右美托咪定通過抑制NLRP3炎癥小體活化減輕膿毒癥大鼠急性腎損傷*

周文杰， 楊海榮， 張 楠， 劉勤富， 馬希剛△

（1寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院重癥醫(yī)學科，寧夏銀川750004；2寧夏醫(yī)科大學附屬自治區(qū)人民醫(yī)院，寧夏銀川750021；3寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院手術室，寧夏銀川750004）

膿毒癥定義為機體對感染的反應失調(diào)，大量炎癥介質級聯(lián)釋放，從而引起的致命的器官損傷和功能障礙，目前死亡率仍居高不下［1］。膿毒癥急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）約占所有病因引起AKI 發(fā)生的50%左右，其具有高發(fā)病率和高病死率的特點，有報道稱其病死率高達70%，另外還會增加發(fā)展至慢性腎臟病及終末期腎病的風險，目前主要依賴于腎臟替代治療，缺乏有效的早期治療藥物［2-5］。因此，探討膿毒癥AKI 的發(fā)病機理且尋找能早期干預治療的有效藥物尤為重要。腎臟炎癥在膿毒癥AKI 中起主導作用，而NOD 樣受體蛋白 3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的活化對腎臟炎癥的發(fā)展至關重要。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用，且對呼吸功能無抑制并能保持患者的易喚醒狀態(tài)，在ICU 被廣泛使用。有研究顯示，DEX 還具有抗炎癥反應和器官保護等重要作用［6-7］。本研究通過盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）制備大鼠膿毒癥 AKI 模型，探討DEX對大鼠膿毒癥AKI的保護作用及其相關機制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雄性 SD 大鼠 60 只，6～8 周，體重（250±20）g，購買并飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心，動物合格證號為SCXK（寧）2015-0001，室溫22～25 ℃，相對濕度45%～55%，12 h晝夜交替，自由攝取水和食物。操作符合動物倫理學標準，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學科研倫理審查委員會批準（審批號：2019-228）。

1.2 藥物和試劑 右美托咪定注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）和腎損傷分子 1（kidney injury molecule-1，Kim-1）的ELISA 試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）；兔抗NLRP3 多克隆抗體和兔抗白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）多克隆抗體（Abcam）；兔抗caspase-1 多克隆抗體和兔IL-18 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；兔抗GAPDH 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗和封閉用羊血清（北京中杉金橋生物科技有限公司）；總RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立和分組 60 只大鼠隨機分為4 組，假手術（Sham）組、Sham+DEX 組、CLP 組及CLP+DEX組，每組各 15 只。采用 CLP 法制備大鼠模型［8］。大鼠用2%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）充分麻醉，備皮消毒，下腹正中線做長約1.5 cm 切口。打開腹腔，分離并牽出盲腸，在盲腸根部用3-0 絲線結扎。用直徑2.6 mm 三棱針穿刺3 孔，擠出少量糞便后將盲腸回納腹腔，逐層縫合關腹。術畢皮下注射復方氯化鈉30 mL/kg 補液。Sham 組和 Sham+DEX 組大鼠僅行開關腹操作。Sham+DEX 組和CLP+DEX 組大鼠術前1 h經(jīng)尾靜脈以5 μg·kg-1·h-1的速率泵入DEX；Sham組和CLP組大鼠以5 μg·kg-1·h-1的速率泵入生理鹽水。

2.2 血清生化指標檢測 各組分別于術后6、12 和24 h處死5只大鼠，收集血清。采用全自動生化分析儀（HITACHI 7180）檢測血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

2.3 血清NGAL 和Kim-1 檢測 采用ELISA 試劑盒測定，按照說明書，標準孔加標準品50 μL，建立標準曲線。樣品孔加樣品稀釋液40 μL 及待測樣品10 μL進行后續(xù)操作，在450 nm 波長處測量各孔的吸光度（A）值，最后根據(jù)標準曲線確定樣品的濃度。

2.4 腎組織病理學檢查 取腎臟組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后切成 4 μm 厚的切片，HE 染色，400 倍光鏡下觀察病理學改變。參照文獻［9］對腎小管損傷進行半定量評分：無損傷為0 分；損傷程度＜25%為1 分；25%≤損傷程度＜50%為 2 分；50%≤損傷程度＜75%為 3 分；≥75%為4分。

2.5 透射電鏡檢查 將腎組織置于2%戊二醛中前固定2 h，1%餓酸后固定2 h，梯度乙醇依次脫水，環(huán)氧丙烷滲透，包埋組織，制作切片，在透射電鏡（HITACHI H7650）下觀察腎組織超微結構。

2.6 免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟復水，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，山羊血清封閉，滴加 NLRP3 抗體（1∶200）、caspase-1 抗體（1∶200）、IL-1β 抗體（1∶200）和IL-18 抗體（1∶200）4 ℃過夜，次日滴加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，滴加3，3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，脫水透明后封片。光鏡下觀察腎組織呈棕黃色處為陽性表達。每只大鼠取3張切片，每張切片在陽性表達區(qū)選取3 個不重復視野高倍鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定積分吸光度（IA）和陽性表達面積，從而計算平均吸光度（A）值（A=IA/面積）。

2.7 Western blot 檢測蛋白水平 取腎組織稱重后加蛋白裂解液，提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。按比例上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，低溫下濕轉到PVDF 膜上，在含5%脫脂牛奶的封閉液中浸泡1 h，加 NLRP3 抗 體（1∶500）、caspase-1 抗 體（1∶1 000）、IL-1β 抗體（1∶2 000）、IL-18 抗體（1∶2 000）和GAPDH 抗體（1∶2 000）置于4 ℃過夜，次日用Tris 緩沖液沖洗3次，加Ⅱ抗置于水平搖床孵育1 h，洗膜后曝光采圖。采用ImageJ軟件進行分析。

2.8 RT-qPCR檢測mRNA水平 使用RNAsimple總RNA提取試劑盒從腎組織中提取總RNA。實時定量PCR 反應使用 Bestar?SYBR Green qPCR Master Mix在 20 μL 反應體積中使用 1 μL cDNA 進行。選擇GAPDH 作為內(nèi)參照，目的 mRNA 相對水平使用 2-ΔΔCt法計算。GAPDH 上游引物為5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下 游 引 物 為 5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′；NLRP3 上游引物為5′-GCAGCGATCAACAGGCGAGAC-3′，下 游 引 物 為 5′-TCCCAGCAAACCTATCCACTCCTC-3′；caspase-1 上 游 引 物 為5′-AAACACCCACTCGTACACGTCTTG-3′，下 游 引 物為 5′-AGGTCAACATCAGCTCCGACTCTC-3′；IL-1β 上游引物為 5′-CTCACAGCAGCATCTCGACAAGAG-3′，下游引物為5′-TCCACGGGCAAGACATAGGTAGC-3′；IL-18 上 游 引 物 為 5′-CGACCGAACAGCCAACGAATCC-3′，下 游 引 物 為 5′-CACAGATAGGGTCACAGCCAGTC-3′。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 大鼠腎功能指標檢測

術后6 h SCr 和BUN 水平無顯著差異。與Sham組相比，CLP 組于術后 12 h SCr 和 BUN 水平升高，24 h 顯著升高（P＜0.01）；與 CLP 組相比，CLP+DEX 組12 h 和 24 h 的 SCr 及BUN 水平均下降（P＜0.01），見圖1A、B。

與Sham 組相比，CLP 組術后各時點血清NGAL和Kim-1水平均升高（P＜0.01）；給予DEX 預處理后，血清NGAL 和Kim-1 水平均下降（P＜0.01）。Sham 組與Sham+DEX 組各時點NGAL 和Kim-1 水平無顯著差異（P＞0.05），見圖1C、D。

2 腎組織病理學檢查

使用HE 染色評估腎組織病理學改變?nèi)鐖D2A 所示，Sham組和Sham+DEX組各時點腎組織結構完整、清晰，未見明顯腎小管損傷的改變。CLP 組在術后6 h可見腎小管上皮細胞空泡變性；術后12 h可見腎小管上皮空泡變性加重，刷狀緣脫落；術后24 h腎小管損傷進一步加重，可見腎小管明顯擴張，間質散在出血和炎性細胞浸潤。CLP+DEX 組各時點腎小管上皮細胞損傷程度均較CLP 組減輕。CLP 組各時點的腎小管損傷評分較Sham 組升高（P＜0.01）；與CLP 組比較，CLP+DEX 組腎小管損傷評分降低（P＜0.01），見圖2B。

3 透射電鏡檢查

Sham組和Sham+DEX組各時點近曲小管結構正常。CLP 組6 h 可見腎小管上皮細胞內(nèi)小空泡，線粒體腫脹，部分線粒體嵴溶解；12 h 見較多大空泡，線粒體數(shù)量減少，嵴溶解加重，微絨毛融合；24 h 見上皮細胞凋亡，線粒體溶解，微絨毛脫落。CLP+DEX組各時點腎小管損傷程度均較CLP組減輕，見圖3。

4 免疫組化染色觀察

4.1 NLRP3 和caspase-1 免疫組化 結果顯示NLRP3 和caspase-1 在腎小管上皮細胞胞質表達。與Sham 組相比，CLP 組各時點 NLRP3 和 caspase-1 陽性表達均升高，且隨術后時間延長，表達呈升高趨勢（P＜0.01）。與CLP 組相比，CLP+DEX 組各時點NLRP3 和 caspase-1 陽性表達均降低（P＜0.01）。Sham組和Sham+DEX組NLRP3和caspase-1陽性表達水平無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

Figure 1. Effects of DEX on SCr（A），BUN（B），NGAL（C）and Kim-1（D）in serum of the rats. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs Sham group；##P＜0.01 vs CLP group.圖1 右美托咪定對各組大鼠血清SCr、BUN、NGAL和Kim-1水平的影響

Figure 2. Pathological changes（A）and tubular injury score（B）of renal tissues（HE staining，scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs CLP group.圖2 HE染色觀察右美托咪定對各組大鼠腎組織病理學改變和腎小管損傷評分的影響

Figure 3. Observation of ultrastructure changes in kidney tissue by transmission electron microscope（scale bar=2 μm）.圖3 透射電鏡觀察右美托咪定對各組大鼠腎組織超微結構改變的影響

Figure 4. Effects of DEX on expression of NLRP3（A）and caspase-1（B）in the rats of each group（scale bar=20 μm）. Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs Sham group；##P＜0.01 vs CLP group.圖4 免疫組化觀察右美托咪定對各組大鼠腎組織NLRP3和caspase-1表達的影響

4.2 IL-1β 和 IL-18 免疫組化 結果顯示 IL-1β 和IL-18 在腎小管上皮細胞胞質表達，CLP 組各時點腎組織 IL-1β 和 IL-18 陽性表達較 Sham 組均顯著升高（P＜0.01）。給予DEX預處理后，CLP+DEX 組各時點腎組織IL-1β 和IL-18 陽性表達較CLP 組均降低（P＜0.01）。Sham 組和 Sham+DEX 組 IL-1β 和 IL-18 陽性表達水平無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

5 Western blot檢測結果

Figure 5. Effects of DEX on expression of IL-1β（A）and IL-18（B）in the rats of each group（scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs Sham group；##P＜0.01 vs CLP group.圖5 免疫組化觀察右美托咪定對各組大鼠腎組織IL-1β和IL-18表達的影響

與 Sham 組相比，CLP 組各時點 NLRP3、caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的蛋白表達均升高，且表達均隨術后時間延長漸行性升高（P＜0.01）。給予DEX 預處后，CLP+DEX 組各時點 NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 的蛋白表達較CLP 組相比均顯著降低（P＜0.01）。NLRP3、caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的蛋白表達在Sham 組和Sham+DEX 組無顯著差異（P＞0.05），見圖6。

6 RT-qPCR檢測結果

與 Sham 組相比，CLP 組各時點 NLRP3、caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的 mRNA 表 達 水 平 均 升 高（P＜0.01）。與 CLP 組相比，CLP+DEX 組各時點腎組織NLRP3 和 IL-18 mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.01），腎組織 caspase-1 和 IL-1β mRNA 表達水平均有所降低（P＜0.05）。Sham 組與 Sham+DEX 組 NLRP3、Caspase-1 和 IL-1β 和 IL-18 mRNA 表達無顯著差異（P＞0.05），見圖7。

討 論

AKI 是膿毒癥患者最常見的并發(fā)癥，與患者的死亡率增加獨立相關［10-11］。目前CLP 誘發(fā)的膿毒癥是應用最廣泛的膿毒癥動物模型制備方法。本研究中，CLP 誘導的大鼠膿毒癥AKI 病理改變主要以腎小管損傷為主，包括小管上皮細胞空泡變性、刷狀緣脫落、腎小管擴張、線粒體損傷，甚至上皮細胞凋亡等，這與文獻報道一致［12-13］，給予 DEX 干預后，腎小管損傷程度減輕，說明DEX 能在一定程度上改善大鼠膿毒癥AKI 的腎臟病理損害。SCr 和BUN 作為診斷AKI 的傳統(tǒng)指標，主要反應腎小球的濾過功能，而NGAL 和Kim-1 作為診斷早期AKI 的有效標志物，主要在腎小管損傷時顯著升高。本實驗中，DEX 能降低血清 SCr、BUN、NGAL 和 Kim-1 的水平，說明 DEX能改善膿毒癥大鼠腎小球的濾過功能，同時能減輕腎小管的損傷。

膿毒癥AKI的致病機理復雜，主要涉及以下3個主要的機制：炎癥反應、腎小管微循環(huán)改變和腎小管適應性代謝重編程［14-16］，其中炎癥反應是造成膿毒癥AKI 的主要原因。NLRP3 炎癥小體被認為是炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)，在多種炎癥性疾病中具有重要意義［17-18］。NLRP3炎癥小體的激活有兩個階段，一是通過誘導 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor-4，TLR4），激活核轉錄因子信號通路，介導產(chǎn)生IL-1β 和IL-18 前體；二是脂多糖等刺激信號與NLRP3受體結合，促進分泌為成熟的IL-1β 和IL-18，從而發(fā)揮免疫炎癥效應［19-20］。研究表明，腎小管上皮細胞也表達TLR4 受體，病原體或損傷相關分子模式可與之結合，啟動下游的級聯(lián)信號反應，從而導致大量IL-1β 和IL-18 等促炎因子的合成和釋放，造成腎臟炎癥環(huán)境，炎癥介質直接或間接損害腎小管上皮細胞，引起線粒體損傷、能量代謝障礙，甚至細胞凋亡［21］。本研究中，CLP組大鼠腎組織中 NLRP3、caspase-l、IL-1β 和 IL-18 的表達顯著升高，且隨著術后時間延長呈進行性升高趨勢，這與腎臟病理損害程度一致，說明腎臟炎癥反應越強，腎臟病理損傷程度越重，腎功能越差，而NLRP3 炎癥小體的活化在大鼠膿毒癥AKI 的致病過程中起重要作用。

Figure 6. Effects of DEX on protein level of NLRP3（A），caspase-1（B），IL-1β（C）and IL-18（D）in the rats of each group. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs Sham group；##P＜0.01 vs CLP group.圖6 Western blot檢測右美托咪定對各組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白水平的影響

DEX 是高選擇性α2受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流動力學和抗應激反應等作用［22-23］。近年來有越來越多研究顯示，DEX 可抑制炎癥因子產(chǎn)生，降低炎癥反應，抑制細胞凋亡信號通路的激活，對腎臟、肺臟、大腦等重要器官具有保護作用［24-26］。有研究顯示，DEX 能降低LPS 誘導的膿毒癥小鼠血清和胰腺組織中的 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平，減輕胰腺炎癥反應［27］。DEX 還可以通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS 信號通路減輕 LPS 誘導的 AKI［28］。本研究結果顯示給予DEX 干預后，大鼠腎組織NLRP3、caspase-l、IL-1β 和 IL-18 的表達水平均顯著下降，說明DEX 能通過抑制NLRP3 炎癥小體的活化，減少炎癥因子釋放，從而減輕腎組織炎癥反應，改善腎小管病理損傷程度及腎功能。

Figure 7. Effects of DEX on the mRNA level of NLRP3（A），caspase-1（B），IL-1β（C）and IL-18（D）in the rats of each group.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs Sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs CLP group.圖7 RT-qPCR檢測右美托咪定對各組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA水平的影響

綜上所述，我們證實了DEX 可一定程度上減輕CLP 誘發(fā)的大鼠膿毒癥AKI，其機制可能與抑制NLRP3炎癥小體的活化有關。