茯苓水提物對環磷酰胺荷瘤小鼠免疫微環境的影響

【摘要】 目的 探討茯苓水提物對環磷酰胺荷瘤小鼠免疫微環境的影響。方法 2020年5月將40只小鼠隨機分為空白組、模型組和茯苓水提物低、中、高劑量組，各8只。空白組不予造模，其余各組均建立環磷酰胺荷瘤小鼠模型，從造模當日起，空白組和模型組均采用等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃；茯苓水提物低、中、高劑量組灌胃劑量分別為15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg；連續灌胃28 d。觀察小鼠脾臟、胸腺指數、脾臟NK細胞及CD4+、CD8+細胞比例、NK細胞活性。結果 與空白組比較，造模組小鼠胸腺指數降低、脾臟指數升高（Plt;0.05）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠胸腺指數升高，脾臟指數降低（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠脾臟NK細胞比例降低（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠脾臟NK細胞比例均增加（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠脾臟CD4+細胞比例降低、CD8+細胞比例升高（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠脾臟CD4+細胞比例升高、CD8+細胞比例降低（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠NK細胞活性降低（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠NK細胞活性均增加（Plt;0.05）。結論 茯苓水提物改善環磷酰胺引起的毒副作用，可能是通過增加脾臟NK、CD4+、CD8+細胞比例及增強NK細胞的活性發揮免疫調控作用。

【關鍵詞】 腫瘤；茯苓；環磷酰胺；免疫功能；小鼠

【中圖分類號】 R 739.9 【文獻標識碼】 A

Effect of Poria Cocos Water Extract on Immune Microenvironment of Cyclophosphamide Tumor Bearing Mice DENG Peng，XU Ri，LIU Yanwei，HU Fang，LIU Zhongyong*

Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China

*Corresponding author：LIU Zhongyong，Professor，Chief physician，Doctoral supervisor；E-mail：Lzyonggmail@163.com

【Abstract】 Objective To investigate the effect of Poria cocos water extract on immune microenvironment of cyclophosphamide tumor bearing mice. Methods In May 2020，40 mice were randomly divided into blank group，model group and low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract，with 8 mice in each group. No model was made in the blank group，and cyclophosphamide tumor bearing mouse models were established in other groups. From the day of modeling，the blank group and model group were perfused with equal volume of 0.9% sodium chloride solution；The intragastric doses of Poria cocos water extract in low，medium and high dose groups were 15 mg / kg，30 mg / kg and 60 mg / kg respectively；Continuous gavage for 28 days. The indexes of spleen and thymus，the proportion of spleen NK cells and CD4+，CD8+ cells，and the activity of NK cells were observed. Results Compared with the blank group，the thymus index decreased and the spleen index increased in the model group（Plt;0.05）；Compared with the model group，the thymus index increased and the spleen index decreased in the low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract （Plt;0.05）. Compared with the blank group，the proportion of spleen NK cells in the model mice decreased （Plt;0.01）；Compared with the model group，the proportion of spleen NK cells in low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract increased（Plt;0.05）. Compared with the blank group，the proportion of CD4+ and CD8+ cells in spleen of model mice decreased（Plt;0.01）；Compared with the model group，the proportion of CD4+ and CD8+ cells in spleen of mice in low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract increased（Plt;0.05）. Compared with the blank group，the activity of NK cells in the model mice decreased（Plt;0.01）；Compared with the model group，the activity of NK cells in low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract increased（Plt;0.05）. Conclusion Poria cocos water extract can improve the toxic and side effects caused by cyclophosphamide，which may play an immune regulatory role by increasing the proportion of spleen NK，CD4+，CD8+ cells and enhancing the activity of NK cells.

【Key words】 Neoplasms；Poria；Cyclophosphamide；Immunity；Mice

肺癌屬于西醫學病名，根據其臨床表現及特征歸于“咳嗽”“肺壅”“肺巖”等范疇。肺癌是由全身氣血陰陽失調導致的，病性屬于本虛標實，病位在肺，與脾相關，以正虛為本。茯苓又稱“茯菟”，首載于《神農本草經》，作為“九大仙草”“四君八珍”之一，久服可安魂養神、益壽延年，具有很強的滋補功效。《用藥心法》中記載“茯苓，淡能利竅，甘以助陽......味甘平補陽，益脾逐水，生津導氣”。茯苓具有延緩衰老、抗炎、利尿、保肝、促進胃腸道運動、增強免疫等功效［1］，多應用于養生保健藥膳及補品中。本研究探討了茯苓水提物對環磷酰胺荷瘤小鼠免疫微環境的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2020年5月選取SPF級5周齡C57BL/6N近交系雄性小鼠40只（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為：20170011007017），體質量18～20 g，適應性飼養于清潔級環境中，室溫（20±2）℃、濕度50%～70%、每12 h進行照明/黑暗交替。

1.2 試劑與儀器 RPMI-1640培養液（HyClone，Cat SH30027.01），YAC-1（中國科學院細胞庫），FITC anti-mouse CD4抗體（Biolegend，Cat 100406），PE anti-mouse CD3抗體（Biolegend，Cat 100206），PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8抗體（Biolegend，Cat 100734），APC anti-mouse NKp46抗體（Biolegend，Cat 137608），紅細胞裂解液（Biolegend，Cat 420301），Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit I（BD Pharmingen，Cat 556547），環磷酰胺（上海櫻木生物科技有限公司，批號：#23580），恒溫水浴鍋（意大利萊卡公司），生物安全柜（Thermo Fisher Scientific），漩渦混合器（SI儀器公司），CO2細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific），流式細胞儀（Beckman），臺式多功能冷凍離心機（Eppendorf）。

1.3 茯苓水提物制備 稱取茯苓200 g，用10倍體積水浸泡1 h后煎煮1 h，過濾，藥渣加8倍量水煮1 h，過濾，合并兩次濾液，旋蒸濃縮至200 ml藥液，相當于原藥材1 g/ml。茯苓水提物低、中、高劑量組為分別含生藥量15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg的藥液。

1.4 llc細胞復蘇與傳代 將llc細胞放入37 ℃水浴鍋內快融后，轉移至裝有5 ml的DMEM完全培養液（DMEM培養基+10%胎牛血清+1%雙抗）的15 ml離心管中，離心后，重懸混勻后放入培養箱中，隔天換液，當細胞密度80%左右時，用胰酶消化、傳代。

1.5 模型建立及分組 C57BL/6N小鼠適應性飼養7 d后，隨機分為空白組，模型組，茯苓水提物低、中、高劑量組，其中空白組不予造模，其余各組均予造模。環磷酰胺荷瘤小鼠模型制備：llc消化、傳代后，調整細胞懸液濃度至5×105/ml，使用呼吸麻醉機將小鼠麻醉后，將小鼠背部右側肩胛骨處的毛發使用剃毛器剃去，取100 μl混勻的調整好濃度的細胞懸液，注射于小鼠背部右側肩胛骨處皮下。并從荷瘤模型建立的第22天開始，連續3 d腹腔注射環磷酰胺50 mg·kg-1·d-1。

1.6 給藥方式 從造模當日起，空白組和模型組均采用等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃；茯苓水提物低、中、高劑量組，灌胃劑量分別為15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg；連續灌胃28 d。最后一次灌胃24 h后小鼠稱重，并于安樂死后取脾、胸腺備用。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 脾臟、胸腺指數測定 取材前測量小鼠的體質量，采用無菌剪刀和鑷子在小鼠安樂死后，取脾臟和胸腺并稱重。脾臟、胸腺指數=脾、胸腺質量（mg）/體質量（g）×100%。

1.7.2 脾臟NK、CD4+、CD8+細胞比例測定 取出脾臟置于200目濾網上研磨后，4℃，250×g，離心5 min，棄上清。裂紅后，離心棄上清，重懸，取4×106個細胞后，加入50 μl含1% FBS的PBS及1 μl anti-CD3抗體和2μl anti-NKp46抗體；以及1μl anti-CD3抗體、1μl anti-CD4抗體和2μl anti-CD8抗體，混勻。置于4℃孵育30 min后，加入800 μl含1% FBS的PBS溶液洗滌離心，洗滌2～3次。棄上清，加入200 μl含1% FBS的PBS重懸細胞，上流式機檢測。

1.7.3 NK細胞活性測定 取出脾臟置于200目濾網上研磨，4℃，250×g，離心5 min，棄上清。裂紅后，離心，脾細胞：Yac-1細胞為10：1，將計數后將細胞分別加于96孔板中，放入培養箱共培養3 h，取出，24℃，250×g，離心5 min。除去上清，加入稀釋后的1X的binding buffer，annexin V 3 μl/只，碘化丙啶PI 4 μl/只，混勻，置于24℃孵育20 min后，加入500 μl配置好的1X的binding buffer洗滌3次，離心棄上清，加入150 μl的配置好的1X的binding buffer后混勻，上流式機檢測。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0進行統計分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脾臟、胸腺指數 五組小鼠脾臟、胸腺指數比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠胸腺指數降低、脾臟指數升高，差異有統計學意義（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠胸腺指數升高，脾臟指數降低，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 脾臟NK細胞比例 五組脾臟NK細胞比例比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠脾臟NK細胞比例降低，差異有統計學意義（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠脾臟NK細胞比例均增加，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.3 脾臟CD4、CD8陽性細胞比例 五組脾臟CD4、CD8陽性細胞比例比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠脾臟CD4+細胞比例降低、CD8+細胞比例升高，差異有統計學意義（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠脾臟CD4+細胞比例升高、CD8+細胞比例降低，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

2.4 NK細胞活性 五組NK細胞活性比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠NK細胞活性降低，差異有統計學意義（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠NK細胞活性均增加，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表4。

3 討論

對于腫瘤的病機的認識，自古就有“正虛”之說，“正虛致瘤”的理論也得到了諸多現代醫家的肯定，腫瘤的治療當以“扶正”為首要目的。從現代醫學角度來說，“正氣”可理解為機體的免疫功能，“正氣”虛，則機體免疫功能異常或低下。現代研究表明茯苓具有多種有效成分如三萜［2-3］、多糖［4-7］、甾體［8-9］、揮發油［10］、蛋白質和氨基酸［11］等，具有延緩衰老、抗炎、利尿、保肝、促進胃腸道運動、增強免疫等［1］作用。

本研究探討茯苓水提物對環磷酰胺荷瘤小鼠免疫微環境的影響，結果表明不同劑量的茯苓水提物均可不同程度的改善環磷酰胺荷瘤模型造成的小鼠免疫器官損傷。

NK細胞是機體固有免疫和適應性免疫的重要橋梁，參與了腫瘤免疫監視和維持免疫穩態的過程，在腫瘤的免疫應答中具有關鍵作用。CD4+T淋巴細胞即輔助性T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞即細胞毒性T淋巴細胞在抗病毒及腫瘤殺傷中發揮重要作用。茯苓水提物可增加環磷酰胺荷瘤小鼠脾臟的NK、CD4+T、CD8+T細胞比例，并增強NK細胞的殺傷活性。

綜上所述，茯苓水提物可提高環磷酰胺荷瘤小鼠的免疫功能，然而對于其具體作用機制需要更深入研究。

參考文獻

杜曉妍，吳嬌.茯苓的化學成分和藥理作用研究進展［J］.新鄉醫學院報，2021，38（5）：496-500.

方瀟，丁曉萍，陳林霖，等.茯苓皮中三萜類化學成分的HPLC-LTQ-Orbitrap分析［J］.時珍國醫國藥，2019，30（9）：2117-2121.

王宏俠.茯苓不同藥用部位化學成分分析及赤茯苓質量標準研究［D］.石家莊：河北醫科大學，2016.

胡康，羅清，朱曉峰，等.茯苓均一多糖的分離純化及其硫酸化衍生物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的影響［J］.中國中藥雜志，2019，44（13）：2835-2840.

劉坤.茯苓多糖PCP-I對炭疽保護性抗原的佐劑效應研究［D］.北京：中國人民解放軍軍事醫學科學院，2017.

LI X，HE Y，ZENG P，et al. Molecular basis for Poria cocos mushroom polysaccharide used as an antitumour drug in China［J］. J Cell Mol Med，2019，23（1）：4-20.

PU Y，LIU Z，TIAN H，et al. The immunomodulatory effect of Poria cocos polysaccharides is mediated by the Ca2+/PKC/p38/NF-kB signaling pathway in macrophages［J］. Int Immunopharmacol，2019，72：252-257.

倪付勇，謝雪，溫建輝，等.茯苓非多糖類化學成分的抗補體活性［J］.中草藥，2019，50（11）：2529-2533.

WANG M，CHEN D Q，CHEN L，et al. Novel RAS inhibitors poricoic acid ZG and poricoic acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin pathway and targeted phosphorylation of smad3 signaling［J］. J Agric Food Chem，2018，66（8）：1828-1842.

廖川，楊迺嘉，霍昕，等.茯苓普通粉揮發性成分研究［J］.生物技術，2008（4）：54-56.

季懷萍，李菁，揚興華.ICP-AES同時測定茯苓中多種微量元素［J］.實用預防醫學，2007（3）：876-877.

（本文編輯：崔莎）