CaMKII/NFAT通路激活可促進AKI小鼠腎小管上皮細胞凋亡*

黃宗順， 肖 潔， 彭用華， 俞小敏， 陳亞琦

（廣州醫科大學附屬第一醫院腎內科，廣東廣州510120）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是腎功能在短期內下降而出現的氮質廢物滯留和尿量減少的綜合征。AKI 具有全球發病率高、預后不良和醫療費用高等嚴峻問題［1-6］。目前，AKI 的發病機制尚未明確。腎小管上皮細胞（renal tubular epithelial cells，RTEC）凋亡是AKI 發生發展的重要病理改變之一，明確RTEC 凋亡的分子機制對AKI的防治具有重要意義。鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）是廣泛表達于各種組織的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與細胞凋亡密切相關［7-9］。CaMKII 在氧化應激損傷和細胞凋亡中發揮重要作用，敲除CaMKII基因或抑制其功能可緩解內質網應激誘發的心肌細胞凋亡［10］。也有研究認為，CaMKII 過表達可促進碘海醇誘導的線粒體損傷和 RTEC 凋亡［7］。目前，CaMKII 是否參與AKI 的發病及其在RTEC 凋亡中的機制仍未明確。因此，本研究采用阿霉素（adriamycin，ADR）干預人近端腎小管上皮細胞HK-2 和BALB/c 小鼠，分別建立 RTEC 凋亡細胞模型和 AKI 動物模型［11-12］；采用Western blot、流式細胞術和細胞轉染等技術，初步探討CaMKII 和活化T 細胞核轉錄因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）在 AKI 的 RTEC 凋亡中的作用和調控機制。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 細胞培養與分組 腎小管上皮細胞HK-2（購自ATCC）用含10%胎牛血清（Gibco BRL）的RPMI-1640 培養液（Gibco BRL）在37 ℃培養箱中培養。培養成熟的RTEC 予ADR（0.062 5 mg/L；購自Sigma）、KN-93 磷酸鹽（簡寫為K；CaMKII 的特異性抑制劑；2 μmol/L；購自Selleck Chemicals）、鈣調蛋白（calmodulin，CaM；CaMKII 活化劑；5 μmol/L）或siRNA（50 nmol/L）干預24 h。培養成熟的RTEC 按實驗內容隨機分組。第1～3 部分實驗分為3 組：正常對照（control，Con）組、ADR 組和 ADR+K 組。第 4 部分實驗分為 6 組：Con 組、siRNA 空白對照（siRNA blank control，siCon）組、ADR 組、ADR+NFAT-siRNA（siNFAT）組和CaM 組和CaM+siNFAT 組。siNFAT（序列為 5′-GCCATAACTTTCTGCAAGA-3′）和siCon 購自廣州銳博公司。siRNA 的細胞轉染方法詳見我們的前期研究［12-15］和產品說明書。

1.2 實驗動物分組與干預 18 只 SPF 級 6～8 周齡18～21 g 的雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。按每組 6 只小鼠隨機分為 3 組：Con 組、ADR組和ADR+K 組。動物實驗倫理通過廣州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的審查。12只小鼠在實驗前 1 d 尾靜脈注射 ADR（12 mg/kg），6 只 Con 組小鼠尾靜脈注射相同體積的生理鹽水。其中6 只注射ADR 的小鼠在實驗第 1、3、5 天予腹腔注射 K（0.08 mg/kg）。因造模時小鼠意外死亡2只，最后入組情況為每組5 只。小鼠在第7 天予氯胺酮（70 mg/kg 腹腔注射）麻醉后處死，取動脈血提取血清行酶聯免疫吸附實驗，腎臟組織用于提取蛋白行免疫印跡實驗。

2 方法

2.1 Western blot 具體步驟詳見我們的以往研究［12-15］。簡述如下：按照核漿蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）說明提取總蛋白、核蛋白與胞漿蛋白。BCA 法測量各樣品的蛋白濃度。蛋白變性后以每個電泳道上樣30 μg 進行SDS-PAGE。轉膜后剪下目的條帶，用5%脫脂奶粉室溫條件下封閉1 h 后，加相應Ⅰ抗4 ℃搖床孵育過夜。次日洗去Ⅰ抗后加Ⅱ抗室溫搖床孵育1 h，用TBST 洗條帶3次，每次5 min。ECL 發光液顯影、拍照。實驗所用Ⅰ抗體如下：兔抗p-CaMKII（Cell Signaling Technology，1∶1 000），兔抗t-CaMKII（Santa Cruz，1∶500），兔抗NFAT（Cell Signaling Technology，1∶1 000），兔抗Bcl-2（Cell Signaling Technology，1∶1 000），兔抗Bax（Cell Signaling Technology，1∶1 000），兔抗 GAPDH（Bioworld Technology，1∶10 000），兔抗 histone（Cell Signaling Technology，1∶3 000）。蛋白表達定量以目標蛋白/GAPDH或目標蛋白/histone（核蛋白）表示。

2.2 流式細胞術 具體實驗步驟見我們以往研究［12-15］，各組 RTEC 的細胞凋亡率嚴格按照 Annexin V/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）的說明執行。簡述如下：以磷酸緩沖鹽溶液洗凈各組HK-2 細胞，0.05%胰酶消化細胞使其從培養皿脫落，用含5%胎牛血清的培養液終止消化。冷磷酸緩沖鹽溶液洗凈HK-2 細胞后離心管收集約5×105細胞。用結合緩沖液（Binding Buffer）重懸HK-2 后轉移至流式管。先后加Annexin V-FITC（染凋亡細胞）和PI 混勻。室溫避光條件下孵育10 min。最后在1 h 內用流式細胞儀檢測各標本的細胞凋亡率。

2.3 酶聯免疫吸附實驗 各組小鼠的血清肌酐檢測嚴格按照小鼠肌酐檢測試劑盒（Cayman Chemical）的說明執行。簡述如下：準備各梯度濃度的標準品。酶標板上設空白孔、標準孔和待測樣品孔，加入各標準品或樣品15 μL。每孔再加150 μL 堿性苦味酸溶液。室溫搖床孵育10 min。用酶標儀492 nm 波長下測各孔吸光度（A1）。每孔加入5 μL 酸性溶液。室溫搖床孵育20 min。再次用酶標儀測各孔的A值（A2）。計算公式：A3=A2-A1，校正A=各孔A3-空白孔A3。以標準品的校正A作圖，濃度值為 X 軸，校正A為 Y 軸，繪制標準曲線。用各樣品的校正A在標準曲線上查出相對應的肌酐濃度。

3 統計學處理

所有數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示。用統計軟件SPSS 21.0 進行統計分析。所有實驗重復至少 3 次。兩組間比較用Student′st檢驗，多組間比較用單因素方差分析及Bonferroni 或Tamhane′s T2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CaMKII活性在ADR干預的RTEC中升高

Western blot 結果顯示，對比正常培養的RTEC，ADR 干預的 RTEC 中 CaMKII 蛋白磷酸化程度，即CaMKII 活 性（p-CaMKII/t-CaMKII）顯 著 增 加（P＜0.01），見圖1A；同時，在ADR 干預的小鼠腎組織中CaMKII活性也顯著增加（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1. CaMKII activity was increased in ADR-injured RTEC. A：Western blot showed that the CaMKII activity（the ratio of p-CaMKII/t-CaMKII）was increased in ADR-injured HK-2 cells；B：the CaMKII activity was increased in kidney tissues of ADR-treated mice. Mean±SEM. n=5.**P＜0.01 vs control（Con）group.圖1 CaMKII活性在ADR干預的RTEC中增高

2 抑制CaMKII 活化可減少ADR 誘導的RTEC 凋亡，抑制血清肌酐升高

流式細胞術分析顯示，對比Con 組，ADR 組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），用K 抑制CaMKII 活化后細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖2A。與此一致地，如圖 2B、C 所示，對比 Con 組，ADR 干預的 HK-2細胞和小鼠腎組織中促凋亡蛋白Bax 的表達顯著增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著減少（P＜0.05），抑制CaMKII 活化后此作用顯著減弱（P＜0.05）。此外，如圖2D 所示，對比正常小鼠，ADR 干預小鼠血清肌酐顯著升高（P＜0.05），予K 后血清肌酐顯著下降（P＜0.05）。

3 抑制CaMKII 活化可減少ADR 誘導的核NFAT蛋白增加

Western blot 結果顯示，對比正常 RTEC，ADR 損傷的HK-2 細胞中，核蛋白NFAT 顯著增加（P＜0.01），用K 抑制CaMKII 活化后此作用顯著減弱（P＜0.05），見圖3A；同時，對比正常小鼠，ADR 干預小鼠腎組織中核蛋白NFAT 顯著增加（P＜0.01），予K 后此作用顯著減弱（P＜0.05），見圖3B。

Figure 2. Inhibition of CaMKII activity attenuated ADR-induced RTEC apoptosis. A：cultured HK-2 cells were stained with Annexin V/PI for flow cytometry analysis；B：Western blot showed that Bax protein expression was increased，and Bcl-2 was decreased in ADR-injured HK-2 cells，but inhibition of CaMKII activity by KN-93（K）attenuated these changes；C：Bax protein expression was increased and Bcl-2 was decreased in kidney tissues of ADR-treated mice，but inhibition of CaMKII activity by K attenuated these changes；D：serum creatinine was increased in ADR-treated mice，but it was back to nearly normal after inhibiting CaMKII activity by K in ADR-treated mice. Mean±SEM. n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs ADR group.圖2 抑制CaMKII活化可減輕ADR誘導的RTEC凋亡

4 CaMKII可通過NFAT促進RTEC凋亡

流式細胞術結果顯示，對比Con 組或siCon 組，ADR 或 CaM 干預 的 RTEC 凋亡率顯 著 升高（P＜0.05）；但在 ADR 或 CaM 干預 RTEC 的同時，加上siNFAT 處理后細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 3. Inhibition of CaMKII activity attenuated ADR-induced increase in nuclear NFAT expression. A：Western blot showed that nuclear protein expression of NFAT was significantly increased in ADR-injured HK-2 cells，but inhibition of CaMKII activity by KN-93（K）attenuated this change；B：nuclear protein expression of NFAT was significantly increased in kidney tissues of ADR-treated mice，but inhibition of CaMKII activity by KN-93（K）attenuated this change. Mean±SEM. n=5.**P＜0.01 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs ADR group.圖3 抑制CaMKII活化可減少ADR誘導的核NFAT蛋白增加

討 論

AKI 嚴重時可引起嚴重電解質酸堿紊亂、感染、心衰、肺水腫、昏迷，甚至死亡。AKI 的發病率和死亡率較高［16-17］，是危害人類健康的常見急重癥之一，在發展中國家造成嚴重的醫療和經濟負擔［18-19］。AKI 的早期表現、危險因素和致病機制缺乏認識，常導致AKI 的防治不足，可加速患者病情進展，帶來更嚴重的腎臟損傷、多器官損害和更高的死亡風險［18］。明確AKI 早期發病的分子機制，有助于疾病的早期識別和藥物干預。AKI 病因可分為腎前性、腎性和腎后性損傷；其中，腎前性主要是腎灌注減少誘發，腎后性多是尿路梗阻所致；而腎性損傷的病因最為繁多和復雜，包括腎小管、腎間質、腎血管和腎小球的損傷，尤以腎小管的損傷最為多見。RTEC 凋亡是導致腎性AKI 發生發展的重要原因。因此，明確RTEC 凋亡的分子機制有可能為AKI 防治提供參考資料。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶CaMKII 在各組織廣泛表達，與細胞凋亡密切相關［9-10］。藥物抑制或基因敲除CaMKII可保護內質網應激誘發的小鼠心肌細胞凋亡［10］。體外研究表明CaMKII 過表達可促進碘海醇誘導的線粒體損傷和RTEC 凋亡［7］。這可能與CaMKII 下游的CypD/mPTP 通路異常激活促進RTEC損傷有關［7］。在上述研究的基礎上，為探索AKI 中CaMKII 在RTEC 凋亡中作用和分子機制，我們首先采用ADR 干預體外RTEC和小鼠，結果顯示RTEC凋亡率和小鼠血清肌酐顯著升高，這與以往研究結論一致［12-13］，提示 RTCE 凋亡模型和 AKI 模型構建成功。ADR 干預后HK-2 細胞和小鼠腎組織中CaMKII活性顯著增加；抑制CaMKII 活性后，HK-2 細胞凋亡和小鼠腎組織細胞凋亡減輕，小鼠血清肌酐水平回降。上述結果提示CaMKII 異常激活可促進AKI 中RTEC凋亡。

NFAT 是鈣調磷酸酶（calcineurin，CaN）的底物，是Ca2+依賴的轉錄因子。NFAT作為Ca2+/CaM信號通路的下游分子起到促進細胞凋亡的作用［20-21］。高糖刺激下NFAT 核蛋白表達水平顯著升高，抑制CaN/NFAT 通路后可顯著減輕高糖損傷誘導的腎小球足細胞凋亡［22-24］。此外，Ca2+/CaM 信號下游的 CaMK/CREB 通路也可激活 NFAT 功能［26］。既往研究提示CaMKII 和NFAT 有可能存在相互作用，共同參與調控RTEC凋亡。據此，本研究深入探索上述分子在早期AKI 致病中的作用機制。我們觀察到活化劑干預激活CaMKII 后，體外模型中RTEC 細胞凋亡率顯著升高，但在沉默NFAT后，細胞凋亡率顯著降低。在ADR 損傷的RTEC 和小鼠腎組織中，核蛋白NFAT 顯著升高伴隨RTEC 凋亡增加，而在抑制CaMKII 活化后核蛋白NFAT 回降且細胞凋亡率降低。上述結果提示CaMKII 可通過調控NFAT 促進小鼠RTEC凋亡。

綜上所述，本研究建立了人RTEC 凋亡模型和AKI 小鼠模型，并在模型中觀察到CaMKII 可通過NFAT促進小鼠RTEC凋亡。這有可能為AKI防治提供參考資料。

Figure 4. CaMKII promoted RTEC apoptosis through NFAT. A：total NFAT protein expression was knockdown to about 45% in NFAT-siRNA（siNFAT）-treated HK-2 cells；B：apoptosis rate was significantly increased in ADR- or calmodulin（CaM；CaMKII activator）-injured HK-2 cells compared with control（Con）or siRNA blank control（siCon）group，but apoptosis was significantly alleviated by siNFAT in ADR- or CaM-injured HK-2 cells. Mean±SEM. n=4.*P＜0.05 vs Con or siCon group；#P＜0.05 vs ADR group；△P＜0.05 vs CaM group.圖4 CaMKII通過NFAT促進RTEC凋亡