腎素血管緊張素系統關鍵因子在急性白血病中表達情況的研究

【摘要】 目的 觀察急性白血病（AL）細胞表面腎素血管緊張素系統（RAS）中關鍵因子血管緊張素Ⅱ受體1（AT1R）的表達情況，觀察各類AL中RAS系統關鍵因子的不同表達及其與疾病增殖復發、浸潤轉移的相關性。方法 選取內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院血液內科2017年1月至2019年12月收治的AL初治患者60例為病例組（分為AML組30例，ALL組30例），缺鐵性貧血患者60例為對照組，采用流式細胞儀檢測AL細胞表面RAS系統中關鍵因子AT1R的表達情況。結果 病例組患者骨髓原始細胞表面AT1R的表達陽性率高于對照組（Plt;0.05），且AML組AT1R表達陽性率高于ALL組（Plt;0.05）。化療1周期后，達完全緩解患者骨髓原始細胞表面AT1R的表達陽性率低于未達緩解患者（Plt;0.05）。結論 AL細胞表面AT1R表達水平增高。不同類型AL表達水平不同，初發AML中表達更加明顯，完全緩解后AL中AT1R的表達低于未緩解組水平，其可能通過促進腫瘤血管新生參與疾病增殖復發，AT1R可能是AL聯合治療的一個潛在靶點。

【關鍵詞】 白血病；急性白血病；血管緊張素類；血管緊張素Ⅱ受體1

【中圖分類號】 R 733.73 【文獻標識碼】 A

Expression of Key Factors of Renin Angiotensin System in Acute Leukemia ZHANG Dongxia，YUN Yan，ZHUO Lixia*

The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，China

*Corresponding author：ZHUO Lixia，Deputy chief physician；E-mail：2726494311@qq.com

【Abstract】 Objective To observe the expression of angiotensin Ⅱ receptor 1（AT1R），a key factor of renin angiotensin system（RAS）on the surface of acute leukemia（AL）cells，and to observe the different expression of key factors of RAS system in all kinds of Al and its correlation with disease proliferation，recurrence，invasion and metastasis.Methods 60 newly treated patients with Al from January 2017 to December 2019 in the Department of Hematology of the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science and Technology were selected as the case group（30 cases in AML group and 30 cases in all group）and 60 patients with iron deficiency anemia as the control group. The expression of key factor AT1R in RAS system on the surface of Al cells was detected by flow cytometry. Results The positive rate of AT1R expression on the surface of bone marrow primordial cells in the case group was higher than that in the control group（Plt;0.05），and the positive rate of AT1R expression in AML group was higher than that in all group（Plt;0.05）. After one cycle of chemotherapy，the positive rate of AT1R expression on the surface of bone marrow primordial cells in patients with complete remission was lower than that in patients without remission（Plt;0.05）. Conclusion The expression of AT1R on the surface of Al cells is increased. The expression levels of different types of Al are different，and the expression is more obvious in primary AML. After complete remission，the expression of AT1R in Al is lower than that in non remission group，which may participate in disease proliferation and recurrence by promoting tumor angiogenesis. AT1R may be a potential target of combined treatment of Al.

【Key words】 Leukemia；Acute leukemia；Angiotensins；Angiotensin Ⅱ receptor 1

白血病是造血系統的一種惡性腫瘤性疾病，具有發病率高、預后差、死亡率高等特點［1］。根據病程長短可以將白血病分為急性白血病（AL）和慢性白血病（CL）。我國AL較CL多見，且以急性髓系白血病（AML）為主。不同類型的白血病的病變細胞停滯在不同發育階段，其增殖分化凋亡過程失控，發生異常增殖并聚集浸潤于不同組織器官，不僅使正常造血受到抑制，也造成了浸潤組織器官不同程度的損傷。

白血病是由于多能性造血干細胞的惡性轉化（即可以同時產生髓樣和淋巴樣前體）而發生的。在AL中，這些惡性細胞通常是不成熟的，分化差的異常白細胞可以是淋巴母細胞或原始粒細胞。這些胚芽經歷克隆擴增和增殖引起惡性細胞替換和干擾正常血液細胞的發育和功能［2］。白血病干細胞與骨髓微環境的相互作用是白血病發生、發展及復發的主要原因。研究重點包括遺傳背景、白血病干細胞、白血病干細胞造血微環境、細胞表型及信號通路等方面，根除白血病干細胞的藥物也主要從這些途徑入手。得益于基礎研究和轉化醫學的深入發展，AL的藥物也得到了很大發展，靶向治療方法不斷發展，比如針對特定突變的靶向藥物（FLT3抑制劑、IDH1和IDH2抑制劑、KIT抑制劑等），也有針對自噬通路的靶向藥物（如BCL2和MCL1抑制劑、MDM2抑制劑），此外，免疫治療方法在AL中不斷發展（如淋巴細胞表面抗原單抗、免疫檢查點抑制劑、疫苗及細胞療法等）［3］。雖然近些年新型靶向藥物不斷被開發，但對于大部分AL，造血干細胞移植（HSCT）仍然是唯一的治愈手段，此外，對化療藥物的耐受性也使得部分AL患者預后不佳。因此，亟待探索并了解白血病發生的關鍵因素，不斷開發新的有效治療靶點，推動不同類型白血病患者的精準治療，最終改善患者的預后。

血管緊張素Ⅱ（ANGⅡ）是腎素-血管緊張素系統（RAS）的一個主要的生物活性激素，在調控血管內環境穩定中起重要作用。在AML中，MAPK信號通路的改變非常常見，10%～25%的患者在確診時同時攜帶有KRAS和NRAS突變［4］。RAS突變也是患者對FLT3和IDH抑制劑以及對BCL2抑制劑治療耐藥的常見機制之一。在各種其他腫瘤的治療中，針對突變的RAS和其下游通路蛋白也被不斷開發并在臨床實踐中取得突破［5］。ANGⅡ信號主要通過ANGⅡ1型和2型受體（AT1R，AT2R）轉導入細胞內，調控下游信號通路。AT1R存在于各種組織中，包括血管平滑肌、內皮、心臟、腦、腎、腎上腺和脂肪組織，促進ANGⅡ調控的大多數生理功能。AT1R也是一種屬于GPCR超家族的七次跨膜（TM）蛋白，由359個氨基酸組成，有多個ANGⅡ結合位點。ARB/ACEI已廣泛應用于心血管疾病治療中，因而也在大規模人群中得以驗證其對多種腫瘤（如乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃腸道癌等）預后的促進作用［6］。研究證實，AT1R在大鼠的造血系統和骨髓基質的CD34+（HSC）中表達。ANGⅡ可以通過激活CD34+細胞上的AT1R來調節造血干細胞至紅系和髓系祖細胞的增殖和分化過程。RAS 參與了骨髓生理病理造血。如刺激AT1R活化G和非G-蛋白相關信號途徑。Ca2+內流、細胞分裂素活化蛋白激酶（MAPK）、酪氨酸激酶受體和非受體、Janus家族激酶-信號轉換器和轉錄激活因子（JAK-STAT）及NADPH氧化酶的活化等。雖然AT1R通過RAS系統調控諸多生理功能，其在不同白血病發生、發展過程中的機制仍不清楚。明確AL細胞表面AT1R的表達情況以及其在白血病治療過程中的變化情況對于了解AL發病機制，尋找治療新靶點以最終改善白血病患者預后至關重要。

本研究收集了不同初治AL患者骨髓細胞樣本，通過流式細胞術檢測并探索不同AL患者骨髓原始細胞表面AT1R表達差異以及進行化療后不同預后患者（完全緩解者與未達緩解者）骨髓原始細胞表面AT1R表達的變化情況，以期揭示這一重要受體在AL病程中的潛在價值和預后相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月至2019年12月內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院血液內科收治的患者為研究對象。病例組：AL初治患者60例，其中男32例、女28例；年齡21～63歲，平均年齡（43.2±6.3）歲。臨床特點與形態學和細胞化學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學證實，骨髓液中病理細胞≥80%，診斷標準參照AML WHO分型（2001）/FAB分類法和WHO對ALL分型的修訂（2001年），分為AML組30例，ALL組30例。對照組：缺鐵性貧血患者60例，其中男34例，女26例；年齡23～62歲，平均年齡（44.5±6.4）歲。排除腫瘤、肝腎疾病、免疫系統疾病、心血管疾病、糖尿病及其他血液系統等疾病。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2 采集骨髓穿刺液 無菌操作骨穿，研究對象局部無菌操作進行骨髓穿刺，用無菌注射器抽取骨髓液4 ml，以5%EDTA干粉管抗凝。分離骨髓液和細胞進行進一步實驗操作。

1.3 流式細胞術 計數骨髓穿刺液中有核細胞數目，以PBS調細胞濃度為10×109 個/L。每份樣本分作兩管，一管作為陰性對照，加入稀釋后的骨髓液100 μl和CD45-PC5熒光抗體10 μl進行CD45標記。另一管作為實驗組，除加入稀釋后的骨髓液100 μl和CD45-PC5熒光抗體10 μl進行CD45標記外，還加入抗AT1R-FITC抗體10 μl。兩管分別混勻后避光孵育20 min，加入溶血劑溶解紅細胞。PBS清洗1遍。加入500 μl PBS重懸細胞后上機。以陰性對照管調節電壓并在以SSLOG-FL4LOG（CD45）散點圖上進行細胞分群，圈定原始細胞群，再在原始細胞群對應的FITC熒光強度圖上設門，使陽性率在0.5%～2.0%。上實驗組AT1R-FITC抗體標記管，計數105個細胞，得出原始細胞群AT1R陽性率。連測3次，取平均值。

1.4 統計學方法 數據經SPSS 22.0統計學軟件處理。計量資料采用（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 初發AL骨髓原始細胞表面AT1R表達差異 本研究應用流式細胞術對對照組和AL組骨髓穿刺液細胞進行分群，并檢測了骨髓原始細胞表面AT1R表達情況。病例組患者骨髓原始細胞表面AT1R的表達陽性率高于對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。AML組AT1R表達陽性率高于ALL組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.2 化療后CR患者和NR患者骨髓原始細胞表面AT1R表達差異 化療1周期后，達完全緩解患者骨髓原始細胞表面AT1R的表達陽性率低于未達緩解患者，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

3 討論

白血病是一種發病率高、預后差、死亡率高的造血系統惡性疾病，尤其是兒童期的好發腫瘤［7］。白血病的病因與發病機制至今尚不清楚，除了先天遺傳因素外，還與多種因素有關，如病毒感染、免疫功能異常、電磁輻射、化工污染及空氣污染等。在不同因素的影響下，造血干細胞發生惡性轉化，與骨髓微環境相互作用過程中，出現增殖、分化和凋亡的失控，最終導致白血病的發生。根據病程長短可以將白血病分為AL和CL。根據細胞類型分類，白血病可以分為淋巴細胞型、粒細胞型、單核細胞型等［8］。

AL的確診有賴于骨髓活檢，通過免疫分型檢查、染色體核型和分子生物學檢查等可以確定白血病的細微亞型［9-10］。AL確診后初始治療一般均為化療（對于急性早幼粒細胞白血病為誘導分化治療），輔以新型靶向治療藥物、支持治療。雖然近些年不斷有遺傳學等層面針對性的靶向藥物如FLT3抑制劑、IDH1和IDH2抑制劑、KIT抑制劑等相繼問世并在臨床實踐中取得了較好的成果，但HSCT仍然是多數白血病唯一的治愈手段。因此，充分研究白血病的發生機制，不斷挖掘新的潛在治療靶點，為患者提供更多更精準的治療藥物與定制更完善的治療策略迫在眉睫。

RAS是維持內環境穩態的重要內分泌系統，對于維持血壓、水和電解質平衡非常重要，其對于維持脈管系統平衡極為關鍵［11］。血管緊張素Ⅱ及其下游通路是RAS系統的核心，而AT1R是ANGⅡ的重要受體。AngⅡ激活AT1R后直接調節血管生成，促進血管系統重塑，介導促炎反應，參與干細胞編程和造血作用以及維持水電解質平衡［6］。ANGⅡ及其下游信號對于細胞增殖凋亡具有調控作用，惡性腫瘤的發生、發展也與其異常激活及成分失衡密切相關。一項研究表明，AngⅡ可能是AML的獨立預后因子，拮抗AngⅡ或可成為AML的新治療靶標［12］。雖然AT1R拮抗劑在臨床上被廣泛應用于高血壓及相關心血管疾病的治療，但AT1R拮抗劑仍在腫瘤、炎癥、青光眼等疾病中展現出了應用前景［13］。有研究表明，AT1R拮抗劑可以抑制AL病變細胞增殖并誘使其凋亡［14-15］。因此，明確AL細胞表面AT1R的表達情況以及其在白血病治療過程中的變化情況對于了解AL發病機制，尋找治療新靶點以最終改善白血病患者預后至關重要。

本研究結果表明，AL患者骨髓中原始細胞表面AT1R的表達陽性率高于對照組，且在AML中AT1R陽性表達率更高。AT1R可能是參與AL尤其是AML的重要因子，其可能通過RAS系統及下游蛋白參與白血病的發生與發展。完全緩解后AL中AT1R的表達明顯低于未緩解組，表明AT1R與AL患者的預后相關，AT1R可能是白血病聯合治療的一個潛在靶點。目前臨床上的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（如氯沙坦、纈沙坦等）仍主要用于心血管疾病治療，其在白血病患者中聯合應用或可改善預后，促進AL患者的緩解，值得進一步研究。

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（本文編輯：楊允利）