游離脂肪酸聯合LDL-C誘導脂肪性肝炎細胞模型的建立*

辛 妍， 林曉轉， 朱 璇， 陳思婉， 郭紅輝

（廣東醫科大學公共衛生學院，廣東東莞523808）

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的炎癥亞型，伴有脂肪變性（steatosis）及肝細胞炎癥損傷和功能障礙［1］。研究顯示，單純的非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）很少導致肝硬化或肝癌，但是多達20%的NASH 患者可能進展為肝硬化，并伴有心血管疾病、肝衰竭和肝細胞癌等相關并發癥［2-3］。當前，為研究NASH的發病機制多采用動物模型，但其存在復制時間長、個體差異大、穩定性差且實驗條件難以控制等缺點。在研究某些物質對NASH 作用機制時，首先需要進行初步探索，這種情況下，一個低成本、易操作且更穩定的細胞模型就顯得尤為重要。就細胞模型而言，較為常見的是用油酸（oleic acid，OA）、棕櫚酸或其混合物誘導肝細胞脂肪變性，但難以出現穩定的低度炎癥狀態［4］。因此，建立一個既存在脂肪變性，又有穩定炎癥狀態的細胞模型十分必要。

脂肪變性，即脂肪在肝細胞中的大量積聚，是NAFL 和 NASH 的典型病理特征［5］，其中甘油三酯（triglyceride，TG）是主要的脂類成分［6］，然而引起脂毒性的具體物質仍不清楚。眾所周知，膽固醇是一種重要的脂毒性分子，在不同的動物模型中均會促進 NASH 的發生發展［7］。在一項關于 NAFLD 的脂質組學分析中，有一個引人注目且新穎的觀察結果是，從NAFL 發展到NASH，肝臟游離膽固醇含量逐漸增加［6］。肝細胞以低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）形式吸收的游離膽固醇通過內溶體-溶酶體腔室直接運輸到脂滴膜上，如果超過了被膜中的磷脂可以“溶解”的濃度，膽固醇就會在脂滴膜上結晶［8］。有研究證實，膽固醇結晶可以直接激活肝星狀細胞，還能直接激活庫普弗細胞和肝細胞中的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，促使caspase-1 活化，并切割白細胞介素1β（intertleukin-1β，IL-1β）和IL-18，從而加速NAFLD 由單純性脂肪變性進展為NASH［7，9］。

因此，本研究以人正常肝細胞L-02為對象，在常見的脂肪變性細胞模型的基礎上，通過施加一定濃度的LDL-C 誘導肝細胞產生炎癥反應，旨在建立一種更接近于臨床NASH 病理特征的脂肪性肝炎細胞模型，并評價該模型與傳統游離脂肪酸誘導的脂肪變性模型在炎癥反應上的差別，為探索NASH 發病機制及NASH 藥物的體外研究提供更簡便可靠的途徑。

材料和方法

1 細胞

人正常肝細胞系L-02購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，經江蘇凱基生物技術股份有限公司鑒定，符合EXPASY 數據庫L-02 細胞株DNA分型，未發現多等位基因。細胞復蘇后，在37 ℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養液傳代培養。將處于對數生長期的L-02 細胞經0.25%胰酶-EDTA 消化后，按每孔4×105個細胞的密度接種于6孔板，分為對照（control，CON）組、脂肪變性（OA）組和模型（OA+LDL-C）組。待細胞融合至70%左右時開始進行處理：對照組只加培養液；脂肪變性組額外施加200 μmol/L 油酸鈉；模型組則施加200 μmol/L油酸鈉及50 mg/L LDL-C。

2 主要試劑

胎牛血清（10270106，GIBCO）、胰酶（25200-072，GIBCO）和 DEME 高糖培養液（C11995500BT，GIBCO）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；油酸鈉（S104196，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無脂肪酸牛血清白蛋白（36104ES25，上海翊圣生物科技有限公司）；人源LDL-C（YB-001，廣州弈源生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012，碧云天生物技術有限公司）；TG測定試劑盒（A110-2-1）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒（A111-2-1）和丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（C009-3-1）購自南京建成生物工程研究所；CCK-8 細胞活力-毒性檢測試劑盒（ck04，同仁化學研究所）；油紅O干粉（O0625，Sigma）；細胞總游離膽固醇菲律賓菌素（filipin）熒光染色試劑盒（GMS80059.1，上海杰美基因醫藥科技有限公司）；RT-qPCR 試劑盒（RR820A，TaKaRa）；GAPDH 抗體（AG019-1，碧云天生物技術有限公司）；caspase-1 抗體（sc-398715，Santa Cruz）；NLRP3 抗體（D4D8T）和IL-1β 抗體（3A6）均購自Cell Signaling Technology；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3 主要方法

3.1 不同濃度的LDL-C 對細胞活力及胞內TG 含量的影響 將對數生長期的L-02 細胞以每孔8 000 個的密度接種于96 孔板中，待細胞貼壁后分別向每孔加入終濃度為200 μmol/L 的OA 及不同濃度的LDLC 培養 24 h，之后再加入 10 μL 的 CCK-8 溶液，將培養板避光在37 ℃，5%CO2的培養箱內孵育2 h 后，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度（A）值表示細胞活力。將L-02 細胞按每孔4×105個細胞接種于6 孔板，待細胞融合至70%左右時開始進行處理：對照組只加培養基；脂肪變性組額外施加200 μmol/L 油酸鈉；模型組則施加 200 μmol/L 油酸鈉及 12.5、25、50 和100 mg/L LDL-C，在37 ℃、5% CO2的培養箱內孵育24 h，檢測TG含量。

3.2 LDL-C 干預時間效應關系 細胞分組干預后，分別孵育0、12、24、36 和48 h。用0.25%胰酶-EDTA消化細胞，將細胞懸液4 000×g離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀采用RIPA 裂解液裂解細胞，按TG 和TC 試劑盒說明書操作分別檢測TG 和TC 含量，用BCA 蛋白濃度試劑盒檢測蛋白含量，結果以μmol/（g protein）表示。

3.3 細胞ALT 釋放量測定 收集細胞培養液，然后按試劑盒說明書中的步驟操作，并測定每個樣本的吸光度，以ALT活性表示細胞損傷程度。

3.4 油紅O 染色細胞內脂滴 細胞孵育36 h 后，棄培養液，PBS 漂洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，后用60%異丙醇潤洗，油紅O 工作液避光染色10～15 min，60%異丙醇分化至間隙清晰（5～15 s 即可）。以蒸餾水洗滌后，蘇木素復染細胞核1 min，再次以蒸餾水充分洗滌后，滴1 滴甘油明膠封片液在細胞上，在顯微鏡下觀察并采集圖像。

3.5 菲律賓菌素染色細胞內游離膽固醇 細胞孵育36 h 后，棄培養液，加入PBS 溶液輕輕搖晃清洗，重復3 次；每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，固定30 min，結束后再次用PBS 溶液清洗3 遍，再加入1.5 g/L 甘氨酸室溫孵育10 min 后棄去甘氨酸并用PBS 洗去殘留；加入菲律賓菌素染液后將6 孔板包裹錫箔紙，置于黑暗環境中染色，2 h 后棄去染液，加入少量抗熒光淬滅封片液，在熒光顯微鏡下觀察，激發波長為360 nm，發射波長為465 nm。

3.6 RT-qPCR 檢測NLRP3 炎癥小體相關因子的mRNA 表達 提取細胞內總RNA，逆轉錄為cDNA，最后進行目的基因的擴增。GAPDH 作為內參照，各基因水平的比較采用2-ΔΔCt法計算。GAPDH 的上游引 物 序 列 為 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；NLRP3 的上游引物序列為 5′-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3′，下游引物序列為 5′-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3′；caspase-1 上游引物序列為5′-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3′，下游引物序列為 5′-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3′；IL-1β 的上游引物序列為 5′-TTCGACACATGGGATAACGAGG-3′，下游引物序列為5′-TTTTTGCTGTGAGTCCCGGAG-3′；IL-18 上 游 引 物 序 列 為 5′-TCTTCATTGACCAAGGAAATCGG-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-TCCGGGGTGCATTATCTCTAC-3′。

3.7 Western blot 檢測NLRP3 炎癥小體相關因子的蛋白表達 按照前述方法將細胞分組干預，36 h 后用裂解液提取細胞內總蛋白，根據BCA 蛋白濃度測量結果調整各組樣品濃度，于6%～10%SDS-PAGE分離蛋白；依次經轉膜、脫脂牛奶封閉、加入一定稀釋比例Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入對應Ⅱ抗溶液，室溫孵育1 h。采用化學發光法顯影，Image Lab軟件分析條帶灰度值。

4 統計學處理

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey的多重比較檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度的LDL-C 對L-02 細胞活力和TG 含量的影響

CCK-8 實驗表明，在 0～100 mg/L 濃度范圍內孵育LDL-C 的L-02 細胞活力無顯著差異（圖1A），說明LDL-C 對細胞活力無顯著影響。與對照組相比，隨著LDL-C 濃度的升高，細胞內TG 含量不斷上升，具有濃度依賴效應，而50 mg/L 和100 mg/L 組間無顯著差異（圖1B）。所以，后續實驗均采用50 mg/L LDL-C進行細胞干預。

2 LDL-C 影響 L-02 細胞內 TG 和 TC 積 聚 及 ALT釋放的時間效應

與對照組相比，脂肪變性組和模型組細胞內的TG 含量隨著LDL-C 處理時間的延長而增加，并且模型組胞內TG含量始終高于脂肪變性組（P＜0.01）；在24、36 及48 h，模型組的TG 含量與其他兩組比均有顯著差異（P＜0.01），見圖2A。與脂肪變性組相比，模型組細胞內TC 含量隨作用時間延長呈上升趨勢，在36 h 后趨于穩定，且模型組胞內TC 含量均高于脂肪變性組（P＜0.05），見圖2B。肝細胞發生炎癥損傷后，會釋放ALT 到胞外。同樣，隨著作用時間的延長，模型組釋放到培養液中的ALT 活性一直呈上升趨勢，至36 h 達到最大值，在36 和48 h，模型組的ALT 活性與其他兩組相比均有顯著差異（P＜0.01），見圖2C。

3 LDL-C加劇L-02細胞脂質沉積

Figure 1. Effects of different concentrations of low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）on the viability and intracellular triglyceride（TG）content in L-02 cells. A：the cell viability was evaluated by CCK-8 assay；B：the TG content in L-02 cells.OA：oleic acid. Mean±SD. n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（without treatment）group.圖1 不同濃度的LDL-C對L-02細胞活力及胞內TG含量的影響

Figure 2. Time-dependent effects of low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）on cellular content of triglyceride（TG）and total cholesterol（TC），and the released alanine aminotransferase（ALT）in L-02 cells. A：TG content；B：TC content；C：activity of ALT released from the cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs oleic acid（OA）group.圖2 LDL-C影響細胞TG和TC積聚及ALT釋放的時間效應

如圖3所示，紅色部分為油紅O染色的細胞內脂滴，紫色部分為蘇木素染色的細胞核。干預36 h 后不同干預組之間細胞內脂質沉積有明顯區別：對照組的L-02細胞核大而圓，核仁明顯，僅部分細胞存在少量小粒紅色脂滴；脂肪變性組細胞內紅色脂滴數量稍有增多，少量細胞出現較大顆的脂滴；而模型組明顯可見大量聚集脂滴，脂滴顏色更深且顆粒更大。

Figure 3. The representative images of TG accumulation（oil red O staining，scale bar=50 μm）. A：control group；B：oleic acid（OA）group；C：OA+low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）group. Compared with the other two groups，there were significantly more lipid droplets stained red in the cells of the model group.圖3 油紅O染色觀察LDL-C對L-02細胞TG積聚的影響

4 LDL-C促使L-02細胞內游離膽固醇增多

游離膽固醇主要分布在細胞膜周圍，用菲律賓菌素染色可見細胞周邊存在淡藍色熒光，游離膽固醇蓄積則表現為熒光面積較大、信號較強的區域。對照組細胞內熒光強度十分微弱，僅有極少量游離膽固醇蓄積；脂肪變性組細胞內熒光強度稍強于對照組，但總體仍顯示細胞內游離膽固醇數量不多；模型組細胞內熒光面積及強度明顯高于前兩組，出現較多游離膽固醇蓄積（圖4）。

Figure 4. The representative images of cholesterol accumulation（filipin fluorescent staining，scale bar =50 μm）. A：control group；B：oleic acid（OA）group；C：OA+low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）group. The image of OA+LDL-C group has a large blue fluorescence area，showing a large amount of free cholesterol accumulation，while the images of the other two groups have only a small amount of blue fluorescence.圖4 菲律賓菌素染色觀察LDL-C對L-02細胞膽固醇積聚的影響

5 LDL-C 上調L-02 細胞內NLRP3 炎癥小體相關因子的mRNA表達

如圖 5 所示，模型組細胞內 NLRP3 的 mRNA 表達水平沒有顯著升高，但其下游分子caspase-1、IL-1β 和IL-18 的mRNA 表達量均顯著高于對照組和脂肪變性組（P＜0.01）。

Figure 5. The mRNA expression of NLRP3（A），caspase-1（B），IL-1β（C）and IL-18（D）in L-02 cells treated with low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；##P＜0.01 vs oleic acid（OA）group.圖5 LDL-C對L-02細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表達的影響

6 LDL-C 上調L-02 細胞內NLRP3 炎癥小體相關因子的蛋白表達

如圖6 所示，模型組細胞內NLRP3 蛋白表達水平較其他兩組有所上升但無顯著差異；相較于對照組和脂肪變性組，模型組前體caspase-1（pro-caspase-1）及成熟caspase-1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；模型組前體IL-1β（pro-IL-1β）蛋白表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），而成熟IL-1β蛋白表達水平較對照組和脂肪變性組均顯著升高（P＜0.05）。

Figure 6. The protein levels of NLRP3，pro-caspase-1，caspase-1，pro-IL-1β and IL-1β in L-02 cells low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs oleic acid（OA）group.圖6 LDL-C對L-02細胞中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達水平的影響

討 論

目前，NASH研究常用的動物模型為高脂或蛋氨酸膽堿缺乏飼料喂養大鼠或小鼠，但這類模型費事費力，且存在個體差異大、可復制性差等缺點。體外細胞模型耗時短、成本低，可以在某些方面補充動物模型的不足，并且不存在倫理風險。根據現有的文獻報道，單純性脂肪變性細胞模型較為多見，而NASH細胞模型比較少見，且現有細胞模型多為肝癌細胞，干預手段大都是使用游離脂肪酸孵育［10］，但如果使用高濃度的游離脂肪酸也會對肝細胞產生一定的脂毒性［11］。此外，肝癌細胞代謝狀態與正常肝細胞經歷的臨床NAFLD 病理過程存在較大差異，所以使用人正常肝細胞進行模型更具有臨床意義。

為了防止施加的LDL-C 產生細胞毒性，我們檢測了細胞活力，結果顯示該濃度LDL-C 對細胞活力無顯著影響；為了探求最佳造模濃度，本研究選擇了0～100 mg/L 這一范圍內 5 個濃度的 LDL-C 對細胞進行干預，考慮到胞內TG 含量在50 和100 mg/L 的LDL-C 作用下沒有顯著差異，故選擇50 mg/L 作為最佳造模濃度；為了探求最佳造模時間，本研究在0～48 h 選擇了5 個不同時間點，分別檢測了胞內TC 和TG 含量及細胞向培養液釋放的ALT 活性，結果顯示油酸鈉和LDL-C 對促進細胞內TG 的積聚有一定協同作用，并且LDL-C 能增加細胞內TC 的積聚，ALT活性也在36 h 達到最大值。雖然隨著時間的增加，36 h 后部分指標仍然呈現上升趨勢，但是觀察到48 h 的細胞密度過大，生長狀態受到影響，故選用36 h作為最佳造模時間。

與前期發表的文獻［10-11］結果相似，游離脂肪酸可以使L-02 肝細胞出現明顯的脂質沉積，而添加LDLC 后，模型組細胞內會出現明顯游離膽固醇蓄積，大量的游離膽固醇蓄積后，容易出現膽固醇晶體，從而導致細胞炎癥反應的發生。這一推測在RT-qPCR實驗及Western blot實驗中得到證實。LDL-C可顯著上調 NLRP3 炎癥小體相關 caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的mRNA 及蛋白表達，提示LDL-C 誘導脂肪變性肝細胞出現了明顯的炎癥反應。有研究顯示，氧化型低密度脂蛋白可以刺激單核巨噬細胞轉變為泡沫細胞，并產生大量炎癥因子，啟動一系列炎癥反應［12］。在肝臟細胞中，游離膽固醇過飽和會形成膽固醇結晶，激活NLRP3炎癥小體，招募和激活促炎癥蛋白酶caspase-1，從而切割 IL-1β 和 IL-18 的前體產生相應的成熟炎癥因子，促進NASH形成［13］。

目前肝活檢是唯一診斷NASH 和評估預后的“金標準”［14］，即組織學檢查顯示肝臟脂肪變性超過5%，同時出現肝細胞氣泡性變性和肝小葉炎癥［3］。然而，由于它是有創檢查，并且費用昂貴、抽樣誤差很大，還有可能出現并發癥，大部分患者對其接受度較低，因此在NASH 臨床初步診斷的過程中，還是需要借助一些血液生化指標，這些指標主要從肝臟脂肪變性、炎癥水平等方面的生物標志物反映NASH的進程。例如，ALT 水平升高是進展性NAFLD 或NASH的常見標志物［3］。

本研究選用人正常肝細胞株L-02 作為造模對象，以OA 聯合LDL-C 共同孵育36 h，檢測了肝細胞內TC 和TG 含量、胞內脂滴和游離膽固醇含量來反映脂肪變性程度，同時檢測了肝細胞釋放的ALT 活性及細胞內NLRP3炎癥小體相關因子的mRNA和蛋白表達水平來反映炎癥水平，結果細胞同時出現脂肪變性和炎癥反應，提示成功建立一種NASH 細胞模型。此方法便捷可行，能較好模擬NASH 病理特征，為脂肪性肝炎相關的體外研究提供了一種穩定有效的細胞模型。