茶多酚、黃芩苷、原花青素拮抗脂多糖影響牙周膜成纖維細胞生理活性的差別研究

【摘要】 目的 分析受脂多糖（LPS）影響的牙周膜成纖維細胞（PDLCs）在茶多酚、黃芩苷、原花青素干預后的效果及差別。方法 2018年7月—2019年10月，將256孔PDLCs均分為4組，分別為空白組（滴入9.0%的LPS培養液1.0 ml+0.9%氯化鈉溶液1.0 ml），原花青素組（滴入9.0%的LPS培養液1.0 ml+5 mg/ml的原花青素1.0 ml），黃芩苷組（滴入9.0%的LPS培養液1.0 ml+5 mg/ml的黃芩苷1.0 ml），茶多酚組（滴入9.0%的LPS培養液1.0 ml+5 mg/ml的茶多酚1.0 ml），每組均64孔，連續培養7 d。比較四組干預前后PDLCs的細胞凋亡率、增殖活性、前列腺素內氧化酶還原酶（COX-2）和超氧化物歧化酶（SOD）含量、白介素1（IL-1β）和前列腺素E2（PGE2）含量的變化。結果 干預后比較，三組（原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組）PDLCs的細胞凋亡率、PGE2和IL-1β含量、COX-2含量低于空白組，PDLCs的增殖活性、SOD含量高于空白組（Plt;0.05）。兩兩比較，茶多酚組PDLCs的細胞凋亡率低于原花青素組、黃芩苷組，茶多酚組PDLCs的增殖活性高于原花青素組、黃芩苷組，茶多酚組PGE2和IL-1β含量均低于原花青素組和黃芩苷組，茶多酚組COX-2含量低于原花青素組、黃芩苷組，茶多酚組SOD含量高于原花青素組、黃芩苷組（Plt;0.05）。結論 在LPS影響PDLCs生理活性的背景下，應用茶多酚、黃芩苷、原花青素干預均有不同程度效果，其中又以茶多酚效果最佳。

【關鍵詞】 牙周組織；成纖維細胞；脂多糖類；多酚類；黃芩苷；原花青素類；細胞凋亡率；增殖活性

【中圖分類號】 R 78 【文獻標識碼】 A

Tea Polyphenols，Baicalin and Proanthocyanidins Antagonized the Difference of Physiological Activity of PDLCs Cells Affected by LPS MO Hanjia，XUE Zixuan，HUANG Siming，WU Zixiang，HE Yong，LI Zhixuan，FU Jing，DEGN Xiaojun，LIU Lu，ZEGN Yujuan，LI Jiarui，LIU Zijuan，SHAN Bindan，ZHOU Donghua*

Changsha Medical College，Changsha 410219，China

*Corresponding author：ZHOU Donghua，Lecturer；E-mail：2653479600@qq. com

【Abstract】 Objective To analyze the effects and differences of periodontal membrane fibroblasts（PDLCs）influenced by lipopolysaccharide（LPS）after the intervention of tea polyphenols，baicalin and procyanidins. Methods From July，2018 to October，2019，256-well PDLCs were divided into four groups：blank group（1.0 ml of 9.0% LPS culture solution+1.0 ml of 0.9% sodium chloride solution）and procyanidin group（1.0 ml of 9.0% LPS culture solution+1.0 ml of 5 mg/ml procyanidin）. Baicalin group（9.0% LPS culture solution 1.0 ml+5 mg/ml baicalin 1.0 ml）and tea polyphenols group（9.0% LPS culture solution 1.0 ml+5 mg/ml tea polyphenols 1.0 ml），each with 64 holes，were cultured continuously for 7 days. The apoptosis rate，proliferation activity，contents of Cyclooxygenase-2（COX-2）and Superoxide dismutase（SOD），interleukin-1（IL-1β）and prostaglandin E2（PGE2）of PDLCs before and after intervention were compared among the four groups. Results After intervention，the apoptosis rate of PDLCs，PGE2 and IL-1 content，COX-2 content of the three groups（proanthocyanidin group，baicalin group，and tea polyphenol group）were lower than that of the blank group，and the proliferation activity of PDLCs and SOD content were higher than that of the blank group，and the differences were statistically significant（Plt;0.05）. Compared with procyanidins and baicalin，the apoptosis rate of PDLCs，proliferation activity of PDLCs，contents of PGE2 and IL-1β，COX-2 and SOD in tea polyphenols group were lower than those in procyanidins and baicalin groups（Plt;0.05）. Conclusion Under the background of lipopolysaccharide affecting the physiological activity of periodontal membrane fibroblasts，the application of tea polyphenols，baicalin and procyanidins all had different degrees of effects，among which tea polyphenols had the best effect.

【Key words】 Periodontium；Fibroblasts；Lipopolysaccharides；Polyphenols；Baicalin；Proanthocyanidins；Apoptosis rate；Proliferation activity

牙周膜成纖維細胞是牙周組織最主要的構成細胞，亦是牙周病灶修復或再生的細胞基礎，其生理狀態受脂多糖影響明顯。牙菌斑中革蘭陰性菌的細胞壁外膜是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）最主要來源，亦是誘導牙周膜成纖維細胞（periodontal membrane fibroblasts，PDLCs）啟動炎性反應的關鍵因子［1-2］。因此，LPS刺激PDLCs后引發的結締組織基質降解、牙周組織的破壞、牙槽骨吸收等過程，是眾多牙周疾病共有的基礎病理、生理環節，控制該環節對治療原發疾病至關重要［3］。臨床常將抗菌藥物機械性地作為口腔炎癥治療的首選藥物，但抗菌藥物對牙周袋等盲區的微生物作用有限，長期使用將干擾多部位菌群的生態平衡，還會增強口腔病原菌的耐藥性［4］。天然中草藥茶多酚、黃芩苷、原花青素在諸多研究中均被用于多種炎性疾病的臨床治療，雖活性組分復雜，但抗炎效果確切且安全［5-6］，嘗試將其應用于受LPS影響的PDLCs，并探討具體差別，可為上述3種中草藥臨床應用或相關藥理學研究提供理論支撐。

1 資料與方法

1.1 實驗細胞 2018年7月—2019年10月，將SD雄性小鼠（7周齡，SPF級，編號43006700009837）吸入麻醉（乙醚）后，在無菌環境下用組織塊法刮取牙周膜組織（根中之間），剪成組織塊（體積1 mm3）置于DMEM培養基（20%胎牛血清+1%雙抗）中，置于培養箱（37 ℃、5% CO2）中培養，2 d換液1次，待組織塊游出的細胞長至75%時，用胰酶消化并傳代。取生長狀態較好的256孔PDLCs（4～6代）待用，共4組，每組64孔細胞培養板。

1.2 實驗儀器和試劑 （1）主要儀器包括：體式顯微鏡（德國Leica公司）、酶標儀（瑞士Tecan 公司）、Navios系列流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）、AU480全自動生化儀（貝克曼庫爾特公司）等。（2）主要試劑包括：原花青素（上海市源葉生物科技有限公司，批號20150129）、黃芩苷（上海金穗生物科技有限公司，批次2015121023，）、茶多酚（上海研謹生物科技有限公司，批次YJ-B10139）等。實驗前3種標準品均配置為的待用液（濃度5 mg/ml），現配現用。

1.3 分組處理 將PDLCs細胞隨機分為4組，培養液配置方法具體如下：空白組（滴入9.0%的LPS培養液1.0 ml+0.9%氯化鈉溶液1.0 ml），原花青素組（滴入9.0%的LPS培養液1.0 ml+5 mg/ml的原花青素1.0 ml），黃芩苷組（滴入9.0%的LPS培養液1.0 ml+5 mg/ml的黃芩苷1.0 ml），茶多酚組（滴入9.0%的LPS培養液1.0 ml+5 mg/ml的茶多酚1.0 ml），間隔1 d滴入1次，連續培養7 d。

1.4 數據采集 干預前（培養前）和干預后（培養7 d）分兩次進行檢測，指標包括：（1）細胞凋亡率：用流式細胞儀定量檢測；（2）增殖活性：使用配套試劑盒采用CCK-8法定量檢測；（3）前列腺素內氧化酶還原酶（cyclooxygenase-2，COX-2）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）：PDLCs細胞經孵育（37 ℃）、洗板（120 min）、混勻（每孔加酶標抗體工作液100 μl）等步驟處理，用酶標儀分別在450 nm和490 nm處檢測吸光值，經自動轉換（Image J圖像處理軟件）獲得準確含量；（4）白介素1（interleukin-1，IL-1β）和前列腺素E2（dinoprostone，PGE2）：均采用全自動生化檢測儀定量檢測［7-9］。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。計量資料（細胞凋亡率、增殖活性、各蛋白和因子含量）經檢驗符合正態性及方差齊性，均用（±s）表示，多組間比較采用F檢驗，干預前后比較采用配對t檢驗（組內），兩兩組別比較用SNK-q檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組干預前后PDLCs細胞活性比較 相較于干預前，干預后空白組PDLCs細胞凋亡率增加、增殖活性降低，原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組PDLCs細胞凋亡率和增殖活性均降低，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。四組干預后PDLCs細胞凋亡率、增殖活性比較，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組干預后PDLCs細胞凋亡率均低于空白組，茶多酚組低于原花青素組和黃芩苷組，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組干預后PDLCs增殖活性均高于空白組，黃芩苷組低于原花青素組，茶多酚組高于原花青素組、黃芩苷組，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 四組干預前后PGE2、IL-1β水平比較 相較于干預前，四組干預后PGE2水平均升高，空白組干預后IL-1β水平升高，原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組干預后IL-1β水平降低，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。四組干預后PGE2、IL-1β水平比較，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組干預后PGE2水平均低于空白組，茶多酚組低于原花青素組和黃芩苷組，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組干預后IL-1β水平均低于空白組，黃芩苷組高于原花青素組，茶多酚組低于原花青素組、黃芩苷組，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.3 四組干預前后SOD、COX-2含量比較 相較于干預前，空白組、原花青素組、茶多酚組干預后SOD含量降低，四組COX-2含量均增加，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。四組干預后SOD、COX-2含量比較，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組干預后SOD含量高于空白組，黃芩苷組和茶多酚組高于原花青素組，茶多酚組高于黃芩苷組，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組干預后COX-2含量低于空白組，黃芩苷組和茶多酚組低于原花青素組，茶多酚組低于黃芩苷組，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

3 討論

LPS由三部分組件（核心寡聚糖、特異性多糖鏈、類脂）構成，不僅可激活多個細胞信號轉導系統進而引發系列炎性反應，超出10 μg/ml濃度的LPS還可對PDLCs直接產生細胞毒效應［10］。生物安全性是藥物研發的必要條件，茶多酚抗氧化應激功效明顯，黃芩苷清熱抑菌功效明顯，而原花青素則在抗變態反應上有獨特的藥理活性，檢索文獻［11-12］發現上述三種中草藥均有應用于慢性牙周炎的諸多研究，但缺乏比較研究，亦未對不同中草藥作用機制進行區別探索，針對于此，本研究特進行了深入探究。

本研究發現，干預后相比干預前，空白組PDLCs的細胞凋亡率或增殖活性不斷惡化，而4項指標（COX-2、SOD、IL-1β、PGE2）表達含量亦有顯著改變，主要與毒力因子LPS持續作用下，PDLCs中TLR4控制的NF-κB信號通路被嚴重激活，細胞骨分化能力衰退，組織重建能力降低有關［13］。被LPS刺激的PDLCs其降解膠原活性亦有增強，這將加重局部病灶的自噬反應程度，直觀表現為特征性指標檢出水平發生改變［14］。研究還發現，干預后三組（原花青素組、黃芩苷組、茶多酚組）PDLCs生理功能相關指標均有顯著改善。具體分析，原花青素主要組分為多羥基結構的原花青素B2，其可影響巨噬細胞IL-1β受體相關激酶來影響中性粒細胞清除細菌的效率，并通過適當調整SOD含量來平衡牙周局部病灶的活性氧自由基［15］。同時，原花青素還可通過金屬離子螯合作用與Zn2+發生競爭性結合，進而促使明膠酶或膠原酶發生構變，最終對其活性產生影響［16］。黃芩苷是富含于黃芩中且確效的黃酮類組分之一，其對LPS有直接降解作用，又可通過抑制炎性反應、抑制酶活性、抗氧化等綜合途徑來增強PDLCs細胞活性［17］。黃芩苷對PGE2的影響是通過抑制誘導型NO合酶的表達來實現的，而PGE2又將通過基質金屬蛋白酶來誘導中性粒細胞浸潤過程，并間接影響IL-1β和SOD的表達水平［18］。多羥基酚性化合物茶多酚由新鮮茶葉提煉而成，據相關研究，該物質保持在0.130～0.550 mg/ml范圍內則對PDLCs細胞增殖有明顯促進作用，主要與其能高效維護細胞膜的滲透平衡及穩定機構有關［19］。綜合分析可知，原花青素、黃芩苷、茶多酚干預LPS刺激的PDLCs，最終發揮藥效的機制雖然存在一定共性通道，但核心機制依然存在明顯差別。

進一步分析發現，茶多酚組細胞凋亡率低于原花青素組，而增殖活性高于原花青素組，上述兩項數據證實，等同劑量的茶多酚用于干預LPS刺激的PDLCs，能更快速、盡可能地恢復細胞基礎性的生理功能。茶多酚對正常細胞機會不存在抑制作用，但對異常增殖細胞的細胞周期則有顯著影響，該過程實現主要通過減少二氨基二苯甲烷、增加抗氧化酶類含量來實現［20］。還有研究指出，LPS與IL-1β存在交互作用，兩種物質同時作用時可極大程度地刺激PDLCs，進行破壞炎癥微環境的自我平衡功能，加重病情［21-22］。茶多酚則可切斷IL-1β分泌過程，并將其控制在極低表達水平內，破壞LPS與IL-1β之間固有的量效依賴關系，最終保護PDLCs［23］。COX-2作為PGE2合成的限速酶，兩者表達水平存在明顯依存關系，隨著PDLCs細胞修復再生功能得到適當恢復，牙齦卟啉單胞菌-牙齦半胱氨酸酶的活性也將得到控制，茶多酚抑制牙周斑形成、抑制致病菌生長的效果也將得到強化［24-25］。數據顯示，干預后的茶多酚組PGE2和IL-1β含量均低于原花青素組、黃芩苷組，而茶多酚組COX-2含量低于原花青素組、黃芩苷組，茶多酚組SOD含量高于原花青素組、黃芩苷組，系列數據證實了茶多酚干預LPS刺激的PDLCs，發揮臨床外觀功效的可能機制。組間比較差異也證實，茶多酚相比等同劑量和濃度的原花青素、黃芩苷，更適用于牙周炎疾病的臨床治療，但受限于研究經費及范圍，本項目尚未進行動物或人體試驗，后續研究需在此基礎上加以完善和推進，并嘗試對茶多酚、黃芩苷、原花青素治療牙周炎的安全性進行長期觀察研究。

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（本文編輯：毛亞敏）