吳若豪?邱坤銀?唐文婷?何展文

【摘要】目的 報道1例由COL6A1基因嵌合突變所致的Bethlem肌病，并分析該突變的致病性。方法 應用全外顯子基因組測序法（trio-WES）對1例Bethlem肌病患兒及其父母進行基因測序，對檢出突變進行生物信息學預測，并以“Bethlem肌病”“COL6A1”（包括中英文）為檢索詞在PubMed、CNKI、中華醫學期刊全文數據庫（MedBook）檢索相關病例，在千人基因組數據庫、ExAC數據庫及ClinVar數據庫檢索患兒的基因突變。結果 經trio-WES檢測發現，患兒COL6A1基因第8外顯子存在1個c.868G > A （p.G290R）錯義突變（突變頻率為48.13%），該突變同時在其父親外周血中檢出，但突變頻率僅7.89%，考慮為嵌合突變（突變頻率<10%），屬于新發突變（PS2）;該突變導致的蛋白水平改變發生在甘氨酸位置，屬于COL6A1基因熱點區域突變（PM1）;同時該突變在正常人群突變頻率數據庫中均不存在（PM2）。經多種有害突變預測軟件預測結果均提示c.868G > A （p.G290R）為有害突變（PP2+PP3），根據美國醫學遺傳學與基因組學學會指南判定該新發錯義突變為致病性突變（PS2+PM1+PM2+PP2+PP3）。在數據庫檢索到6例COL6A1基因突變所致Bethlem肌病先證者，無存在嵌合突變者。結論 COL6A1基因c.868G >

A （p.G290R）為該患兒罹患Bethlem肌病的致病原因，該突變未曾被報道，這在一定程度上擴充了COL6A1基因的變異譜。

【關鍵詞】COL6A1基因;Bethlem肌病;嵌合突變;錯義突變

Identification of a novel chimeric mutation in the COL6A1 gene of a child with Bethlem myopathy： a case report and literature review Wu Ruohao， Qiu Kunyin， Tang Wenting， He Zhanwen. Department of Pediatrics， Sun Yat-sen Memorial Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120，China

Corresponding author， He Zhanwen， E-mail：? hezhanw@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To report one case of Bethlem myopathy caused by COL6A1 chimeric mutation and analyze the pathogenicity. Methods Trio-Whole Exome Sequencing （trio-WES） was conducted to detect the putative pathogenic mutations of the boy diagnosed with Bethlem myopathy and his parents. The impact of the detected mutations was predicted and validated by bioinformatics. Relevant cases were searched from PubMed， CNKI and MedBook databases using “Bethlem myopathy” and “COL6A1” as the keywords. The gene mutations of the affected child were searched from the mutation frequency databases of healthy population. Results A missense mutation of c.868G > A （p.G290R） in the exon 8 of COL6A1 gene was identified in the child and his father by trio-WES. However， the frequency of this mutation in his father was only 7.89%（<10%）， which was considered as chimeric mutation （de novo mutation） （PS2）. This mutation was glycine-related mutation， which was considered as hotspot variation in the COL6A1 gene （PM1）. However， this mutation was absent in major allele frequency databases （PM2）. The results of multiple pathogenic variant prediction software prompt that c.868G > A （p.G290R） is a pathogenic mutation （PP2+PP3）. According to the American College of Medical Genetics and Genomics （ACMG） variant classification guidelines， the variant of c.868G > A （p.G290R） in the COL6A1 gene in this child was classified as pathogenic mutation （PS2+PM1+PM2+PP2+PP3）. After literature review， six probands of Bethlem myopathy with COL6A1 variant were searched. However， Bethlem myopathy with COL6A1 chimeric variant has not been reported. Conclusion The chimeric mutation of c.868G > A （p.G290R） in the COL6A1 gene is the pathogenesis of Bethlem myopathy， which has not been reported. This case report expands the variation spectrum of COL6A1 gene.

【Key words】COL6A1 gene;? Bethlem myopathy;? Chimeric mutation;Missense mutation

Bethlem肌病（BM）是一種常染色體顯性遺傳性肌病，由COL6A1基因變異所致。2011年，B?nnemann[1]闡明該先天性疾病的臨床表現主要為近端肌無力、長手指屈肌、手肘及腳踝等關節攣縮。該病發病年齡不定，產前期可僅表現為胎兒運動減少;新生兒期可出現四肢肌張力減弱或斜頸;嬰幼兒期可出現運動發育遲滯、肌無力及關節攣縮;成年期多有較為明顯的近端肌無力及跟腱、長指屈肌攣縮。該病病程進展多較緩慢，但隨著時間推移，患者可逐步表現出起立困難及行走失控等喪失自理行為的癥狀。此外，B?nnemann[1] 還闡明了COL6A1基因為BM發病的致病基因，其遺傳模式為常染色體顯性遺傳，呈散發、非家族聚集性發病。BM是一種罕見先天性肌病，但隨著基因測序技術的發展，越來越多BM患者被確診，盡管如此，筆者卻發現突變類型為嵌合突變者鮮有報道。由于不同突變類型的BM患者在臨床表型上可能存在不同，因此報道罕見突變類型就提高國內醫師對BM的認識具有一定價值。本研究擬對1例通過臨床表型及基因診斷確診的存在COL6A1基因嵌合突變的BM男性患兒進行突變致病性及臨床表型的分析，并檢索國內外相關文獻及基因數據庫進行歸納總結[2]。

對象與方法

一、1例COL6A1基因嵌合突變的BM患兒臨床資料的收集

收集于2019年1月在中山大學孫逸仙紀念醫院就診的1例COL6A1基因嵌合突變的BM患兒的臨床資料，本研究已獲該院倫理委員會批準（批件號：SYSEC-KY-KS-2021-261）。

二、基因分析

1. 外周血染色體微陣列分析

抽取患兒靜脈血2 mL經CytoScan HD芯片（270萬拷貝數分析標記，包含195萬拷貝數探針，75萬SNP探針）檢測，按照Affymetrix CytoScan HD SNP Array微陣列芯片的標準操作流程進行操作和結果分析，并與OMIM、 DGV及DECIPHER等數據庫進行比對。

2.外周血染色體核型分析

抽取患兒靜脈血2 mL進行常規染色體G顯帶檢查，分析20個分裂相。

3.目標序列捕獲及高通量基因測序

抽取患兒及其雙親靜脈血各2 mL置于抗凝管中，經基因組DNA提取試劑盒提取全基因組DNA。用超聲震斷儀打斷DNA獲取長度在200～300 bp的DNA片段;構建測序文本庫，在Illumina MiSeq高通量測序平臺對靶基因序列進行捕獲，該測序panel覆蓋包括COL6A1基因在內的4000多種單基因遺傳病相關基因的全部外顯子及外顯子內含子交界區。

4.測序數據分析及篩選

對測序數據進行處理，過濾掉低質量（質量≥20）和低覆蓋度（深度≥10）SNP，應用CCDS、HGNC、dbSNP數據庫信息對過濾后SNP進行注釋，確定候選突變位點，排除人群頻率 > 1%的突變位點，結合患兒臨床表型確定疑似致病突變位點，同時在千人基因組數據庫、ExAC數據庫及ClinVar數據庫中進行比對，以進一步排除基因多態性[3]。

5.生物信息學分析

測序結果得到的堿基突變按den Dunnen and Antonarakis法則進行命名[4]。利用PolyPhen-2、Mutationtaster及PROVEAN軟件對突變進行功能預測;HomoloGene系統分析新發突變的氨基酸位點是否具有跨種屬保守性;BLAST系統分析突變影響的蛋白結構域。

三、文獻檢索

以“Bethlem肌病”（中英文）及“COL6A1”為檢索詞，對PubMed、CNKI、中華醫學期刊全文數據庫（MedBook）截至2021年10月收錄的論文進行檢索，收集并歸納總結具有完整先證者基因型及臨床表型描述的COL6A1突變所致BM病例。

結 果

一、1例COL6A1基因嵌合突變的BM患兒臨床資料

患兒男，6歲，因四肢肌無力伴蹲下后起立困難3年余于2019年1月在中山大學孫逸仙紀念醫院就診。患兒足月順產娩出，其母親系孕1產1，

孕產史無特殊，其父母臨床表型均正常，否認近親婚配。家庭成員中無類似遺傳病病史可循。患兒生后四肢肌張力低，活動少，自幼運動發育均較同齡兒落后，四肢肌肉松弛，以近端肌肉明顯。3歲開始出現下蹲后起立困難，癥狀隨年齡增大而加重，現可獨立行走，但行走時間不長，上樓梯費力明顯，需雙手扶膝休息。曾多次于當地醫院就診，予規律康復治療2年余上述癥狀未見明顯緩解。體格檢查：四肢肌力、肌張力均偏低，以近端肌群明顯，Gower征陽性，且存在脊柱強直，見圖1A、B;雙手腕關節、掌指關節出現攣縮、活動受限;右側膝關節皮膚存在瘢痕結節，見圖1C、D。實驗室檢查：外周血磷酸肌酸激酶121 U/L（正常）;CK-MB 28 U/L（稍高）;外周血肌紅蛋白21 μg/L

（明顯降低）;其余實驗室檢查包括血尿糞常規、內分泌激素及免疫學相關檢查等均未見異常。頭顱MRI、心臟彩色多普勒超聲檢查（彩超）及腹部B超等影像學檢查均未見明顯異常。患兒臨床表型符合先天性肌病可能，為明確診斷，抽取患兒及其父母外周血進行全外顯子基因組測序檢查，患兒父母表示同意并簽署知情同意書。經基因檢測后明確BM診斷，立即予患兒規律康復治療配合營養肌肉雞尾酒療法（維生素B1 500 mg/d，硫辛酸 600 mg/d，左卡尼汀 2000 mg/d，維生素E

300 mg/d，維生素C 500 mg/d，輔酶Q10 90 mg/d）治療，同時囑咐家屬予其低碳水化合物飲食，加強補充中長鏈脂肪酸，并保證充足蛋白質供給，定期隨訪復查。經上述規律治療1年半后患兒來我科復查，結果顯示四肢肌無力癥狀較前改善，四肢肌力、肌張力均較前提高，獨立行走時間較前增加，盡管上樓梯仍明顯費力，但扶膝休息次數明顯減少;雙手腕、掌指關節攣縮及右膝關節瘢痕結節仍持續存在。復查外周血磷酸肌酸激酶水平正常，為90 U/L;CK-MB恢復至正常水平，為19 U/L;外周血肌紅蛋白較前變化不大，仍為21 μg/L。

二、基因分析

1.基因變異檢測結果

患兒外周血染色體核型及染色體微陣列分析均無異常，而全外顯子基因組測序檢出患兒COL6A1基因第8外顯子存在c.868G > A （p.G290R）錯義突變（突變頻率48.13%）。該突變同時在其父親中有檢出，但突變頻率僅7.89%，小于10%，考慮為嵌合突變，可判定該突變在該家系為新發突變（de novo，PS2），見圖2。c.868G > A導致編碼的膠原蛋白Ⅵα1鏈第290位天冬甘氨酸（Gly， G）替換為精氨酸（Arg， R）。這一發生在甘氨酸（Gly）位置的錯義突變在COL6A1基因相關疾病的致病突變中占70%以上，屬于熱點變異區域（PM1）[4]。同時該突變在千人基因組數據庫、EXAC及ClinVar等數據庫均無收錄（PM2），屬于國內外未經報道的新發突變。

2.生物信息學分析結果

J?bsis等[5]闡明了COL6A1基因上較少存在良性突變，COL6A1基因上的新發錯義突變是造成BM的主要原因（PP2）。該基因第8外顯子c.868G > A突變導致其編碼蛋白第290位氨基酸替換，應用不同突變預測軟件對該突變進行有害性突變預測：其中PROVEN預測結果顯示為“deleterious （-5.502）”;MutationTaster預測結果顯示為“disease-causing （0.999）”;PolyPhen-2預測結果顯示為“probably damaging （HumDiv：1.000， HumVar：1.000）”，見圖3A。經HomoloGene系統對人類、黑猩猩、犬、牛、鼠、雞、蟾蜍及斑馬魚的膠原蛋白Ⅵα1鏈保守性分析發現該酶第290位G在無脊椎動物至脊椎動物乃至哺乳動物之間均高度保守，見圖3B，提示該位置上的氨基酸改變可能對編碼蛋白結構及功能有一定影響;進一步通過PubMed BLAST系統分析發現，該突變所致290位G替換為R可導致編碼蛋白中膠原蛋白超家族成員的重要二級結構單元Glycine-X-Y三聯體完整性發生改變，蛋白活性喪失（PP3），見圖3C。綜上所述，根據 2015年美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）序列變異解釋指南，COL6A1基因c.868G > A （p.G290R）被判定為致病性突變（PS2+PM1+PM2+PP2+PP3），可導致本例患兒罹患BM[6]。

三、文獻檢索結果

在國內數據庫共檢索到2例具有完整基因型及臨床表型描述的COL6A1突變所致BM的先證者[7-8]。而在國外數據庫共檢索到4例有完整基因型及臨床表型描述的COL6A1突變所致BM的先證者，其中存在嵌合突變者數量為0[9-12]。6例先證者臨床表型及基因型特點見表1。

討 論

COL6A1基因編碼的膠原蛋白Ⅵα1鏈是一種在維持細胞外基質結構和功能方面起著重要作用的細胞黏連蛋白亞鏈成分。膠原蛋白Ⅵ在人體多種組織如肌肉、皮膚以及軟骨中均明顯表達，可通過形成微纖維網絡結構來維持細胞外基質的結構和功能。膠原蛋白Ⅵ由不同的肽鏈（α1、α2和α3）組成，這3類肽鏈分別由COL6A1 、COL6A2 和COL6A3編碼合成。膠原蛋白Ⅵ為四聚體，共由12個亞基組成，其中10個亞基由α3肽鏈組成，而剩余2個亞基則分別由α1和α2肽鏈組成，因此當COL6A1基因發生突變時，其編碼的α1肽鏈結構完整性會被破壞，使得膠原蛋白Ⅵ亞基間無法正常連接形成單體，進而無法形成四聚體結構，最終導致膠原蛋白微纖維網絡形成障礙，細胞外基質結構和功能受損。COL6A1基因變異導致的相關疾病包括BM和Ullrich型先天性肌營養不良（UCMD）。Bertini等[13]認為與BM遺傳模式為常染色體顯性遺傳不同，UCMD呈常染色體隱性遺傳，雖然兩者臨床表現相似，均以近端肌無力合并關節攣縮為主要臨床特征，但UCMD臨床表型相對更重，且起病更早（多于出生前或出生后不久起病），預后也相對更差。本例患兒幼兒期起病，起病時間相對較晚，雖存在四肢近端肌無力和遠端關節攣縮，且肌酶輕度升高，但不存在呼吸肌麻痹等嚴重影響壽命預后的癥狀;結合患兒的遺傳特點及檢出的COL6A1基因突變致病等級，支持BM的診斷。

本例患兒檢出的突變c.868G > A （p.G290R）位于COL6A1基因第8外顯子，此突變可導致位于α1肽鏈N末端的重要的三螺旋結構域（Glycine-X-Y三聯體）中第290位的Gly被Arg所取代。Butterfield等[14]闡明由于α1、α2及α3肽鏈間均需通過Glycine-X-Y三聯體結構來相互連接形成單體，因此發生在Glycine-X-Y三聯體Gly位點的突變對膠原蛋白Ⅵ結構影響非常大，通常與較嚴重的BM表型有關。本例患兒除存在四肢肌無力及蹲下后起立困難外，還存在脊柱強直、關節攣縮以及瘢痕結節等癥狀，符合重型BM的臨床表型。另一方面，本例患兒父親亦檢出該COL6A1基因突變，但并無相應的癥狀體征，出現基因型與臨床表型不一致的原因主要有2點：一種可能即該突變在患兒父親身上發生外顯不全，因而無臨床表現;另一種可能為其父親檢出的突變屬于嵌合突變，即體細胞基因無該突變，只是生殖腺基因發生了該突變，故而無臨床癥狀。通過進一步檢測父親這一突變的發生頻率可發現嵌合突變可解釋本例患兒父親出現的情況，因此對于遺傳學分析中發現類似基因型與臨床表型不一致的情況，應進一步分析突變頻率作甄別與判斷。

綜上所述，本文報道了1例具有典型重型BM臨床特點的病例，通過分子生物學分析，不僅發現了1個未曾被報道的COL6A1致病突變，擴增了BM的基因變異譜，同時還發現了本例患兒COL6A1新發突變（de novo）來源于其父親生殖腺發生的突變，為該家系進行準確的遺傳咨詢提供了可能。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-06-16）

（本文編輯：洪悅民）