PM2.5對AECOPD和ACO患者血清作用的肺泡巨噬細胞炎癥的影響及其機制*

王曉彤 ， 袁關利， 王 正， 武思羽， 周廣偉 ， 劉新秀，李 靜， 閻錫新， 孟愛宏△

（1河北醫科大學第二醫院北院區呼吸與危重癥醫學科，河北石家莊050004；2河北醫科大學，河北石家莊050011；3秦皇島市第一醫院，河北秦皇島066099；4河北醫科大學第二醫院呼吸與危重癥醫學一科，河北石家莊050004）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡稱慢阻肺，是隨時間進展進行性加重的氣道炎癥疾病，同時患COPD 及哮喘這兩種病稱為哮喘-慢阻肺重疊（asthma-COPD overlap，ACO）。細顆粒物（particulate matter，PM）是空氣污染物的重要成分，PM2.5 的長期有害刺激可導致慢性炎癥反應，會損壞肺內正常的修復和防御機制，引起肺泡巨噬細胞等被激活，放大氣道內炎癥反應，損傷肺組織，造成疾病加重［1］。沉默信息調節因子2相關酶 1（silent information regulator 2-related enzymes 1，SIRT1）是III 型蛋白去乙酰化酶，是一種參與調節細胞衰老和炎癥的蛋白。有研究顯示，SIRT1 參與PM 誘導的氣道炎癥病［2］，NF-κB 是 SIRT1 的底物之一，SIRT1 的激活可抑制 NF-κB 的活性，從而減少NF-κB 轉錄誘導的凋亡［3］。但 PM2.5 與 SIRT1/NF-κB信號通路的作用關系尚不清楚。

本研究利用AECOPD和ACO患者血清刺激小鼠肺泡巨噬細胞（MH-S 細胞），建立局部炎癥體外模型，用PM2.5刺激炎癥體外模型，探討PM2.5刺激對AECOPD 及ACO 血清孵育的巨噬細胞的影響。并進一步應用SIRT1 激活劑SRT2104 及SIRT1 特異性抑制劑 EX527 作用 MH-S 細胞，檢測 SIRT1 和 NF-κB P65、p-P65、IκB 和 p-IκB 的蛋白水平及白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和 IL-10 含 量 的 變 化 ，探 究PM2.5 致巨噬細胞炎癥與SIRT1/NF-κB 信號通路的關系。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 永生化小鼠肺泡巨噬細胞株MH-S細胞購自ATCC，由實驗室常規傳代培養。

1.2 主要材料與試劑 AECOPD 及ACO 患者血清取自河北醫科大學第二醫院北院區呼吸與危重癥醫學科住院患者。一般資料比較見表1。PM2.5 由河北醫科大學第二醫院呼吸與危重癥一科贈送。IL-6和IL-10 ELISA 試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；CCK-8 細胞活力檢測試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司；兔抗小鼠P65、p-P65、IκB、p-IκB 和 SIRT1 多克隆抗體均購自 Cell Signaling Technology；SRT2104 及EX527 購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器 Mk3 全自動酶標儀（ThermoLabsystems）；共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG）；TLL-C 臺式高速冷凍離心機（北京四環科學儀器廠）；電泳儀（北京六一儀器廠）；Gene Company Limited掃描儀。

2 實驗方法

2.1 PM2.5 懸液的制備 收集石家莊地區2019 年11月～2020年2月霧霾，收集結束后將載有PM2.5的濾膜剪成碎片并浸入蒸餾水中，利用超聲震蕩器反復震蕩，三層無菌紗布過濾，濾液12 000 r/min、4 ℃離心20 min，去上清，干燥，待用。臨用前稱取5 mg PM2.5，溶于1 mL DMSO 液配成5 g/L 顆粒物懸液，使用0.22 μm濾器過濾除菌，-20 ℃保存待用。

表1 AECOPD患者及ACO患者的一般資料比較Table 1. Comparison of general data between AECOPD patients and ACO patients（Mean±SD. n=12）

2.2 細胞的培養及收獲 常規培養MH-S 細胞，瓶中加入配制好的培養基4 mL，將培養瓶放置在含5%CO2的37 ℃培養箱中培養。觀察MH-S 細胞生長情況，當單層細胞處于對數生長期時，進行相關實驗。

2.3 CCK-8 法檢測細胞活力 本課題組前期已測定PM2.5 的刺激濃度為100 mg/L，血清的最適刺激濃度為1%，依此濃度進行實驗［4］。CCK-8 檢測確定PM2.5 及 AECOPD 和 ACO 患者血清刺激后 MH-S 細胞存活率大于80%的作用時間。取對數生長期的MH-S 細胞，調整細胞濃度為 4×107/L，接種至 96 孔板，每孔100 μL，培養過夜，按對照組、PM2.5組、AECOPD 組（1% AECOPD 患者血清處理）、ACO 組（1%ACO 患者血清處理）、PM2.5+AECOPD 組和PM2.5+ACO 組進行分組干預，干預時間為6、9、12 h。干預完成后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液。繼續培養2 h，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度（A）度，進行細胞活力計算。

2.4 ELISA 檢測細胞上清液中IL-6 和IL-10 的濃度 調整細胞濃度為2.5×108/L，培養過夜。實驗分為6 組：（1）對照（control）組：加入與實驗組等量的RPMI-1640 培養基；（2）PM2.5 組：加入 RPMI-1640培養基及PM2.5（終濃度為100 mg/L）；（3）AECOPD組：加入RPMI-1640 培養基、AECOPD 患者血清（終濃度為 1%）；（4）ACO 組：加入 RPMI-1640 培養基、ACO 患者血清（終濃度為1%）；（5）PM2.5+AECOPD組：加入 RPMI-1640 培養基、1% AECOPD 患者血清及PM2.5（終濃度為 100 mg/L）；（6）PM2.5+ACO 組：加入RPMI-1640 培養基、1%ACO 患者血清及PM2.5（終濃度為100 mg/L）。按上述分組方法進行干預，干預時間為6 h。干預完成后收集細胞上清液，利用IL-6 和 IL-10 ELISA 檢測試劑盒檢測 IL-6、IL-10 的濃度，實驗嚴格按照說明書進行操作。

2.5 Western blot檢測 SIRT1、P65、p-P65和IκB和p-IκB的蛋白水平 調整細胞濃度至1×109/L，于6孔板培養過夜，本實驗分為4 組：（1）對照組：加入與實驗組等量的RPMI-1640 培養基；（2）PM2.5 組：培養基中加入PM2.5，使其終濃度為100 mg/L；（3）PM2.5+SRT2104 組：培養基中加入SRT2104（3 μmol/L，提前12 h 加入）和 PM2.5（終濃度為 100 mg/L）；（4）PM2.5+EX527 組：培養基中加入 EX527（3 μmol/L，提前12 h 加入）和PM2.5（終濃度為 100 mg/L）。按上述方法分組干預12 h。干預完成后收集細胞及細胞上清液。細胞內加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min 后離心提取蛋白質，BCA 試劑盒進行蛋白質定量，經SDS-PAGE，轉膜、封閉、抗體孵育后進行條帶掃描，灰度量化分析。細胞上清液IL-6 和IL-10 檢測方法同前。

3 統計學處理

應用SPSS 26.0 軟件將測出的數據進行統計學分析，所有統計指標均進行正態性檢驗，結果以均數±標準差（mean±SD）表示。兩樣本比較采用t檢驗；多組間比較行單因素方差分析并運用SNK-q檢驗進行組間兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 CCK-8法測定MH-S細胞活力的結果

PM2.5 刺激 MH-S 細胞 6、9 和 12 h，細胞存活率分別為（89.86±10.22）%、（87.8±4.87）%和（82.32±6.42）%；1% AECOPD 患者血清刺激 MH-S 細胞 6、9和 12 h，細 胞 存 活 率 分 別 為（86.99±4.89）% 、（71.38±5.87）%和（58.91±13.46）%；而 1% ACO 患者血清刺激 MH-S 細胞 6、9 和 12 h，細胞的存活率分別為（83.26±10.26）%、（68.43±5.72）%和（46.58±6.78）%。刺激時長為6 h 時，細胞存活率均大于80%，且細胞存活率無統計學差異。

2 AECOPD 和 ACO 患者血清及 PM2.5 刺激 MHS細胞后IL-6和IL-10的變化情況

與對照組相比，PM2.5 組、AECOPD 組、ACO 組、PM2.5+AECOPD 組和PM2.5+ACO 組細胞上清中的IL-6 濃度均升高、IL-10 濃度均降低。ACO 組較AECOPD 組 IL-6 升高、IL-10 降低更明顯（P＜0.05），與PM2.5+AECOPD 組相比，PM2.5+ACO組IL-6升高更明顯（P＜0.05），IL-10的變化不明顯，見表2。

表2 AECOPD 和 ACO 患者血清及 PM2.5 刺激 MH-S 細胞后細胞上清中IL-6和IL-10的變化Table 2. Changes of IL-6 and IL-10 in supernatant MH-S cells stimulated with PM2.5 and serum of AECOPD and ACO patients（ng/L. Mean±SD. n=12）

3 PM2.5致巨噬細胞炎癥與SIRT1/NF-κB的關系

PM2.5刺激細胞12 h后，SIRT1的表達減少，IκB和p-IκB 的蛋白水平減少，p-P65 的蛋白水平增加（P＜0.05），加入 SIRT1 激活劑 SRT2104 后，SIRT1 表達增加，p-P65 蛋白水平降低，IL-6 濃度降低和 IL-10 升高（P＜0.05）；加入SIRT1 抑制劑EX527，SIRT1 的表達減少，p-P65的蛋白水平增加，IL-6濃度升高，IL-10濃度降低（P＜0.05），見圖1、表3。

討 論

COPD 與ACO 均是呼吸系統的慢性氣道炎癥疾病，PM2.5 暴露可以增加炎性細胞的數量及炎癥因子的表達，與慢性氣道炎癥疾病的發病相關，深入研究PM2.5 對AECOPD 和ACO 患者局部炎癥的影響對揭示疾病發生機制尤為重要。

本實驗通過檢測IL-6 的表達發現，單純PM2.5刺激即可導致 IL-6 的表達增加，這與 Li 等［5］研究一致。而利用AECOPD 和ACO 患者血清與PM2.5 共同刺激MH-S 細胞，IL-6 的表達增加更為明顯，可見PM2.5可以進一步加重AECOPD 及ACO患者的局部炎癥反應，促進炎癥介質的大量釋放。通過AECOPD組與ACO 組比較發現，同時加或不加入PM2.5刺激，ACO 組IL-6的表達水平均高于AECOPD 組，由此可認為ACO患者的局部炎癥反應較AECOPD更為明顯。Ghosh 等［6］也做了相似的研究發現，與哮喘和AECOPD 相 比 ，IL-1β、IL-17E、GM-CSF、IL-18、NGAL、IL-5、IL-10、MCP-1、YKL-40、IFN-γ、IL-6 和TGF-β 等13 種免疫介質在ACO 中均有明顯表達。這些標志物相互之間以及與肺功能參數之間具有顯著的相關性。

本實驗檢測不同組別IL-10 的表達發現，PM2.5組IL-10 的表達較對照組明顯下降，但AECOPD 組和ACO 組的表達與對照組相比差異無統計學顯著性，說明PM2.5 刺激對巨噬細胞的作用更明顯，徐佳莉等［7］的研究也有類似的發現。而PM2.5+ACO 組和PM2.5+AECOPD 組表達量較PM2.5 組明顯減低，可見單獨血清刺激對巨噬細胞無明顯作用，但血清聯合PM2.5刺激可顯著影響IL-10的表達。綜上所述，PM2.5 作為大氣污染物，可以誘導巨噬細胞M1 炎癥表型增加，增加IL-6 的水平，而M2 表型減少，降低IL-10 的水平。PM2.5 對小鼠肺泡巨噬細胞極化為炎癥表型和引發肺部炎癥有相當大的影響［8］。

SIRT1 是一種依賴NAD+的脫乙酰酶，它通過組蛋白脫乙酰化調節基因表達，在多種疾病的病理、進展和治療中起著復雜的作用。有實驗發現，PM2.5暴露可顯著降低體內外SIRT1 的蛋白水平，加重呼吸氧化損傷［9-10］。NF-κB 是機體中重要的細胞轉錄因子，在靜息條件下，NF-κB 和 IκB 蛋白形成一個復雜的三聚體，以不活躍的形式存在于細胞質中。在受到各種刺激之后，IκB 激酶介導可使 IκB 蛋白磷酸化和泛素化，導致其隨后的降解和NF-κB 的核易位，從而觸發相應靶基因的轉錄［11］。在PM2.5 的刺激下，NF-κB 信號通路可被誘導激活，加重炎癥反應，引起呼吸系統損傷［12-13］。SIRT1 可以直接或間接抑制NF-κB信號通路，NF-κB系統通過抑制SIRT1下游靶點來抑制SIRT1 介導的功能。本實驗利用PM2.5刺激 MH-S 細胞發現，IκB、p-IκB 和 SIRT1 的蛋白水平減少，p-P65 的蛋白水平高于對照組，說明NF-κB被活化上調，SIRT1和NF-κB均參與了PM2.5致巨噬細胞炎癥的過程。

SRT2104 是一種新型SIRT1 激活劑，可以減輕PM2.5 誘導的 M1 反應，此外，SRT2104 可以降低肺氣腫的病理特征，改善肺功能參數，對暴露于香煙煙霧和氣管內脂多糖灌注所致的肺氣腫大鼠體內AECII 細胞凋亡具有抑制作用［14］。本實驗研究了SRT2104 對 PM2.5 刺激的 MH-S 細胞的作用發現，加入SRT2104后，SIRT1、IκB 的蛋白水平較單獨PM2.5刺激時增加，p-P65 則降低，可見SRT2104 可能通過上調SIRT1，抑制了NF-κB的活化。本研究結果與部分學者的研究結果一致［15-16］。EX527 是 SIRT1 的抑制劑，為了進一步驗證PM2.5 的致炎作用與SIRT1/NF-κB 的關系，本研究利用 PM2.5 與 EX527 共同刺激 MH-S 細胞，與 PM2.5 組相比，SIRT1 的表達較單獨PM2.5 刺激組下降，p-P65 的水平升高，抑制SIRT1 的表達可以進一步增強NF-κB 的活化。檢測各組 IL-6 和 IL-10 的濃度發現，PM2.5+SRT2104 組IL-6 的濃度較 PM2.5 組明顯下降，PM2.5+EX527 組IL-6的濃度明顯升高，可見激活SIRT1可減輕促炎因子IL-6 的釋放，抑制SIRT1 的表達可加重PM2.5 刺激的促炎因子IL-6 的釋放。同時，PM2.5 組、PM2.5+SRT2104 組、PM2.5+EX527 組 IL-10 的濃度較對照組均明顯下降，PM2.5+SRT2104組IL-10濃度較 PM2.5 組 增 加 ，PM2.5+EX527 組 IL-10 濃 度 較PM2.5 組減少，可見PM2.5 的刺激可以抑制抑炎因子IL-10 的表達，加入SIRT1 激活劑可增加IL-10 的表達，加入SIRT1抑制劑后，IL-10的表達進一步被抑制。由此可以認為，SIRT1/NF-κB 通路是 PM2.5 致巨噬細胞炎癥的途徑之一，但其內部的分子機制仍需進一步深入研究來闡明。

Figure 1. Comparison of the protein levels in each group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PM2.5 group.圖1 各組蛋白表達差異的比較

表3 各組IL-6和IL-10的表達情況Table 3. Expression of IL-6 and IL-10 in each group（ng/L.Mean±SD. n=12）

綜上所述，本研究利用PM2.5建立了MH-S細胞的炎癥體外模型，利用SIRT1 特異性激活/抑制劑證實了SIRT1/NF-κB 在PM2.5 致巨噬細胞炎癥中的作用，本研究結果為說明PM2.5 致巨噬細胞炎癥的作用機制提供了證據，但本研究的不足之處在于只進行了細胞水平的體外研究，缺乏體內模型的驗證，需在今后的研究中進一步完善說明。