB）是NF-κB的抑制蛋白。在靜息狀態下，IκB與NF-κB 結合以失活狀態存在于細胞質中，當受到氧化應激等因素刺激時，IκB 磷酸化并降解，使得NF-κB 活化，并從細胞質轉移到細胞核內，與相應的炎癥相關基因結合，啟動炎癥因子轉錄表達。近年來的研究證實，活化的PPARγ 可以通過抑制NF-κB等轉錄因子的活性來負向發揮間接轉錄調控的效應，明顯抑制炎癥反應，PPARγ/NF-κB信號途徑為調控炎癥的一個重要靶點［14-15］。Jiménez-Flores 等［16］發現姜黃素能減輕DM 所致肝損傷，并且肝組織PPARγ蛋白表達顯著増加，而NF-κB表達降低，其機制可能與 PPARγ/NF-κB 信號通路有關。Motteleb等［17］發現通過激活PPARγ介導NF-κB信號通路從而抑制炎癥和氧化反應。Belfort 等［18］發現PPARγ 能通過抑制NF-κB 信號通路的活化來抑制炎癥因子IL-6和TNF-α 的分泌。課題組前期研究發現梓醇能夠抑制NF-κB活化，有效減輕ox-LDL誘導EA.hy926細胞炎癥因子TNF-α 的表達［9］。本研究發現糖尿病模型組肝臟的PPARγ 表達明顯降低，細胞核內NF-κB p65的蛋白含量明顯增多，同時也發現血清中IL-6和TNF-α的水平顯著升高，說明糖尿病大鼠肝臟NF-κB信號通路活化，炎癥反應明顯；經梓醇干預后，PPARγ 蛋白表達顯著增加，細胞核內 NF-κB 蛋白含量明顯減少，血清中IL-6 和TNF-α 的水平顯著下降，表明梓醇可能通過PPARγ/NF-κB 信號通路抑制了炎癥反應，減輕了T2DM大鼠肝臟損傷。

Figure 7. Effects of catalpol（CAT）on the protein expression of PPARγ in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖7 梓醇對各組大鼠肝臟PPARγ蛋白表達的影響

Figure 8. Effects of catalpol（CAT）on nuclear protein expression of NF-κB in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖8 梓醇對各組大鼠肝臟細胞核內NF-κB表達的影響