CD8+細胞毒性T淋巴細胞對HBV感染的巨噬細胞的殺傷作用*

程 輝， 臧魯燕， 孫兆霞， 魏西軍， 李冠沖， 李海波

（1齊魯醫(yī)藥學院人體解剖學教研室，山東淄博255213；2濰坊市人民醫(yī)院中心實驗室，山東濰坊261041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染全球約2.5 億人，并增加了發(fā)展為肝硬化和肝細胞癌的風險［1］。目前HBV 感染的治療方法無法從肝臟中完全消除病毒［2］。因此，需要新的治療方法，包括免疫治療成分，以實現(xiàn)HBV 的功能性治愈。越來越多的證據(jù)表明，受感染的巨噬細胞有助于HBV 的持續(xù)存在和發(fā)病機制［3］。盡管HBV 感染的CD4+T細胞會在感染后的幾天內(nèi)死亡，但體外研究表明，巨噬細胞對HBV 復制的細胞病變效應具有抵抗力，從而導致病毒持續(xù)存在［4］。此外，受感染的巨噬細胞通過逃避中和作用，能在細胞間傳播中有效地將病毒傳播給CD4+T細胞［5］。CD8+細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTL）在HBV 感染的急性和慢性階段控制病毒水平并減少HBV 疾病進展［6］。既往大多數(shù)研究都集中在CTL 控制受感染的CD4+T 細胞上，較少關注受感染的巨噬細胞。研究表明，CTL 可以在體外消除 HBV 感染的 CD4+T 細胞［7］。然而，CTL介導的HBV 感染巨噬細胞的殺傷相對效率尚不明確。因此，本研究描述并比較了離體CTL 與HBV感染的巨噬細胞靶標的相互作用，旨在為了解感染HBV的巨噬細胞對CTL的反應提供參考資料。

材料和方法

1 實驗材料

小鼠抗CD68 單克隆抗體購自Abcam；兔抗HBV核心蛋白（HBV core protein，HBc）單克隆抗體購自Diagnostic Biosystems；蘇木精、Triton X-100、牛血清白蛋白和抗唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素1（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-1，Siglec-1）抗體購自Sigma；HRP 標記的羊抗兔或鼠免疫球蛋白Ⅱ抗購自DAKO；EasySep Human CD14 Positive Selection Kit II、EasySep Human CD4+T Cell Isolation Kit、EasySep Human CD8+T 細胞分離試劑盒購自STEMCELL Technologies；24 孔或 6 孔低附著板、TC板、L-谷氨酰胺和 HEPES 購自 Corning；重組 GMCSF、重組 M-CSF、抗 CD3 抗體、抗 CD28 抗體、重組IL-15、抗 CD14-APC/Cy7、抗 CD3-APC/Cy7、抗 CD4-APC、抗 TNF-α -BV711、Human TruStainFcX 和 抗CD33-BV421 購 自 BioLegend；IL-2 購 自 R&D Systems；HepAD38 細胞購自 ATCC；DMEM/F12 培養(yǎng)液購自Gaithersburg；HBV 核酸擴增熒光檢測試劑盒購自廣州中山大學達安基因公司；CellTrace Violet、細胞解離緩沖液、J3-AF647、甲醛PBS、Image-IT FX Signal Enhancer、Zenon Alexa Fluor 488小鼠IgG1標記試劑盒、Hoeschst 和 ProLong Antifade Gold 購自 Thermo Fisher；CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization Kit購自 BD Biosciences；抗 HBc-FITC 抗體和抗 HBc 抗體購自Beckman Coulter；抗早期內(nèi)體抗原1（early endosome antigen 1，EEA1）抗體和抗溶酶體相關膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1）抗體購自Cell Signaling Technology；抗兔IgG-AF488購自Jackson ImmunoResearch。

Cx31 顯微鏡購自 Olympus；ImageStream X Mark II 成像流式細胞儀購自Amnis；LSM 510 共聚焦顯微鏡購自Carl Zeiss AG。

2 方法

2.1 患者樣品收集及免疫組織化學染色 2020 年4 月～2021 年 3 月，收集從健康人群（n=6）和 HBV 感染患者（n=6）中獲得的肝臟活檢組織。將收集的組織標本立即在液氮中速凍，并保存在-80 ℃下準備用于進一步研究。研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準同意。每位患者均獲得書面知情同意書。將組織固定在福爾馬林中，包埋在石蠟中，以5 μm 的厚度切片，脫石蠟，再水化?？乖厥?，切片在壓力鍋中于10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液中浸泡3 min。用3%過氧化氫處理3 min 抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，并用10%非免疫山羊血清阻斷非特異性結合位點30 min。用小鼠抗CD68 單克隆抗體（識別巨噬細胞，1∶150）和兔抗HBc 單克隆抗體（識別HBV，1∶200）在4 ℃孵育過夜。次日，采用HRP 標記的羊抗兔或鼠免疫球蛋白Ⅱ抗培養(yǎng)20 min，用DAB基質(zhì)（DAKO）或永久性紅色基質(zhì)（DAKO）染色，并用蘇木精復染。使用Olympus Cx31顯微鏡對所有載玻片進行檢查。

2.2 原代細胞純化與細胞培養(yǎng) 采用Ficoll 梯度法分離獻血者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），并從PBMCs 中分離單核細胞衍生的巨噬細胞和CD4+T 細胞。使用EasySep Human CD14 Positive Selection Kit Ⅱ從冷凍的PBMCs 中分離單核細胞。使用EasySep Human CD4+T Cell Isolation Kit 從剩余的 PBMCs 中富集 CD4+T 細胞。單核細胞接種在24 孔或6 孔低附著板（每孔5×105或2×106個細胞）中，加入含有50 μg/L 重組GMCSF、50 μg/L 重組M-CSF、10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 mmol/L HEPES 的RPMI-1640培養(yǎng)液，并在7 d內(nèi)誘導為成熟巨噬細胞。在誘導成熟的第4 天更換一半含有新鮮GM-CSF/M-CSF的RPMI-1640培養(yǎng)液［5-7］。

CD4+T 細胞靶標采用抗CD3 和抗CD28 抗體激活。具體操作為：在分離前1 d，將一塊24 孔未處理的TC 板用含2 mg/L 抗CD3 抗體的無菌碳酸氫鹽包被 緩 沖 液（8.4 g NaHCO3、3.56 g Na2CO3和 1 L ddH2O，pH 為 9.5，每孔 500 μL）包被過夜。第2 天，每孔用 1 mL 無菌 PBS 洗滌 2 次，加入 400 μL 含有 4 μL 抗 CD28 抗體和 10 μg/L IL-2 的 R10 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。分離CD4+T 細胞并用含有10 μg/L IL-2的R10培養(yǎng)液重懸至2×109/L，然后將400 μL 細胞懸液加入24 孔板（每孔8×105個細胞），再加入終濃度為2 mg/L的可溶性抗CD28 抗體。激活4～5 d 后，將細胞從板中取出，用R10 培養(yǎng)液洗滌，并以5×108/L 接種在含有 10 μg/L IL-2 的 R10 培養(yǎng)液中，培養(yǎng) 3 d。收獲 24孔板中活化的CD4+T 細胞，并接種到T75 燒瓶，加入40 mL含有10 μg/L IL-2的R10培養(yǎng)液。

2.3 細胞培養(yǎng) HepAD38 細胞用DMEM/F12 培養(yǎng)液（GIBCO/BRL）培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和 1 mg/L 多西環(huán)素。需要時，去除多西環(huán)素以啟動HBV 前基因組RNA 轉錄。細胞在膠原包被的平板上培養(yǎng)。

2.4 HBV 純化 HBV 從 HepAD38 細胞培養(yǎng)液中濃縮 100 倍，置于含有 10% PEG8000 的 0.4 mol/L NaCl溶液，在4 ℃下放置過夜。以8 000×g離心30 min，取沉淀重懸于無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液中。根據(jù)HBV核酸擴增熒光檢測試劑盒說明書，通過實時聚合酶鏈反應對上清液中的病毒顆粒進行定量。檢測HBV S 區(qū) 的 引 物 是 5′-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3′ 和 5′-ACAGGGGGAAAGCCCTACGAA-3′，以 及 5′-FAM-TGGCTAGTTTACAGTGCCATTTGTAMRA-3′熒光探針。在iCycler iQ Real-Time PCR Detection System 中進行了 42個循環(huán)的定量 PCR［4］。

2.5 HBV 感染靶細胞的制備 HBV 用于感染GMCSF/M-CSF 衍生的巨噬細胞和CD4+T 細胞，并用于共培養(yǎng)試驗。巨噬細胞在37 ℃下與100 ng HBV 在24 孔板中孵育6 h，然后去除病毒。同時，活化的CD4+T 細胞在96 孔平底板中每孔1×106個細胞感染40 ng HBV，在37 ℃下孵育3 h，然后去除病毒［4］。

2.6 CD8+T 細 胞 的 制 備［6］PBMCs（1×106～1.5×106）在共培養(yǎng)實驗前置于T75 燒瓶中解凍并接種在含有 50 μg/L 重組 IL-15 的 25 mlL R10 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在確認靶細胞感染后，使用EasySep Human CD8+T細胞分離試劑盒從1.25×107個PBMCs中分離CD8+T 細胞，產(chǎn)率為8%～16%。對于所有共培養(yǎng)測定，效應細胞用CellTrace Violet 染色，以將它們與靶細胞區(qū)分開來。將細胞在R10培養(yǎng)液中重懸至約2×109/L，并與CellTrace Viole（t5 mmol/L，重構試劑以1∶2 000 稀釋）在37 ℃下孵育5 min，然后將與培養(yǎng)液相等體積的冷FBS 加入細胞中淬滅反應。將細胞沉淀在R10 培養(yǎng)液中洗滌一次，并重懸至合適的濃度以進行測定。

2.7 CTL消除檢測 在96孔圓底低附著板中，效應細胞與未感染和感染的靶細胞以不同的效應與靶標比率（effector∶target，E∶T）共培養(yǎng)4 h 或48 h，并將細胞轉移到 96 孔 V 型底板，加入 100 μL 細胞解離緩沖液添加到每個樣品孔中，并在37 ℃下孵育10 min。在孵育的后半段，將96 孔V 型底板離心以沉淀細胞并吸出培養(yǎng)物上清液。將細胞解離緩沖液推到低附著板孔周圍以破壞任何剩余的細胞，然后轉移到96孔V 型底板中并與相應的細胞沉淀混合。將細胞離心，吸出上清液，巨噬細胞和CD4+T 細胞用抗CD14-APC/Cy7（用于巨噬細胞）或抗CD3-APC/Cy7（用于CD4+T 細胞）進行表面染色。此外還有抗CD4-APC用于受感染的靶細胞染色。在4 ℃下孵育20 min后，使用BD CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization Kit 對樣品進行洗滌、固定和透化，并使用抗HBc 抗體進行細胞內(nèi)染色。使用FACSCanto 流式細胞儀獲得流式數(shù)據(jù)，并使用FlowJo 10.6.0 軟件分析所有數(shù)據(jù)［6］。

2.8 識別檢測 在96 孔圓底低附著板中，效應細胞與未感染和感染的靶細胞在E∶T=2 和抗CD107a-AF488 存在下共培養(yǎng)4 h。使用BD CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization Kit 對樣品進行洗滌、固定和透化，然后使用抗TNF-α-BV711 對細胞進行細胞內(nèi)染色。使用帶有FACSDiva 軟件的FACSCanto 流式細胞儀獲取流式數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均使用FlowJo 10.6.0軟件進行分析。

2.9 流式細胞術分析 對于HBV 包膜的內(nèi)化動力學分析，未感染或HBV 感染的巨噬細胞用細胞解離緩沖液收獲，在37 ℃下孵育10 min，計數(shù)，然后將約1×105～1.5×105個細胞在 R10 培養(yǎng)液中轉移到 4×96孔 V 型底板（0、10、30 和60 min 每個時點一個板）。在加入抗體之前，巨噬細胞樣品中加入50 μL FACS緩沖液，然后每個樣品中加入5 μL Human TruStain FcX 進行 Fc 封閉。Fc 封閉完成后，將細胞與 1 μmol/L 的 J3-AF647 在 50 μL FACS 緩沖液中反應 30 min，洗滌細胞，并將細胞重懸于50 μL FACS 緩沖液中，立即置于冰上（0 min）或在37 ℃下孵育10、30 或60 min 后轉移至冰上。對于每個時點，在冰上放置10 min 后，將抗CD33-BV421 添加到細胞中，在冰上孵育20 min。將細胞洗滌1次，固定并使用BD CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization Kit 進行透化，用抗HBc-FITC 對HBc 蛋白進行染色。在ImageStream X Mark II 成像流式細胞儀上從每個樣品中收集5 000 個細胞，并使用 IDEAS 6.2 軟件（Amnis）進行分析。單染巨噬細胞用于計算補償矩陣。使用內(nèi)化向?qū)в嬎鉎Bc 和HBV 包膜抗體染色的內(nèi)化分數(shù)，使用CD33染色作為表面探針。

2.10 免疫熒光分析 對于含有HBV 包膜的隔室的顯微鏡分析，在6 孔板中的無菌玻璃蓋玻片上操作。巨噬細胞在感染HBV 2～3 d 后，將含有巨噬細胞的蓋玻片轉移到新的6 孔板中，然后在1 mL R10培養(yǎng)液與200 nmol/L J3-AF647 中孵育1 h，并在室溫下固定在4%甲醛PBS（Thermo Scientific）中15 min，用 0.2% Triton X-100 透化 5 min，加入 5 滴 Image-IT FX Signal Enhancer 孵育30 min。然后在室溫下加入10%牛血清白蛋白，封閉1 h。巨噬細胞分別與抗EEA1（1∶100）、抗 LAMP1（1∶200）或抗 Siglec-1（1∶100）在3%牛血清白蛋白中孵育1 h，將細胞分別與抗兔 IgG-AF488（1∶250）和抗 HBc（1∶50）孵育 1 h。對于抗Siglec-1 的實驗，使用Zenon Alexa Fluor 488小鼠IgG1 標記試劑盒將抗體直接偶聯(lián)至Alexa Fluor 488，將細胞與抗Siglec-1 和抗HBc 抗體一起作用1 h，然后用 Hoechst 在 PBS 中以 1∶200 稀釋度染色 5 min。最后，使用ProLong Antifade Gold 將巨噬細胞置于顯微鏡載玻片上，邊緣用透明指甲油密封并干燥過夜。在Zeiss LSM 510 共聚焦顯微鏡上獲取圖像。使用Zen 2009 軟件和帶有EzColocalization 插件的ImageJ軟件進行圖像和共定位分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 進行配對或未配對t檢驗以確定實驗條件之間的統(tǒng)計學顯著性。每個實驗的顯著性區(qū)間在每個圖例中描述。用Pearson 相關分析評估 HBV 包膜與 HBc、EEA1、LAMP1 和 Siglec-1共定位的相關性。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差（mean±SD）。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HBV感染與肝臟巨噬細胞共定位

與健康對照組相比，在來自HBV 感染患者的肝臟樣本中觀察到HBc 和CD68 的共定位信號（圖1），證明肝臟巨噬細胞中存在HBV的蛋白。

2 HBV感染的巨噬細胞抵抗CD8+T細胞殺傷

Figure 1. The HBV protein co-localized with liver macrophages in liver biopsy tissues from HBV-infected patients.Scale bar=50 μm. Brown arrow：HBc；pink arrow：CD68.圖1 HBV 感染患者的肝活檢組織中HBV 蛋白與肝臟巨噬細胞共定位

將感染HBV 的CD4+T 細胞和巨噬細胞與CD8+T 細胞以 E∶T=2 共培養(yǎng) 4 h，結果顯示，消除的感染CD4+T 細胞數(shù)量較消除的感染巨噬細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），見圖2A、B。雖然在48 h共培養(yǎng)后自體CD8+T 對感染巨噬細胞的消除增強，但在多個E∶T比率中，靶細胞殺傷的差異仍然存在（P＜0.05），并隨著使用更多效應器而達到同等水平，見圖2C。因此，與感染HBV 的CD4+T細胞相比，感染HBV 的巨噬細胞更能抵抗CD8+T細胞的殺傷。

3 CD8+T細胞對HBV感染巨噬細胞的初始反應

CD8+T細胞在與受感染的CD4+T細胞和受感染的巨噬細胞短期共培養(yǎng)4 h 后表現(xiàn)出脫顆粒和TNF-α 產(chǎn)生（P＜0.01），見圖3A、B。對受感染巨噬細胞有反應的CD8+T細胞占優(yōu)勢群體表現(xiàn)出缺乏脫顆粒但有很強的TNF-α反應（P＜0.01），見圖3C。

4 HBV包膜可瞬時遞送到細胞內(nèi)隔室

通過J3 VHH 染色檢測HBV 包膜的表面定位，并在受感染的巨噬細胞表面檢測到HBV 包膜，隨后在37 ℃下孵育顯示HBV 包膜被遞送到細胞內(nèi)隔室中，見圖4A。雖然HBc 染色顯示內(nèi)化分數(shù)在60 min內(nèi)沒有顯著變化，但HBV 包膜在37 ℃下僅在10 min內(nèi)內(nèi)化，見圖4B。相對于HBV 包膜與HBc 共定位，HBV 包膜與Siglec-1共定位顯著降低，但仍顯著高于與EEA1或LAMP1共定位（P＜0.01），見圖4C、D。

討 論

巨噬細胞是HBV 感染的目標，HBV 被儲存在感染細胞內(nèi)長壽命的含病毒區(qū)室中，在抗病毒療法期間持續(xù)存在于組織中，并在HBV 感染的細胞病變效應中存活下來，以及可以通過細胞間傳播促進新的感染［8］。本研究證實了在肝臟巨噬細胞中存在HBV的蛋白。雖然CTL 可以識別這些受感染的目標，但它們的消除效率降低［9］。本研究結果表明，CD8+T細胞在殺死HBV 感染的巨噬細胞方面效率降低。此外，對受感染巨噬細胞有反應的CD8+T 細胞表現(xiàn)出很強的TNF-α 反應，這種機制可能反映了巨噬細胞在初次接觸CD8+T細胞時的抗原呈遞功能。

Figure 2. HBV-infected macrophages evaded the effective elimination mediated by CD8+ T cells. A：CD4+ T cells and macrophages infected with HBV were co-cultured with CD8+ T cells at different effector∶target（E∶T）ratios for 4 h and 48 h，and then the elimination of HBc+target cells was measured by flow cytometry；B：the summary data of E∶T=2.0 for 4 h；C：the summary data from 48 h co-cultivation with different E∶T ratios. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CD4+T cells.圖2 HBV感染的巨噬細胞逃避CD8+T細胞介導的有效消除

Figure 3. The initial response of CD8+ T cells to HBV-infected macrophages. A：CD8+ T cells were co-cultured with HBV-infected CD4+ T cells or macrophages at E∶T=2.0 for 4 h，and then flow cytometry analysis of CD107a and TNF-α production was performed；B：CD8+ T cell response to uninfected and infected targets（CD107a+TNF-α）；C：comparison of the response of CD8+T cells to infected CD4+T cells and macrophages（CD107a，TNF-α and CD107a+TNF-α）. Mean±SD. n=20.**P＜0.01 vs uninfected；##P＜0.01 vs CD4+T cells.圖3 CD8+T細胞對HBV感染巨噬細胞的初始反應

Figure 4. The HBV envelope was delivered instantaneously to the intracellular compartment. A：immunofluorescence staining to detect the kinetics of HBV envelope internalization on infected macrophages；B：internalization score of HBc+envelope+population during 60 min（n=6）；C：representative images of infected macrophages stained for HBc，envelope（J3 VHH）and compartment markers EEA1，LAMP1 or Siglec-1（blue：Hoechst/nuclei；scale bar=10 μm）；D：the correlation coefficient of co-localization of HBV envelope with HBc，EEA1，LAMP1 and Siglec-1（n=50）. Mean±SD.**P＜0.01 vs HBc；##P＜0.01 vs EEA1；△△P＜0.01 vs LAMP1.圖4 HBV包膜可被瞬時遞送到細胞內(nèi)隔室

CD8+T 細胞通過多種機制來殺死它們的目標［10］。穿孔素依賴性殺傷迅速，是第一道防線；然而，對于CD8+T 細胞不能立即殺死其靶標或CD8+T細胞進行連續(xù)殺傷的情況，殺傷模式可能會切換為通過 Fas 配體參與死亡受體［11］。CD8+T 細胞介導的對受感染巨噬細胞的殺傷需要48 h共培養(yǎng)，而4 h后已檢測到對受感染的CD4+T細胞的殺傷。與受感染的巨噬細胞相互作用時，脫粒不良和穿孔素/顆粒酶的釋放有限，可能會迫使CD8+T 細胞依賴死亡受體的參與來介導殺傷［12］。在解釋2 種不同類型靶細胞的消除測定數(shù)據(jù)時，還必須考慮細胞大小。巨噬細胞顯著大于CD4+T 細胞，但這是否導致需要釋放更多穿孔素/顆粒酶才能被殺死尚不清楚［13］。此外，巨噬細胞對CTL 介導的殺傷作用的抵抗力增強可能代表了一種機制，可以通過增加抗原呈遞細胞免受哨兵CTL 殺傷的存活率來保持抗原呈遞并誘導更有效的適應性免疫反應。此外，CD8+T 細胞對感染巨噬細胞的反應顯著偏向于產(chǎn)生TNF-α，而不是CD8+T細胞衍生的溶細胞內(nèi)容物的釋放，表明巨噬細胞殺傷可能是由死亡受體參與介導的，而不是穿孔素/顆粒酶的立即釋放。

目前，很少有數(shù)據(jù)表明HBV 可以被巨噬細胞內(nèi)化［14-15］。HBV 包膜被認為有助于抑制巨噬細胞反應［16］。在本研究中，對HBV 感染患者的肝活檢分析顯示HBc 和CD68 之間存在共定位。然而，如何將HBc 遞送至巨噬細胞的問題仍有待解決；它可能是通過特定受體或非特異性吞噬。此外，尚不清楚HBc 染色位于哪個亞細胞區(qū)室（例如溶酶體等細胞器）。本研究通過細胞內(nèi)染色HBc 和與駐留蛋白不同的細胞內(nèi)區(qū)室，確定了HBV 包膜被傳遞到含病毒區(qū)室，這與早期內(nèi)體和溶酶體不同。

總之，本研究結果支持感染HBV 的巨噬細胞抵抗CD8+T 細胞介導的殺傷作用，這可能與二者的相互作用使反應偏向于細胞因子的產(chǎn)生有關，導致低效清除受感染的巨噬細胞。此外，HBV 包膜被傳遞到細胞內(nèi)含病毒區(qū)室，進一步促進了HBV 感染的巨噬細胞能逃避CD8+T細胞的殺傷作用。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了消除受感染的巨噬細胞對HBV 治愈工作的重要性，并且深入理解所觀察到的對靶細胞殺傷和導致促炎細胞因子過度分泌的抗性的確切機制，對于開發(fā)能夠有效消除受感染巨噬細胞和抑制過度炎癥的方法是必要的。巨噬細胞殺傷不良的炎癥后果也可能對感染巨噬細胞的其他病原體（如結核病、基孔肯雅熱和腺病毒）產(chǎn)生影響。