星狀神經節阻滯減輕失血性休克后腸淋巴液介導的炎癥反應*

杜會博， 趙向達， 段夢瑾， 孫轉友， 付達達， 張 璨，張立民， 趙自剛△， 牛春雨

（1河北北方學院微循環研究所/基礎醫學院，河北張家口075000；2河北醫科大學基礎醫學院，河北石家莊050017）

多發性創傷、消化道潰瘍和產科意外等原因引起的失血性休克是常見的臨床急危重癥。數據表明，全球范圍內每年約有180 萬名患者死于失血性休克［1］。失控性炎癥反應是重癥失血性休克導致患者發生多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）甚至死亡的關鍵環節［2］。因此，及時有效恢復炎癥反應與抗炎反應平衡是降低重癥失血性休克病死率、改善患者預后的主要策略之一。目前認為，腸淋巴途徑是腸源性細菌、內毒素移位除門靜脈途徑外的另一條關鍵通路，失血性休克后腸淋巴液（post-hemorrhagic shock mesenteric lymph，PHSML）回流是導致器官損傷的重要橋梁與基本機制［3-4］。積極探索靶向PHSML 的治療策略對于降低休克病死率具有重要的現實意義。星狀神經節阻滯（stellate ganglion blockade，SGB）作為一種交感神經阻斷術，具有協調平衡交感神經和副感覺神經的功能，使機體的自主神經功能、內分泌功能和免疫功能保持正常，從而維持內環境穩定。由于交感神經過度興奮引起的血流分布異常、炎癥反應加劇參與了失血性休克后的多器官損傷，一定程度上降低交感神經系統活性的藥物治療措施有利于減輕器官損傷［5］，故SGB 對失血性休克的干預作用值得關注。前期研究表明，SGB 可顯著降低急性失血大鼠的死亡率，延長存活時間，有效減輕腸損傷［6］；但SGB對失血性休克后的炎癥反應有何作用，SGB 的作用是否與PHSML 回流有關，目前還不清楚。為此，本研究觀察SGB 對失血性休克大鼠血清和組織炎癥介質的作用以及靜脈輸入PHSML 對SGB 作用的影響，探討SGB減輕失血性休克炎癥反應的腸淋巴機制。

材料和方法

1 實驗動物與實施方案

健康成年SPF 級雄性Wistar 大鼠，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2019-0010，飼養于封閉的動物室［溫度（24±2）℃，濕度（50±10）%，光照節律晝夜交替］，自由飲食，清潔飲水。

實驗方案如下：（1）隨機取12 只大鼠，用常規方法建立失血性休克模型，引流PHSML，用于后續實驗中輸入PHSML 至SGB 處理的休克大鼠。（2）再取12只大鼠，分為假手術（sham）組、休克（shock）組和shock+SGB 組，用于引流淋巴液，分別為正常淋巴液（normal mesenteric lymph，NML）、PHSML 和 SGB 處理后的PHSML（PHSML after SGB treatment，PHSMLSGB）。（3）將其它30 只大鼠隨機均分為5 組（n=6）：sham 組、假手術+SGB（sham+SGB）組、shock 組、shock+SGB 組 和 shock+SGB+回 輸 PHSML（shock+SGB+PHSML）組。sham 和 sham+SGB 組實施與 shock組相同置管手術，不放血，也不進行液體復蘇；shock、shock+SGB 和 shock+SGB+PHSML 組建立失血性休克模型（見方法2.3）；sham+SGB、shock+SGB 和shock+SGB+PHSML組實施SGB（見方法2.1）；shock+SGB+PHSML 組在液體復蘇的同時輸入PHSML。實驗前所有動物禁食8 h，自由飲水。所有動物實驗過程中遵循動物福利，將對動物可能的傷害減少至最低程度。

2 方法

2.1 實施SGB 技術 大鼠稱重后，將動物放入VMR 型小動物吸入麻醉機（MIDMARK）的麻醉誘導箱中，吸入3%異氟烷（河北一品制藥有限公司，批號217150901）誘導麻醉，氧流量控制在 1～1.5 L/min。待動物進入麻醉狀態后，將大鼠俯臥位固定于手術臺上，用面罩維持異氟烷麻醉狀態。取0.5%鹽酸羅哌卡因注射液（AstraZeneca，批號NAKM）0.2 mL 后路徑盲法穿刺，回抽無血后注入藥物，所有大鼠行右側SGB。注射藥物完畢后停止吸入異氟烷，3～5 min后大鼠蘇醒，蘇醒后觀察SGB 是否成功。SGB 成功的指征是注射藥物側出現Horner 綜合征，以眼瞼下垂作為陽性體征的判斷標準［6-7］。

2.2 留取PHSML 誘導麻醉后，應用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg；Merck，批號P11011）對大鼠進行全身麻醉，于雙側股部行手術，鈍性分離右側股動脈、股靜脈，插管后經股靜脈注射1%肝素鈉溶液用于全身抗凝，于股動脈連接ML4818型PowerLab生物信號采集系統（ADInstruments），實時監測平均動脈血壓（mean artery pressure，MAP）；同時，分離左側股動脈并插管，連接注射器固定于NE-1000 型精準程控微量注射泵（New Era Pump Systems）上備放血用，1%肝素鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號F20130517）全身抗凝（1 mL/kg）。手術完成后穩定10 min，放血至MAP 為40 mmHg，維持低血壓［（40±2）mmHg］90 min。然后，將放出的失血與等量復方氯化鈉溶液（山東華魯制藥有限公司，批號1705161405）混合后，經過右側股靜脈進行液體復蘇，30 min 完成。輸液完成后引流大鼠腸淋巴液3 h。同時，部分大鼠實施SGB 后，建立失血性休克模型，引流PHSML-SGB。此外，取部分sham 大鼠，相同方法，引流NML，1 h。將引流的腸淋巴液離心，取上清液保存于-80 ℃備用。

2.3 失血性休克大鼠模型 大鼠經前述方法麻醉、分別行SGB 或假SGB 后，股部行無菌手術，剝離左股靜脈并插管，1%注射肝素抗凝后，左側股動脈插管，備放血；剝離右側股動脈后插管，通過PowerLab生物信號采集系統連續監測MAP；shock 組大鼠自左側股動脈在10 min 內勻速抽出全血量的25%（全血量=體重/13）。待放血完成90 min 后，左側股靜脈連接抽注機輸入自身所放血液與復方氯化鈉1∶1 混合液體進行液體復蘇，30 min 勻速輸完。shock+SGB+PHSML 組大鼠在液體復蘇的同時，輸入PHSML（1 mL/kg）。

2.4 標本留取 休克大鼠液體復蘇結束后3 h 或相對應的時點，打開腹腔，使用真空采血管采集門靜脈血 3 mL，3 000 r/min 低溫離心 10 min 后，取血漿放入-80 ℃冰箱保存。然后取固定位置的腎（左腎縱切后的一側腎組織）、腸（距回腸末端10 cm左右的空回腸組織）和肺（右肺中葉）組織，加入9 倍冰生理鹽水后，常規方法制備組織勻漿，-80 ℃冰箱保存。

2.5 ELISA 應用ELISA 試劑盒檢測大鼠血漿及腎、腸和肺組織勻漿脂多糖受體CD14、脂多糖結合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和 CXC 趨化因子配體 1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）的濃度（試劑盒購自武漢基因美公司，貨號分別為JYM1137Ra、JYM0079Ra、JYM0646Ra、JYM0635Ra和JYM1144Ra）。組織勻漿蛋白濃度應用BCA 蛋白定量試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）檢測，用于組織勻漿炎癥因子水平的標準化。

2.6 腸淋巴液內毒素水平測定 應用TAL 動態濁度法、采用鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司）及內毒素檢測分析儀（ATi 320-06，Lab Kinetics），常規方法檢測腸淋巴液中的內毒素水平［8］。所有與實驗相關的器械或耗材，均無熱源。

3 統計學處理

所有數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示。應用SPSS 16.0統計軟件包進行方差齊性檢驗，方差齊的資料多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，方差不齊的資料采用Kruskal-Wallis 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 SGB對失血性休克大鼠MAP的影響

sham 和 sham+SGB 組大鼠 MAP 在整體觀察期間均無顯著變化；大鼠放血前，5 組間大鼠MAP 均未見顯著差異；大鼠急性失血后的90 min 內，shock、shock+SGB 和 shock+SGB+PHSML 組大鼠的 MAP 均代償性回升，但在各時點均顯著低于sham 與sham+SGB 組，3 組大鼠間的MAP 均未見顯著差異；液體復蘇開始后至隨后的所有時間內，5 組間大鼠MAP 均未見顯著差異，見圖1。

2 SGB 對失血性休克大鼠血漿炎癥因子水平的影響

sham 和 sham+SGB 組大鼠血漿CD14、LBP、TNF-α、IL-6 和 CXCL1 水平均未見顯著差異（P＞0.05）；shock 組大鼠血漿 CD14、LBP、TNF-α 和 IL-6 水平均顯著高于sham 組（P＜0.05）；shock+SGB 組大鼠血漿CD14、LBP、TNF-α、IL-6 和 CXCL1 水平明顯低于shock 組（P＜0.05）；shock+SGB+PHSML 組大鼠血漿CD14、LBP、TNF-α、IL-6 和 CXCL1 水平均顯著高于shock+SGB組（P＜0.05），見圖2。

3 SGB對失血性休克大鼠腎、腸和肺組織炎癥因子水平的影響

Figure 1. Effect of stellate ganglion blockade（SGB）on mean blood pressure（MAP）in rats with hemorrhagic shock. PHSML：posthemorrhagic shock mesenteric lymph. Mean±SEM. n=6.圖1 星狀神經節阻滯對失血性休克大鼠平均動脈血壓的影響

Figure 2. Effects of stellate ganglion blockade（SGB）on the inflammatory cytokines in plasma of rats with hemorrhagic shock.PHSML：post-hemorrhagic shock mesenteric lymph. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs sham or sham+SGB group；#P＜0.05 vs shock group；△P＜0.05 vs shock+SGB group.圖2 星狀神經節阻滯對失血性休克大鼠血漿炎癥因子水平的影響

sham 和sham+SGB 組大鼠腎、腸和肺組織勻漿CD14、LBP、TNF-α、IL-6 和 CXCL1 水平均未見顯著差異（P＞0.05）；shock 組腎組織勻漿 CD14、LBP、TNF-α 和 CXCL1 水平，腸組織勻漿 CD14、LBP、TNF-α、IL-6和CXCL1水平均顯著高于sham 組（P＜0.05）；shock+SGB 組腎和腸組織勻漿 CD14、LBP、TNF-α、IL-6 和 CXCL1 水平及肺組織 CD14 和 IL-6 水平顯著低于 shock 組（P＜0.05）；shock+SGB+PHSML 組腎組織勻漿CD14 和CXCL1 水平顯著高于shock+SGB 組（P＜0.05），而腸和肺組織勻漿各指標較shock+SGB組有上升趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

4 SGB對PHSML中內毒素水平的影響

來自shock 組大鼠的PHSML 中內毒素水平顯著高于來自sham 大鼠的NML（P＜0.05），而來自shock+SGB 大鼠的PHSML-SGB 中內毒素水平顯著低于PHSML（P＜0.05），見圖4。

Figure 3. Effects of stellate ganglion blockade（SGB）on the inflammatory cytokines in renal，intestinal and pulmonary tissues of rats with hemorrhagic shock. PHSML：post-hemorrhagic shock mesenteric lymph. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs sham or sham+SGB group；#P＜0.05 vs shock group；△P＜0.05 vs shock+SGB group.圖3 星狀神經節阻滯對失血性休克大鼠腎、腸和肺組織炎癥因子水平的影響

Figure 4. Stellate ganglion blockade（SGB）treatment reduced the endotoxin level in post-hemorrhagic shock mesenteric lymph （PHSML）. Mean±SEM. n=4～6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs shock group.圖4 星狀神經節阻滯降低了失血性休克后腸淋巴液中的內毒素水平

討 論

創傷失血性休克是一種病情兇險、并發癥多、易導致多器官功能衰竭的急危重癥。失血性休克后因組織的缺血缺氧和炎癥反應導致細胞因子和炎癥介質的大量活化，通過激活先天免疫系統，引起全身性炎癥反應綜合征乃至多器官損傷的發生，發展為膿毒癥［9］。由于腸源性感染，尤其是細菌內毒素移位在失血性休克發展為膿毒癥的過程中起決定作用，且腸淋巴液回流在這一過程中發揮關鍵作用［3-4］，考慮到前期發現PHSML 高水平的內毒素是引起炎癥反應的重要環節，結合CD14 和LBP 是內毒素引起炎癥反應的關鍵介質［10］，本研究以 CD14、LBP、TNF-α和IL-6 作為觀察指標。同時，考慮到CXCL1 引起的中性粒細胞趨化活性增強對炎癥反應的促進作用［11］，故選擇CXCL1作為另一觀察指標。

研究發現，大鼠在急性失血1.5 h、液體復蘇3 h后，血漿 CD14、LBP、TNF-α 和 IL-6 水平，腎 CD14、LBP、TNF-α 和CXCL1 水平，以及腸CD14、LBP、TNF-α、IL-6 和CXCL1 水平均顯著升高，提示急性失血引起了大鼠的炎癥反應增強。但也看到，肺組織的這些指標均未發生顯著變化，說明肺組織的炎癥反應較輕。其主要原因為，本研究所用的動物模型為急性失血所致，由于沒有持續維持低血壓，動物急性失血后迅速出現了代償反應，從MAP 的變化也可以反映出這一點，這說明本模型對動物的損傷程度較輕。從另外一個側面也反映出，由于急性失血后“自身輸血”的代償反應，腎和腸缺血加重，而心、腦和肺的血液供應是充足的。在這一代償過程中，交感神經興奮是關鍵啟動環節。

鑒于急性休克后交感神經興奮的作用以及SGB的干預作用，本研究在前期發現SGB 延長急性失血大鼠存活時間、減輕腸屏障損傷的基礎上［6］，進一步觀察了SGB 對急性失血大鼠炎癥反應的作用。研究發現，SGB 可明顯降低失血性休克大鼠血漿、腎組織和腸組織TNF-α、CD14、IL-6、LBP 和CXCL1 水平，以及肺組織CD14 和IL-6 水平。這一結果提示，SGB 預防性治療減輕了失血性休克引起的全身性炎癥反應。研究報道，以交感神經離斷術模擬SGB 可通過抑制全身炎癥反應減輕膿毒癥大鼠的急性肺損傷［12］，亦可通過抑制促炎因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β來調節早期炎癥反應［13］。此外，本實驗室后期研究顯示，失血性休克后再行SGB 處理，仍可延長動物的存活時間，改善腸道屏障功能（未發表數據）。這說明，SGB 的抗休克作用具有普遍性，但SGB 抗炎的機制尚待深入研究。

鑒于PHSML 回流在失血性休克后器官損傷中的關鍵作用［3-4］，本文探討了 SGB 與 PHSML 的關系。實驗觀察到，將引流至體外的PHSML 經靜脈輸入SGB 預防性治療的失血性休克大鼠，明顯提高了經SGB 預防性治療的失血性休克大鼠血漿TNF-α、CD14、IL-6、LBP 和 CXCL1 及腎組織 CD14 和 CXCL1的水平。這一結果提示，SGB 減輕失血性休克引起的炎癥反應可能是通過減少PHSML 中的某些毒性成分實現的。SGB 影響PHSML 中內毒素水平的實驗結果表明，SGB 的有益作用是通過降低PHSML 中內毒素水平實現的。前期實驗觀察到，PHSML 作用于內皮細胞，引起內皮細胞發生形態和功能的改變多是在 6 h 出現的［14］，這也說明輸入 PHSML 對 SGB減輕腸和肺組織炎癥反應的作用不明顯的原因，可能與觀察時間過短導致mRNA 和蛋白表達的不同步有關。應當指出，如果進一步比較輸入PHSML-SGB與PHSML 的差異，可對這一結果起到更有力的支持，這也是本文的一個局限。

本研究也顯示，SGB 對急性失血大鼠的MAP 沒有明顯的影響，靜脈回輸PHSML也未引起MAP顯著變化，說明SGB 并未影響機體在血壓層面上對急性失血的良性應激，這對于保證重要器官的血液灌注是有利的，對于進一步擴展其臨床應用是有好處的。這一結果也說明，SGB 的有益作用與MAP 恢復可能無關。前期研究表明，SGB 可整體提高失血性休克大鼠的存活率［6］，降低PHSML中外泌體的數量［15］，且外泌體的分泌參與了炎癥反應的進展［16］，因此，SGB是否通過降低PHSML 中外泌體的某些成分進而影響炎癥反應，還需要進一步觀察。此外，SGB 恢復炎癥反應平衡的作用在SGB 整體發揮作用的機制還需進一步探討。

總之，SGB 具有抑制失血性休克大鼠炎癥反應的作用，該作用可能與減少PHSML 中內毒素水平進而降低炎癥反應有關（圖5），詳細機制有待進一步研究。本研究結果為臨床休克等危重病人的防治提供了實驗依據。以SGB 為治療策略、以PHSML 為干預靶點，對于防治重癥休克導致的全身炎癥反應具有積極作用。

Figure 5. Role of stellate ganglion blockade（SGB）pre-treatment in reducing inflammation following hemorrhagic shock. PHSML：post-hemorrhagic shock mesenteric lymph.圖5 星狀神經節阻滯降低失血性休克后炎癥反應的作用