食用檳榔中菌落總數(shù)的測量不確定度評定

李意晴，袁 河，趙志友，張 艷

（湖南省檳榔加工與食用安全工程技術(shù)研究中心，湖南賓之郎食品科技有限公司，湖南湘潭 411100）

檳榔，別名仁頻、賓門、白檳榔、檳仁、洗瘴丹等，是一種棕櫚科檳榔屬常綠喬木的果實。檳榔果實有藥用作用，具有殺蟲、消積、下氣等功效，是中國四大南藥之首，檳榔的果皮、花和根都可入藥[1]。適當(dāng)嚼食檳榔可促進胃腸消化、增加食欲。據(jù)歷史記載，2 000多年前人們就開始咀嚼檳榔。根據(jù)相關(guān)文獻分析[2]，2016年世界檳榔年產(chǎn)量超過350萬t，其中印度產(chǎn)量第一，中國第二。中國的檳榔主要產(chǎn)自海南，據(jù)《海南統(tǒng)計年鑒2020》[3]，2019年海南省新栽種面積5 555 hm2，累計栽種面積115 171 hm2，共產(chǎn)檳榔287 043 t。在海南，檳榔已成為僅次于橡膠的第二大熱帶經(jīng)濟作物，年產(chǎn)值超過100億元[4]，消費人口超6 000萬人。與此同時，隨著檳榔的產(chǎn)量提高，以及消費人群和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，食用檳榔已經(jīng)從原來的手工作坊式發(fā)展到了工業(yè)化、自動化階段，行業(yè)總產(chǎn)值超過200億元[5]。

近年來，隨著行業(yè)的發(fā)展和法律法規(guī)的完善，檳榔的微生物控制情況越來越被重視，微生物的污染情況有了很大改善。檳榔行業(yè)越來越重視微生物檢測的可靠性和準確性。試驗依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[6]和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[7]，對測量檳榔中菌落總數(shù)的過程中產(chǎn)生的不確定度進行了分析評定，充分驗證檢測方法的合理性和檢測結(jié)果的準確性，為檳榔菌落總數(shù)檢測準確度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 測試樣品

食用檳榔樣品為賓之郎爆珠檳榔，湖南賓之郎食品科技有限公司提供。

1.1.2 設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱36±1℃、無菌操作臺、超純水機、高壓蒸汽滅菌鍋、拍擊式均質(zhì)器及均質(zhì)袋、旋渦混合器、冰箱、電子天平（感量0.1 g）、移液槍（5，1 mL）、無菌平皿（直徑90 mm）、無菌試管（18×180 mm）、恒溫水浴箱（室溫+5-100℃）、顯微鏡等。

1.1.3 試劑

氯化鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；平板計數(shù)瓊脂，杭州微生物試劑有限公司提供。

1.2 試驗方法

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》執(zhí)行。流程如下：

25 g樣品+225 mL無菌生理鹽水→10倍系列稀釋→平板計數(shù)瓊脂→36±1℃翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)48±2 h→計數(shù)→計算結(jié)果。

2 檳榔中菌落總數(shù)的測量不確定度來源分析及評定

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

菌落總數(shù)的計數(shù)方法，其中若只有一個稀釋梯度的平板上的菌落數(shù)在30～300 CFU/g，則按公式（1） 計算：

式中：N——樣品中菌落數(shù)；

A——符合條件的梯度中平板1的計數(shù)；

B——符合條件的梯度中平板2的計數(shù)；

d——稀釋因子（第一稀釋度）。

若有2個連續(xù)稀釋梯度的平板上菌落數(shù)為30～300 CFU/g，則按公式（2） 計算：

式中：∑C——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；

n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；

n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)。

2.2 不確定度來源

2.2.1 均勻性引入的不確定度

樣品的不均勻性是帶來不確定度的重要因素，按照GB 4789.1—2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗總則》的規(guī)定[8]，試驗的樣品均充分混合后隨機取樣。因此，可以認為樣品是均勻的，在此忽略由取樣的不均勻性所帶來的不確定性。

2.2.2 樣品稱量過程中引入的不確定度

單顆檳榔質(zhì)量較重，為了避免污染而不對其進行切片處理，由于稱質(zhì)量時難以精確到25.0 g。為了方便操作，取樣時允許取樣量在25.0±1.0 g之間。這屬于均勻分布，所以樣品稱量引入的不確定度為：

電子天平稱量引入的不確定度：試驗所用的電子天平檢定證書顯示最大量程為1 000 g，允許誤差為0.1 g。根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》的規(guī)定，由測量儀器最大允許誤差導(dǎo)致的不確定度，通常假設(shè)為均勻分布。因此，電子天平引入的標準不確定度為：

所以，樣品稱量引入的標準不確定度為：

其相對標準不確定度為：

2.2.3 樣液制備引入的不確定度

制備樣液：使用250 mL量筒量取225 mL生理鹽水，稱量25.0 g樣品，將兩者加入無菌均質(zhì)袋。根據(jù)JJG 196—2006《中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程常用玻璃量器》的規(guī)定[9]，20℃時，量出式量筒的容量允許誤差為2.0 mL，根據(jù)CNAS-GL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[10]，此項按三角分布處理：

樣液制備引入的相對標準不確定度為：

2.2.4 梯度稀釋過程中引入的不確定度

梯度稀釋指采用無菌吸頭，吸取不同稀釋級溶液，制備10倍系列稀釋液的過程。制備稀釋液時，使用1 mL無菌移液器移取1 mL的不同稀釋度溶液，用5 mL移液器制備9 mL無菌生理鹽水。根據(jù)JJG 646—2006《中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程移液器》的規(guī)定[11]，當(dāng)檢定點為1 000 μL時，1 mL移液器的容量允許誤差為±1.0%；當(dāng)檢定點為5 000 μL時，5 mL移液器的容量允許誤差為±0.6%，此處按0.6%計算。這里屬于B類評定，按照三角分布，取。試驗取3個稀釋度（10-1，10-2，10-3）進行試驗、計數(shù)。

吸取1 mL稀釋溶液和9 mL生理鹽水時引入的標準不確定度為：

相對標準不確定度：

試驗稀釋過程共進行了3次，稀釋過程引入的相對標準不確定度為：

2.2.5 加樣體積引入的相對標準不確定度

試驗使用3個梯度的樣液，分別用1 mL移液器取1 mL稀釋液接種于2個無菌平皿內(nèi)。其引入誤差有6次，1 mL移液器的允許誤差為1%。按三角分布，標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

2.2.6 重復(fù)性檢測引入的不確定度

因為微生物的生長繁殖是以幾何級數(shù)遞增的，所得數(shù)據(jù)的發(fā)散性較大，因此在評定菌落總數(shù)不確定度時，應(yīng)用貝塞爾公式計算檢測結(jié)果對數(shù)值的均值和殘差平方和，以便獲得重復(fù)性檢測的不確定度[12]。

菌落總數(shù)的檢測結(jié)果及數(shù)據(jù)計算見表1。

表1 菌落總數(shù)的檢測結(jié)果及數(shù)據(jù)計算

菌落總數(shù)計數(shù)的對數(shù)單次測量的標準偏差為：

對數(shù)單次測量的標準不確定度為：

相對標準不確定度：

2.3 不確定度評定

合成相對標準不確定度為：

合成標準不確定度為：

2.4 擴展不確定度

取置信水平P=95%，自由度γ=10-1=9，查t分布表[7]可知k=2.26。擴展不確定度為：

2.5 不確定度報告

根據(jù)上文得到的擴展不確定度，可以計算在置信水平95%的條件下，菌落總數(shù)計數(shù)值的對數(shù)平均值的取值范圍：

取反對數(shù)，可得檢測結(jié)果x的分布區(qū)間：129.987 0≤x≤278.419 8.

由此可得，該樣品的菌落總數(shù)估計值為129～279 CFU/g。

3 結(jié)論

對各不確定度結(jié)果進行分析可知，urel(樣品)＞urel(lgx)＞urel(加樣)＞urel(稀釋)＞urel(樣液)。由此可得，樣品稱量引入的測量不確定度最大，重復(fù)性檢測次之。從可行性層面考慮，樣品稱量引入的不確定度難以降低，為了降低檢測結(jié)果的不確定度，提高其準確性和有效性，可以提高檢測人員的技術(shù)能力，加強檢測技術(shù)的穩(wěn)定性；多進行儀器維護保養(yǎng)，提高儀器可靠性，減少重復(fù)性檢測引入的不確定度。