Antagomir-320對脛骨骨折小鼠圍術期神經認知障礙的影響

周加慧,宋作艷,謝春暉,陶 和,郭雨薇,牟傳琳,符 麗,林 旭,王 彬,畢燕琳*

0 引言

圍術期神經認知障礙(Perioperative neruocognitive disorders,PND)是指麻醉手術后患者出現持續存在的記憶力、抽象思維和定向力障礙[1]，同時伴有社會活動能力變化的一種并發癥。明確其發病機制，可為有效預防PND的發生提供幫助。近年來有研究提出，microRNA在衰老與神經退行性疾病的發生中有著重要的調節作用[2]。有研究通過全基因組測序在晚發型阿爾茨海默病家族中也發現miRNA-320這一外顯變異基因[3]，并且在朊病毒感染所誘導的神經退行性疾病小鼠海馬組織中發現miRNA-320異常表達[4]。而PND 在分子水平上與阿爾茨海默病同為神經退行性疾病[5]，推測miRNA-320可能也是PND發病過程中的分子生物學基礎之一。但目前關于miRNA-320與PND狀態的直接研究甚少。Antagomir是一種新型的人工化學合成物質，根據miRNA的特異性核苷酸序列設計而成，可針對性地改變小鼠內源性miRNA的表達[6]。本研究通過脛骨骨折內固定手術方法建立小鼠PND模型，檢測應用Antagomir-320后小鼠認知功能發生的改變及海馬組織miRNA-320和相關蛋白IGF-1、APP表達變化，為治療及預防患者PND提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級C57/BL小鼠120只，12～14周齡，體重20～30 g，購于濟南朋悅實驗動物研究公司，許可證號：[SCXK(魯)20140007]，實驗開始前適應飼養環境1周，飼養于12 h黑白晝夜交替的恒定室溫及濕度的環境中，適應性飼養1周后用于實驗。采用隨機數字表法將其分為4組(n=30)：對照組(C組)、麻醉手術組(AS組)、生理鹽水+麻醉手術組(NS組)、Antagomir-320+麻醉手術組(AT組)。小鼠術前連續6 d均在同一時間段行Morris水迷宮訓練，并在術前1 d進行曠場實驗，分別于術后1、3、7 d行曠場實驗并在行水迷宮測試結束后處死各組小鼠。

1.2 PND模型建立 參考文獻[7]行小鼠麻醉下單側下肢脛骨骨折切開復位髓內針固定手術。將小鼠置于2 L/min的純氧攜帶5%異氟醚的小動物麻醉箱內5 min進行麻醉誘導，將失去行動力的小鼠從麻醉箱內取出，2.1%±0.5%異氟醚吸入以面罩方式維持麻醉狀態，分離脛骨平臺附近附著的筋膜與肌肉組織，充分暴露小鼠脛骨粗隆，將修剪后的0.38 mm針頭插入脛骨骨髓腔內，使用手術刀與外科鉗于脛骨下1/3處人為造成骨折后，縫合傷口，消毒后局部涂抹復方利多卡因軟膏鎮痛。手術時間控制在15 min以內。蘇醒后放回籠內繼續飼養。

1.3 海馬微量注射 在脛骨骨折內固定手術模型建立前，按照50 mg/kg的劑量腹膜內給予1%戊巴比妥鈉麻醉，在保證麻醉效果完善的前提下，固定小鼠頭部于立體定位儀平臺上，將小鼠頭部正中備皮消毒，給予利多卡因局部皮下注射，暴露顱骨，手術刀片剝離局部腦膜，定位零點于前囟，于鼠腦左右兩側旁開1.8 mm、沿矢狀軸向背側旁開2.5 mm、深度2.3 mm，海馬組織即定位于此并做好標記。按照海馬深度將微量注射器針尖置于海馬內，以0.2 μl/min速率將2 μl生理鹽水、Antagomir-320(0.5 nmol/μl)緩慢注入海馬內，結束后將針留置5 min后，勻速緩慢拔出以防止藥物溢出。

1.4 Morris水迷宮 于術前 6 d開始每天于固定時間點進行Morris水迷宮訓練,剔除有明顯運動障礙的小鼠。測試采用圓形水池,直徑 120 cm；圓柱形平臺直徑10 cm,高30 cm，隱匿平臺可放置于某一固定位置，于水面下0.5 cm。維持水溫恒定于(24±2)℃。術前1～5 d每天追蹤小鼠進行路徑采集。于第6天即術前1 d，撤除平臺，將小鼠隨機選擇某一落水點置入水池中，小鼠首次到達原平臺所在位置的時間則為術前逃避潛伏期。術后1、3、7 d 時采用相同的方法測定認知功能。選用逃避潛伏期和靶象限停留時間百分比作為反映學習和記憶能力的指標。

1.5 曠場試驗 曠場試驗檢測箱為白色正方體檢測箱，大小為 50 cm×50 cm×40 cm，箱內有標記線劃分為不同區域，放置在安靜環境中。將小鼠輕柔抓取，從曠場檢測箱一角緩慢放入，小鼠可以在箱內自由運動，通過攝像頭記錄小鼠在檢測箱內的運動路徑,記錄時間為 5 min。每個區域的小鼠測試結束后，將小鼠再次放回飼養籠內，對檢測箱側壁及底部使用75%酒精擦拭消毒，并充分晾干后進行下一輪測試。檢測期間保持安靜，減少外界環境對小鼠的任何刺激，選取小鼠自發運動的路徑為反映活動能力的指標。

1.6 Western blot檢測海馬IGF-1、APP 術后1、3、7 d水迷宮測試結束后，隨機取5只小鼠斷頭處死，迅速切開顱頂皮膚,剝離頂骨、枕骨,取出小鼠腦組織置于冰臺上操作。根據解剖圖譜所示,取出小鼠海馬,放入凍存管保存在液氮中備用。處死后分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存。取海馬組織加入RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑PMSF(碧云天生物試劑研究所)，于冰面進行充分的研磨、裂解、離心，取上清液加入適量蛋白質上樣緩沖液(5×)(碧云天生物試劑研究所)100 ℃加熱5 min，使用12%的聚丙烯凝膠(碧云天生物試劑研究所)電泳分離蛋白。轉移到PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司)上，使用5%脫脂奶粉(北京索萊寶科技有限公司)在室溫搖床封閉3 h，使用TBST沖洗后，分別加入內參抗體β-actin(稀釋1∶5 000,北京博奧森生物技術有限公司)，APP一抗(稀釋1∶1 000，Abcam公司,英國),IGF-1一抗(稀釋1∶5 000，Abcam公司,英國)，置于4 ℃低溫搖床下孵育過夜。TBST洗脫后加入二抗(稀釋度1∶6 000，北京中杉金橋科技公司)與膜在室溫搖床孵育2 h。使用ECL(碧云天生物試劑研究所)顯示結合蛋白，用生物成像系統進行分析。

1.7 qRT-PCR檢測海馬IGF-1 mRNA和miRNA-320表達 術后1、3、7 d水迷宮測試結束后，隨機取5只小鼠斷頭處死，迅速切開顱頂皮膚,剝離頂骨、枕骨,取出小鼠腦組織置于冰臺上操作。根據解剖圖譜所示，提取出小鼠海馬,將海馬組織置于RNA保存液(碧云天生物試劑研究所)中，4 ℃冰箱過夜，第2天棄去RNA保存液，將海馬組織放入-80 ℃冰箱保存。用超純RNA提取試劑盒(天根生化有限公司)提取海馬組織總RNA以及miRNA。使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化有限公司)將相應RNA反轉錄成cDNA。使用SuperReal 熒光定量預混試劑盒及miRcute 增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(天根生化有限公司)實時熒光定量PCR系統檢測得到的cDNA。GAPDH和U6作為內部對照。引物序列:IGF-1上游：5′-ATGTTATCCGAAATAAGCTG-3′下游：5′-CTCTGCAAACCTCCATGCCG-3′；GAPDH上游：5′-CTGCAATCCGAAAGAAGCTG-3′下游；5′-ATC TTCA AACCTCCATGATG-3′；miRNA-320引物5′-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA-3′。U6引物；5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。結果顯示，在β-微管蛋白及U6正常化后，測2-ΔΔCt的表達水平。擴增后立即測定溶出曲線，呈單峰，顯示出良好的產物特異性。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮實驗 與C組相比，AS組、NS組、AT組在術后1、3、7 d逃避潛伏期延長、靶象限停留時間百分比降低(P<0.05)；與NS組相比，AT組術后3、7 d 潛伏期縮短、靶象限停留時間百分比增加(P<0.05)，而術后1 d與AS組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；AS與NS組相比，術后1、3、7 d逃避潛伏期和靶象限停留時間百分比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠各時點逃避潛伏期(s)與靶象限停留時間百分比的比較(%)

2.2 曠場實驗 術前各組小鼠的運動總路程差異無統計學意義；與C組相比，在術后1、3、7 d，各組小鼠運動總路程差異亦無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 術后各時間點各組小鼠運動總路程的比較(cm)

2.3 小鼠術后海馬組織各時點IGF-1和APP的表達 與C組相比，AT組術后1 d IGF-1蛋白表達降低，術后3、7 d IGF-1蛋白表達升高；AS組與NS組海馬IGF-1略降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與NS組相比，AT組術后1 d 表達降低，術后3、7 d表達升高(P<0.05)。與C組相比，AS組、NS組術后1、3、7 d以及AT組術后1、3 d APP蛋白表達均增加(P<0.05)，AT組術后7 d表達差異無統計學意義(P>0.05)；與NS組相比，AT組術后3、7 d表達降低(P<0.05)，術后1 d差異無統計學意義(P>0.05)。NS組與AS組相比，術后1、3、7 d海馬IGF-1和APP的表達差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠術后各時點海馬IGF-1和APP蛋白表達水平

2.4 小鼠術后海馬組織各時點IGF-1 mRNA和miRNA-320的表達 與C組相比，AS組、NS組術后1、3、7 d以及AT組術后1 d IGF-1mRNA表達均降低，AT組術后3 d和7 d表達升高(P<0.05)；與NS組相比，AT組術后1、3、7 d表達升高(P<0.05)；NS組與AS組相比，術后1、3、7 d差異均無統計學意義(P>0.05)。與C組相比，AS組、NS組術后1、3 d miRNA-320表達升高(P<0.05)，術后7 d變化無統計學意義(P>0.05)，AT組術后1 d表達升高，術后3 d和7 d表達降低(P<0.05)；與NS相比，AT組在術后1、3、7 d表達均降低(P<0.05)；NS組與AS組相比，術后1、3、7 d差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠術后各時點海馬IGF-1 mRNA和miRNA-320的表達水平比較(n=5)

3 討論

微小核糖核酸(microRNA)是一類長度約20～30個核苷酸組成的高度保守的內源性非編碼單鏈小分子RNA，通過與下游靶蛋白的3′-UTR結合，可降解mRNA或者阻止蛋白的翻譯而在轉錄后水平發揮負向調節作用[8-9]。PND發病機制尚未明確，包括神經炎癥、β淀粉樣蛋白沉積、tau磷酸化、膽堿能受損、突觸功能受損、缺乏神經營養支持等。通常PND與精神神經疾病密切相關，如與抑郁癥和阿爾茨海默病等有著共通的分子途經[5]，而近年來越來越多的證據表明，失調的microRNA也參與了認知功能障礙相關的神經系統疾病的發生與發展，例如miRNA-320[4]、miRNA-572[10]、miRNA-126[11]、miRNA-31[12]、miRNA-34[13]等，而且miRNA作為具有生物活性的小分子物質,能夠自由穿過血-腦屏障，可能為中樞炎癥狀態和外周炎癥狀態的交流提供了信息傳遞的物質基礎[14]。隨著對microRNA生物學領域的擴展，microRNA在發育和疾病中的作用認知逐漸加深，使microRNA成為眾多疾病非常有吸引力的新型治療方法[15]。在該研究中，通過使用Antagomir-320作用于PND小鼠，可以看出miRNA-320與PND可能存在的關聯性，從而為PND治療提供新的方向。Zovoilis等[16]發現，相較于局部給藥，相同劑量的Antagomir全身給藥稀釋性降低該低聚物的活性濃度，因此，本實驗采用微量泵海馬局部注射以保證其作用的確切性，全身給藥的作用效應仍需進一步驗證。

海馬是參與認知功能的重要腦區,與空間學習能力、記憶能力密切相關[17]。使用相對成熟的脛骨骨折內固定術建立實驗動物的PND模型[7]，通過經典研究認知功能的Morris水迷宮實驗檢測小鼠認知功能，選取小鼠的逃避潛伏期及靶象限停留時間百分比作為反映學習能力與空間記憶能力的指標，曠場實驗測試能排除脛骨骨折手術對小鼠活動能力產生影響，也是評價小鼠自主行為及探究行為的常用方法。有研究表明，異氟醚麻醉也是引起認知障礙的因素之一[18]，但本實驗異氟醚暴露時間較短，因此，主要探究手術因素刺激所造成的PND。本研究結果顯示，相較于正常小鼠，手術組與麻醉手術組的小鼠逃避潛伏期延長，靶象限停留時間百分比降低，提示該實驗模型建立成功，此外，手術組與麻醉手術組小鼠海馬組織的miRNA-320在術后1、3 d表達明顯升高。并且海馬注射這項操作對PND無明顯影響。

Liang 等[19]研究發現，通過Antagomir-320的局部腦室注射，可以改善腦缺血再灌注損傷，其可能機制是通過抑制小鼠缺血再灌注腦組織內miRNA-320的表達，進而通過IGF-1途徑改善缺血再灌注損傷。IGF-1是調節神經生長的重要物質，能調節中樞神經系統發育和成熟，是細胞可塑性的有效神經內分泌調節劑[20]。研究表明，IGF-1具有神經保護功能[21]，此外，有研究發現，患有PND的患者外周循環中IGF-1的水平明顯低于正常組[22]。研究表明，IGF-1可以抑制APP、Aβ形成，從而促進神經元的存活[23]，減緩認知障礙的發生。而能與IGF-1mRNA靶向結合的miRNA-320[19,24]可引起 IGF-1mRNA 的降解或翻譯抑制,在轉錄后水平上負調節蛋白質表達，從而在學習與記憶方面發揮作用[25]。本實驗中，與正常小鼠相比較，麻醉手術組小鼠逃避潛伏期延長、靶象限停留時間百分比降低，miRNA-320在術后1、3 d表達明顯升高，IGF-1mRNA表達均降低，IGF-1蛋白有所降低但差異無統計學意義，APP蛋白表達均升高。給予Antagomir-320處理后，與麻醉手術組相比較，逃避潛伏期縮短，靶象限停留時間百分比增高，miRNA-320表達降低，IGF-1mRNA及蛋白表達升高，APP于術后3、7 d 表達明顯降低。結合小鼠的行為學測試，以上結果支持Antagomir-320可能通過IGF-1通路影響了PND的發生與發展這一推測。在中樞神經系統中有豐富的microRNA表達，可參與神經元發育、神經炎癥、神經傳遞和突觸可塑等一系列生物學調節作用，而Antagomir-320僅為miRNA-320的特異性抑制劑，手術病理刺激時，腦組織中大量的microRNAs是否通過參與其他生物學調節途徑，調控不同的認知相關因子，從而參與圍術期神經認知障礙的發生與發展，仍需進一步探索。

綜上所述，Antagomir-320可能通過下調miRNA-320，進而調節認知功能相關蛋白IGF-1、APP，改善脛骨骨折小鼠圍術期神經認知功能，為PND的預防和治療提供了新的靶點。