針灸聯(lián)合藥物治療對腸易激綜合征大鼠腦-腸軸失衡的作用研究*

楊 敏， 鄒 燃， 鄧 薇， 徐派的， 李 悅

（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸科，湖北武漢430022）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種非常普遍的功能性腸胃道疾病，影響著10%～15%人群的健康，且一般藥物的治療效果甚微，對醫(yī)療費(fèi)用造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。研究表明IBS 與頭痛、慢性疼痛、糖尿病及失眠和嗜睡相關(guān)癥狀的患病幾率相關(guān)［3］。IBS 可分為 4 種亞型：腹瀉型、便秘型、混合型和不定型，其癥狀歸屬于中醫(yī)“腹痛”、“泄瀉”范疇［4］。IBS 的治療主要包括兩種：藥物治療和非藥物治療，藥物治療以緩解臨床癥狀為主，但無法根治此病，非藥物治療亦可緩解患者的臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，非藥物療法包括運(yùn)動療法、飲食療法和針灸療法等［5］。腦-腸軸是連接腸胃道系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，其參與了IBS 的發(fā)病機(jī)制［6］。相關(guān)研究結(jié)果顯示，以“天樞”、“內(nèi)關(guān)”穴進(jìn)行電針可明顯改善IBS 大鼠的結(jié)腸動力異常癥狀［7］。本研究采用取內(nèi)關(guān)、天樞和太沖穴位電針，聯(lián)合藥物治療IBS 大鼠，觀察療效，并探究針灸聯(lián)合藥物治療對IBS 大鼠多種腦腸肽含量的影響，以期為選擇IBS有效治療方法提供依據(jù)。

材料和方法

1 動物

48 只 6 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠，體重（235±15）g，購自遼寧長生生物有限公司（合格證號No.1107262011000418，設(shè)施使用證號No.00200090。飼養(yǎng)溫度為22～26 ℃，相對濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h。將大鼠分為對照組（n=9）和模型組（n=39），模型組構(gòu)建IBS 模型，每組隨機(jī)選擇3 只大鼠用于鑒定模型是否構(gòu)建成功。

2 藥物與試劑

蒙脫石散（山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20093638）；氟哌噻噸美利曲辛片（重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20153122）；戊巴比妥鈉（Sigmamerck）；三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS；Sigma）；大鼠5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）ELISA 試劑盒、大鼠神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）ELISA 試劑盒和大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測試盒（南京建成生物工程研究所）；RIPA 裂解液（Gelatins）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（金客隆生物技術(shù)有限公司）；PVDF 膜（Doclab）；化學(xué)發(fā)光試劑（Rongbai）；5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（serotonin transporter，SERT）抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司）；5-羥色胺受體4（5-HT receptor 4，5-HTR4）抗體（CST）。

3 方法

3.1 IBS 模型構(gòu)建 采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將細(xì)塑料導(dǎo)管從大鼠肛門處導(dǎo)入至降結(jié)腸，大鼠頭部向下垂直放置，于1 min 內(nèi)緩慢灌注50 mg TNBS，灌注1 min 后將導(dǎo)管緩慢取出。對照組大鼠以相同的方法給予等體積的生理鹽水灌注，均在1周后進(jìn)行模型鑒定［8］。

3.2 模型鑒定 采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取結(jié)腸組織，觀察結(jié)腸潰瘍和炎癥情況。采用5-HT ELISA 試劑盒和MPO 測試盒分別檢測大鼠結(jié)腸組織中5-HT濃度和MPO 活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

3.3 分組治療 將IBS 造模成功的36 只大鼠隨機(jī)分為6 組：模型（model）組、藥物A（drug A）組（25 mg·kg-1·d-1蒙脫石散）、針灸（acupuncture）組、藥物A+針灸組、藥物 A+藥物 B 組（25 mg·kg-1·d-1蒙脫石散+0.056 mg·kg-1·d-1氟哌噻噸美利曲辛片）和藥物A+藥物B+針灸組，每組6 只；剩余6 只正常大鼠為對照（control）組。藥物A組：給予大鼠25 mg·kg-1·d-1蒙脫石散灌胃，每天1次，連續(xù)治療2周，藥物劑量根據(jù)人臨床用藥量換算成大鼠用藥劑量［9］。針灸組：將大鼠捆綁后，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位，取大鼠內(nèi)關(guān)、天樞、太沖穴位，每穴斜刺0.7 mm，穴位旁開5 mm 平刺，接電針（參數(shù)：疏密波，頻率2～100 Hz，強(qiáng)度 0.1～0.2 mA）［10］，每天 1 次，每次 20 min，連續(xù)治療2 周。藥物A+針灸組：給予大鼠25 mg·kg-1·d-1蒙脫石散灌胃，并以內(nèi)關(guān)、天樞、太沖穴位電針，每天1次，連續(xù)治療2周。藥物A+藥物B組：給予 大 鼠 25 mg·kg-1·d-1蒙 脫 石 散 灌 胃 和 0.056 mg·kg-1·d-1氟哌噻噸美利曲辛片灌胃，每天1 次，連續(xù)2周，藥物劑量根據(jù)人臨床用藥量換算成大鼠用藥劑量［11］。藥物A+藥物B+針灸組：給予大鼠25 mg·kg-1·d-1蒙脫石散灌胃和 0.056 mg·kg-1·d-1氟哌噻噸美利曲辛片灌胃，并以內(nèi)關(guān)、天樞、太沖穴位電針，每天1次，連續(xù)治療2 周。對照組和模型組大鼠均灌胃生理鹽水，每天1次，連續(xù)2周。治療結(jié)束后，進(jìn)行腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reaction，AWR）評分檢測。采用100 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠致死，收集大鼠腦和結(jié)腸組織，保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 AWR 評分檢測 在PTCA 導(dǎo)管前段套上高順應(yīng)性的橡膠球囊，從肛門插入至距離肛口6 cm 處。通過給球囊充氣加壓，初始內(nèi)壓為20 mmHg，壓力遞增至80 mmHg，每個(gè)壓力觀察20 s，期間休息5 min。根據(jù)大鼠腹部回縮反射進(jìn)行AWR 評分［12］：結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)大鼠無反應(yīng)計(jì)為0 分；結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)大鼠身體靜止不動，頭部偶有扭動計(jì)為1 分；結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)腹部肌肉收縮，但未抬離桌面計(jì)為2 分；結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)腹部肌肉收縮并抬離桌面計(jì)為3 分；結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)腹部高離桌面，身體呈弓形計(jì)為4分。

3.5 甲苯胺藍(lán)染色 收集各組大鼠結(jié)腸組織，浸蠟包埋，制成切片，脫蠟至水后，在切片上滴加甲苯胺藍(lán)染色液，染色5 min。洗去染色液，加入1%冰醋酸分化，水洗終止反應(yīng)。加入二甲苯逐級透明切片，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察切片組織中肥大細(xì)胞染色結(jié)果并拍照，細(xì)胞核染色呈淺藍(lán)色，肥大細(xì)胞染色呈紫紅色。

3.6 ELISA 檢測 收集各組大鼠結(jié)腸組織，剪碎組織塊，勻漿取上清液。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，檢測各組大鼠結(jié)腸組織中NPY、CGRP、SERT、CHR和5-HTR4濃度。

3.7 Western blot 檢測 收集各組大鼠腦組織，取20 mg 組織加入200 μL 裂解液，勻漿直至完全裂解，提取組織蛋白質(zhì)。BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE 分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。Ⅰ抗和膜室溫孵育1 h，洗膜，加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h。洗膜，加入化學(xué)發(fā)光試劑，將膜置于分析儀中檢測，讀取蛋白條帶灰度值。各Ⅰ抗稀釋比均為1∶1 000。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用SPSS 23.0 進(jìn)行單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IBS模型鑒定

對照組大鼠結(jié)腸組織外觀正常，肉眼未見潰瘍與炎癥部位；模型組大鼠結(jié)腸組織有多處潰瘍與炎癥部位。與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中5-HT 濃度顯著升高（P＜0.05），MPO 活性也顯著升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. IBS model identification. A：concentration of 5-HT in colon tissue of rats；B：activity of MPO in colon tissue of rats. Mean±SD. n=9.#P＜0.05 vs control group.圖1 IBS模型鑒定

2 各組大鼠AWR評分比較

與對照組比較，模型組大鼠AWR 評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組大鼠AWR 評分顯著降低（P＜0.05），見圖2。

3 各組大鼠結(jié)腸組織肥大細(xì)胞觀察結(jié)果

模型組大鼠結(jié)腸組織中出現(xiàn)大量呈紫紅色的肥大細(xì)胞；比對照組大鼠結(jié)腸組織中肥大細(xì)胞多，經(jīng)過針灸治療后的大鼠結(jié)腸組織中肥大細(xì)胞少于模型組。經(jīng)過蒙脫石散（藥物A）和針灸治療后，相較于單獨(dú)的蒙脫石散或針灸治療組，肥大細(xì)胞減少，而經(jīng)過蒙脫石散（藥物A）、氟哌噻噸美利曲辛片（藥物B）和針灸聯(lián)合治療后的大鼠結(jié)腸組織中所檢測出的肥大細(xì)胞更少，見圖3。

4 各組大鼠結(jié)腸組織中SERT、5-HTR4、CHR、NPY和CGRP濃度比較

Figure 2. AWR score. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs drug A group；▲P＜0.05 vs drug A+drug B group.圖2 AWR評分

與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中NPY 和SERT 濃度顯著降低（P＜0.05），CGRP、5-HTR4 和CHR 的濃度顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠結(jié)腸組織中NPY 和SERT 濃度顯著升高（P＜0.05），而CGRP、5-HTR4 和CRH 濃度顯著降低（P＜0.05），且蒙脫石散（藥物A）、氟哌噻噸美利曲辛片（藥物B）和針灸聯(lián)合治療組大鼠結(jié)腸組織中NPY和SERT 濃度進(jìn)一步升高（P＜0.05），CGRP、5-HTR4和CRH濃度進(jìn)一步降低（P＜0.05），見圖4。

5 各組大鼠腦組織中SERT、5-HTR4、CHR、NPY和CGRP蛋白表達(dá)水平比較

與對照組比較，模型組大鼠腦組織中NPY 和SERT 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），CGRP、5-HTR4 和CRH 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠腦組織中NPY和SERT蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），CGRP、5-HTR4 和CRH 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），且蒙脫石散（藥物A）、氟哌噻噸美利曲辛片（藥物B）和針灸聯(lián)合治療組效果更顯著（P＜0.05），見圖5。

討 論

腦-腸軸學(xué)說在腸胃疾病發(fā)病機(jī)制中受到的關(guān)注越來越多，研究顯示，腦-腸軸神經(jīng)免疫內(nèi)分泌功能紊亂在IBS發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，而電針治療可使IBS 大鼠腦-腸軸神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)到平衡水平［13］。5-HT 是一種激素和神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)節(jié)神經(jīng)活動以及心血管功能、腸道運(yùn)動和血小板聚集等多種生理過程［14］。臨床數(shù)據(jù)顯示，IBS 患者的血漿 5-HT 水平顯著高于健康者［15］，且 5-HT 水平與 IBS 患者腹部癥狀評分呈正相關(guān)，提示5-HT 含量異常可能參與了IBS患者臨床癥狀的發(fā)生［16］。研究顯示TNBS誘導(dǎo)的IBS 大鼠模型的內(nèi)臟敏感性和MPO 含量增加，提示IBS 模型構(gòu)建成功［17］。本研究亦采用 TNBS 誘導(dǎo) IBS模型大鼠，顯示大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)潰瘍和炎癥損傷現(xiàn)象，且5-HT 濃度和MPO 活性均顯著升高，提示本研究成功獲得IBS大鼠模型。

Figure 3. Toluidine blue staining was used to observe mast cells in rat colon tissues（scale bar=50 μm）. More mast cells in the colon tissues of model group than control group were observed，fewer mast cells in the colon tissues were found after acupuncture or drug treatment，and even fewer mast cells were detected in the colon tissues after combined treatment with drug A+drug B+acupuncture.圖3 甲苯胺藍(lán)染色觀察大鼠結(jié)腸組織中的肥大細(xì)胞

Figure 4. Comparison of CGRP（A），NPY（B），5-HTR4（C），SERT（D）and CRH（E）concentrations in colonic tissues of rats in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs drug A group；▲P＜0.05 vs drug A+drug B group.圖4 各組大鼠結(jié)腸組織中SERT、5-HTR4、CRH、NPY和CGRP濃度比較

針灸是中醫(yī)學(xué)的重要組成部分，相較于西藥、中藥治療，具有操作簡單、耗費(fèi)低、療效確切和無毒副作用等優(yōu)勢［18］。陰陽平衡理論是中醫(yī)基礎(chǔ)理論體系的重要支柱，針灸治療疾病在于調(diào)和機(jī)體陰陽，通過刺激穴位、經(jīng)絡(luò)以激發(fā)經(jīng)氣、扶正祛邪，從而促進(jìn)機(jī)體發(fā)展為陰陽平衡的狀態(tài)［19］。近年來諸多研究證實(shí)針灸治療IBS 具有顯著的療效，本研究取IBS 大鼠天樞、內(nèi)關(guān)和太沖穴電針，天樞為足陽明經(jīng)要穴、大腸募穴，是臟腑經(jīng)氣輸注和匯聚于胸腹部的腧穴，有理氣調(diào)中，健脾和胃功效；內(nèi)關(guān)為手厥陰經(jīng)絡(luò)穴，八脈交會穴，通于陰維脈，主治胃、心、胸疾病，有益心安神、理氣和胃之功；太沖為足厥陰經(jīng)輸穴，可清熱平肝，暢達(dá)氣機(jī)。諸穴合用，可使脾陽得助，升清降濁，胃腸氣機(jī)調(diào)暢，泄瀉乃止；結(jié)果顯示針灸治療能夠改善IBS 大鼠的腦-腸軸失衡，進(jìn)一步證明針灸對治療IBS具有一定的作用。

肥大細(xì)胞在導(dǎo)致腦-腸軸功能紊亂中起著重要作用，肥大細(xì)胞浸潤與介質(zhì)釋放與IBS發(fā)病機(jī)制有關(guān)［20］，本研究也在IBS 大鼠的結(jié)腸組織中顯示了大量的肥大細(xì)胞，且經(jīng)針灸和藥物治療后，肥大細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。NPY、CGRP 和5-HT 等多種腦腸肽構(gòu)成了腦-腸軸中各通路作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，腦腸肽通過腸胃神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸胃道效應(yīng)細(xì)胞三者間的信息傳遞發(fā)揮調(diào)節(jié)腸胃道的作用，而調(diào)節(jié)腦腸互動功能就是針灸治療腸胃疾病的關(guān)鍵性效應(yīng)機(jī)制［21］。我們檢測了大鼠腦腸肽的含量，顯示針灸與蒙脫石散、氟哌噻噸美利曲辛片單獨(dú)或聯(lián)合使用均能降低結(jié)腸組織中CGRP 的濃度及腦組織中5-HTR4 的表達(dá)，升高結(jié)腸組織中NPY的濃度，且針灸聯(lián)合藥物治療的效果優(yōu)于單獨(dú)作用效果，表明針灸和兩種藥物對IBS大鼠腦-腸軸失衡具有調(diào)節(jié)作用。孫羽中等［22］研究顯示IBS大鼠經(jīng)過治療后，腦組織中SERT的含量升高，認(rèn)為升高SERT會再攝取大量的5-HT，從而維持機(jī)體5-HT 含量的正常水平，進(jìn)而改善IBS 大鼠的癥狀。5-HT與其受體結(jié)合，可發(fā)揮收縮腸道的作用，進(jìn)而參與IBS患者腹痛癥狀的發(fā)生［16］。本研究也同樣顯示經(jīng)針灸和藥物治療后的IBS大鼠腦組織中的SERT含量顯著升高，表明針灸和藥物治療能減輕IBS癥狀。

綜上所述，針灸聯(lián)合蒙脫石散和氟哌噻噸美利曲辛片治療IBS大鼠，可有效改善大鼠腦-腸軸失衡，調(diào)節(jié)大鼠腦腸肽含量，減少肥大細(xì)胞浸潤結(jié)腸組織。

Figure 5. Western blot was used to detect the expression of SERT，5-HTR4，CRH，NPY and CGRP in rat brain tissues. Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs drug A group；▲P＜0.05 vs drug A+drug B group.圖5 Western blot檢測大鼠腦組織中SERT、5-HTR4、CRH、NPY和CGRP蛋白表達(dá)水平