β-蒎烯對人源SW872脂肪肉瘤細胞的抑制效果

【摘要】 目的 探討松節油的重要組分β-蒎烯對人源SW872脂肪肉瘤細胞的抑制作用。方法 2020年10—12月，培養人源SW872脂肪肉瘤細胞，根據培養內容物不同分為：β-蒎烯組（濃度梯度設置為0.000、0.315、1.260、5.050、20.160、80.640、322.560 μmol/L）、甲醇組、姜黃素組。細胞劃痕實驗觀察0、24和48 h后在顯微鏡下細胞擴散情況；采用MTT法檢測經過處理24 h和48 h后對細胞增殖的抑制作用并光鏡下觀察SW872細胞形態變化；克隆形成實驗檢測β-蒎烯對SW872細胞克隆形成能力的影響。結果 β-蒎烯作用于人源SW872脂肪肉瘤細胞24 h后，與對照組相比，在100 μg/mlβ-蒎烯的作用下，人源SW872脂肪肉瘤細胞發生皺縮、變圓、細胞間隙增大；1 000 μg/mlβ-蒎烯作用下更為明顯。β-蒎烯組、甲醇組、姜黃素組SW872細胞遷移能力比較：β-蒎烯組與甲醇組相比24 h和48 h遷移時間延長、遷移能力減弱（Plt;0.05）；與姜黃素組24 h和48 h遷移能力相比，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。在β-蒎烯對脂肪肉瘤細胞系SW872增殖的影響中濃度為20.16 μmol/L、80.64 μmol/L和322.56 μmol/L組的β-蒎烯組光密度值比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；濃度為20.16 μmol/L以上的β-蒎烯組出現細胞毒性反應，導致細胞死亡。β-蒎烯10 μg/ml組、100 μg/ml組和1 000 μg/ml組與對照組（0 μg/ml）細胞克隆比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；β-蒎烯10 μg/ml組與100 μg/ml組細胞克隆比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。20.16和80.64μmol/Lβ-蒎烯組SW872細胞分化與對照組比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。結論 β-蒎烯具有抑制SW872細胞分化、遷移、增殖的作用。

【關鍵詞】 脂肪肉瘤；松節油；β-蒎烯；抗腫瘤

【中圖分類號】 R 738.6 【文獻標識碼】 A

Observation of the Inhibitory Effect of β-pinene on Human SW872 Liposarcoma Cells QIAN Xu，ZHOU Ji*，FU Zijie，ZHU Haoxiang，CHEN Kaihua，DONG Yuhong，ZHAO Yifan，LIU Lu，FAGN Guoqiang，GUO Siyan

Changsha Medical University，Changsha 410219，China

*Corresponding author：ZHOU Ji，Lecturer；E-mail：676357605@qq.com

【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of β-pinene，an important component of turpentine oil，on human SW872 liposarcoma cells. Methods Human-derived SW872 liposarcoma cells were cultured，and a control group and β-pinene 0.000，0.315，1.260，5.050，20.160，80.640，322.560μmol/L groups were established. The cell scratch experiment was observed at 0，24，and 48 hours and then the cell proliferation was observed under a microscope；MTT method was used to detect the inhibitory effect on cell proliferation after treatment for 24 h and 48 h，and the morphological changes of SW872 cells were observed under a light microscope；the clone formation experiment was used to detect the effect of β-pinene on the cloning ability of SW872 cells. Results After β-pinene acted on human SW872 liposarcoma cells for 24 hours，compared with the control group，it was found that under the action of 100μg/ml β-pinene，human SW872 liposarcoma cells shrank，rounded，and the intercellular space increased. Large；more obvious under 1 000μg/mlβ-pinene；comparison of SW872 cell migration ability in β-pinene group，methanol group and curcumin group： Compared with the methanol group，the β-pinene group had longer migration time at 24h and 48h，and the migration ability was weakened，which was statistically significant（Plt;0.05）；compared with the curcumin group at 24h and 48h，the migration ability was not statistically significant（Pgt;0.05）. In the effect of β-pinene on the proliferation of liposarcoma cell line SW872，the optical density values of the β-pinene group in the 20.16μmol/L，80.64μmol/L and 322.56μmol/L groups had statistically significant differences（Plt;0.05）；when the β-pinene group at a concentration of 20.16μmol/L or more，cytotoxicity occurs，which leads to cell death. With the increase of β-pinene concentration and time，the effect was significantly enhanced；β- Pinene 10 μg / ml group，100 μg / ml group and 1 000 μg / ml group and control group（0 μg/ml） cell clone，the difference was statistically significant（Plt;0.05）；β- Pinene 10 μg/ml group and 100 μ There was significant difference in cell clone in g/ml group（Plt;0.05）. Compared with the control group，20.16 and 80.64 μmol/L β-pinene group had statistical significance in the differentiation of SW872 cells（Plt;0.05）.Conclusion β-Pinene can inhibit the differentiation，migration and proliferation of SW872 cells.

【Key words】 Liposarcoma；Turpentine oil；β-pinene；Anti-tumor

松節油是我國重要的天然可再生資源，來源廣泛［1］，具有特殊的生物活性。β-蒎烯作為松節油的主要組成成分之一，化學性質活潑，具有潛在的研究價值［2］。松節油在臨床用來治療風濕性關節炎、跌打腫痛、高血壓、癌癥、水腫及鉤蟲病［3-5］等，近來有文獻顯示松節油具有抗氧化、清除自由基、抑制腫瘤細胞轉移、調節免疫系統的功能［6-8］。本研究旨在探討松節油的重要組分β-蒎烯對人源SW872脂肪肉瘤細胞的抑制作用，并觀察β-蒎烯對SW872細胞增殖及分化是否有影響，旨在從細胞水平探討β-蒎烯防治SW872脂肪肉瘤的可能機制，為臨床治療脂肪肉瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備 2020年10—12月。（1）主要材料：β-蒎烯、姜黃素、胎牛血清、油紅O、吉姆薩染色液、DMEM/F12培養基、胰蛋白酶、氯化鈉注射液、無水乙醇等，均由青島市三凱醫學提供；實驗用SW872細胞株，取自長沙醫學院新型藥物制劑湖南省重點實驗室。（2）主要設備：SIGMA3K15高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；EPS-502分析天平（長沙湘平科技發展有限公司）；YT-CJ-1ND超凈工作臺（北京亞泰科隆實驗科技開發中心）；XDS-1B倒置顯微鏡（重慶重光儀器公司）。

1.2 細胞培養及分組 人源SW872脂肪肉瘤培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，補充雙抗（青霉素和鏈霉素）至最終體積的0.1%。培養箱條件為37 ℃飽和濕度并含有5%的CO2。培養瓶中的培養基隔天換液一次，胰蛋白酶消化、收集并傳代保存。根據內容物加入不同進行分組，分別為β-蒎烯組（濃度梯度設置為0、1.26、5.05、20.16、80.64 μmol/L）、甲醇組、姜黃素組。

1.3 觀察內容 （1）光鏡下觀察人源SW872脂肪肉瘤細胞形態：將處于對數生長期的人源SW872細胞常規消化、計數，細胞密度調整到1×105/L，并調整濃度分別為0、100、1 000 μg/ml的β-蒎烯劑量，2 ml每孔接入6孔板中，待24 h后在顯微鏡下觀察，拍照記錄。

（2）人源SW872脂肪肉瘤細胞劃痕實驗：通過細胞計數，在6孔板中加入10萬個細胞/孔，設置2個復孔。在加入細胞到孔板前，用尺和標記筆在孔板底部畫三條橫線，加入細胞后十字法使細胞均勻分布，細胞培養箱靜置待細胞貼壁后，用黃色的200 μl槍頭畫“井”字。去除原來的培養基，并取1 ml的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution，PBS）加入孔中，35 ℃顛倒數次，重復3次清除雜質，最后加入1 ml含1%胎牛血清（FBS）的培養基，分別于0、24、48 h后在顯微鏡下觀察β-蒎烯、甲醇和姜黃素組細胞游走情況，拍照記錄。

（3）人源SW872 脂肪肉瘤細胞的增殖、生長率檢測：采用四甲基偶氮噻唑藍（Methylthiazol tetrazolium bromid，MTT）法進行檢測，將SW872細胞以1×104個/孔接種于96孔板，DMEM/F12（3∶1）+10%胎牛血清培養，隔日換液，直到細胞完全匯合，用無菌PBS沖洗兩次，加入不同濃度β-蒎烯（0.000、0.315、1.260、5.050、20.160、80.640、322.560 μmol/L）作用24、48 h，用酶標儀測定細胞。

（4）β-蒎烯對SW872細胞克隆形成的檢測：將處于對數生長期的人源SW872脂肪肉瘤細胞消化、離心、計數，鋪于12孔板中，每孔500個細胞，500 μl體系（含10%FBS的L-15），2個復孔。直到細胞貼壁后，每孔加入濃度分別為：0、10、100、1 000 μg/ml的β-蒎烯，1周后，細胞對照組出現肉眼可見的細胞集落，進行Giemsa染色，在顯微鏡下觀察，拍照記錄。

（5）人源SW872脂肪肉瘤細胞的分化情況：將人源SW872脂肪肉瘤細胞接種于24孔板中，直到細胞完全匯合后，加入含不同濃度β-蒎烯：0、1.26、5.05、20.16、80.64μmol/L。培養72 h后，對各劑量組細胞進行油紅O染色（油紅O 0.5 g和50%乙醇100 ml充分混合）。570 nm波長處檢測光密度值，對脂肪肉瘤細胞系SW872細胞分化程度進行定量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較用成組t檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β-蒎烯組、甲醇組、姜黃素組SW872細胞遷移能力比較 β-蒎烯組24 h（65.74±5.21），48 h（57.11±4.19）；甲醇組24 h（46.34±3.73），48 h（38.56±2.55）；姜黃素組24 h（68.53±5.37），48 h（60.32±4.02）。β-蒎烯組與甲醇組相比24 h和48 h遷移時間延長，遷移能力減弱，差異有統計學意義（Plt;0.05）；與姜黃素組24 h和48 h遷移能力相比，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。見圖1。

2.2 β-蒎烯組不同濃度設置對SW872細胞細胞形態的影響 β-蒎烯對SW872細胞細胞形態的影響隨濃度增加而越發明顯。β-蒎烯作用于SW872細胞24 h后，與細胞對照組相比，100 μg/mlβ-蒎烯的作用下，SW872細胞開始出現皺縮、變圓、細胞間隙逐漸增寬；1 000 μg/mlβ-蒎烯下，SW872細胞滿視眼變圓、間隙明顯增大，見圖2。

2.3 β-蒎烯組不同濃度設置對SW872細胞增殖和生長率的影響 β-蒎烯處理24 h后，隨著時間的延長，低濃度β-蒎烯對細胞沒有明顯作用；濃度為20.160 μmol/L時，β-蒎烯使細胞生長速度減緩，細胞增殖受抑制，濃度為20.160 μmol/L、80.640 μmol/L和322.560 μmol/L組的β-蒎烯組光密度值（570 nm）比較，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.4 β-蒎烯抑制SW872細胞克隆的形成 對照組平均形成（147.22±8.74）個細胞克隆，β-蒎烯10 μg/ml組平均形成（57.05±6.19）個細胞克隆，β-蒎烯100 μg/ml組平均形成（19.22±7.50）個細胞克隆，β-蒎烯1 000 μg/ml組無SW872細胞克隆的形成，β-蒎烯10 μg/ml組、100 μg/ml組和1 000 μg/ml組與對照組（0 μg/ml）比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；β-蒎烯10 μg/ml組與100 μg/ml組比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。見圖3。

2.5 β-蒎烯對SW872細胞分化的影響 72 h時β-蒎烯組光密度值（OD）：β-蒎烯濃度0.000 μmol/L時（0.060±0.003）、β-蒎烯濃度0.315 μmol/L時（0.055±0.002）、β-蒎烯濃度1.260 μmol/L時（0.053±0.001）、β-蒎烯濃度5.050 μmol/L時（0.051±0.005）、β-蒎烯濃度20.160 μmol/L時（0.045±0.004）、β-蒎烯濃度80.640 μmol/L時（0.037±0.001）、β-蒎烯濃度322.560 μmol/L時（0.028±0.003）。20.16和80.64 μmol/Lβ-蒎烯濃度SW872細胞分化與0.000 μmol/L時比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。

3 討論

松節油是由松脂經過蒸餾得到的單萜烯類液態混合物，是一種不可多得的天然產物資源，具有廣泛的應用價值［9］。我國的松節油資源位于世界首列，年產量大于10萬噸。研究表明，松節油的中的ɑ-蒎烯和β-蒎烯總含量高于90%［10］。甚至β-蒎烯在很多松科屬植物分泌的松脂中含量也極其豐富［11］。β-蒎烯作為松節油的重要組分，人們對其結構中活潑的官能團進行結構修飾，在多元環及橋環、環外雙鍵等結構上進行氧化、異構、加成、氫化、聚合等多種反應，進而得到一系列性能優良的產品［12-14］。截至目前β-蒎烯已被廣泛應用于用于香料、醫藥、食品、農業、高分子材料等行業中［15-16］。本研究以我國豐富的可再生資源松節油的重要組分β-蒎烯為原料探討其對SW872細胞的抑制作用，結果表明在β-蒎烯處理24 h后，隨著時間延長，低濃度β-蒎烯對細胞沒有明顯作用；當濃度為20.160 μmol/L時，β-蒎烯使細胞生長速度減緩，細胞增殖受抑制，并隨著β-蒎烯濃度增加，對細胞生長的抑制作用增強。

脂肪肉瘤是起源于脂肪細胞和向脂肪細胞分化的不同階段的間葉細胞的一種惡性腫瘤，發病率占軟組織惡性腫瘤的第2位或第3位［17］。這其中有10%～36%［18］原發于腹膜后腔，最可能的原因是腹膜后腔存在潛在的巨大腔隙，即給脂肪肉瘤足夠的生長空間又無明顯的臨床表現，所以常耽誤了就診時機［19］。此外，腫瘤巨大，直接侵犯周圍的組織，提升了手術難度和病灶的殘留，進而導致腫瘤短期復發和術后生存期的縮短［20-21］。本研究為探討松節油的主要組成成分β-蒎烯在脂肪肉瘤細胞增殖、生長率的影響，采用SW872細胞作為對象，消除種屬差異，觀察β-蒎烯對其增殖分化的影響。結果表明β-蒎烯處理24 h后，隨著時間的延長，低濃度β-蒎烯對細胞沒有明顯作用；濃度為20.160 μmol/L時，β-蒎烯使細胞生長速度減緩，細胞增殖受抑制。此外，脂肪肉瘤術后的復發率較高，而輔助治療在控制復發和改善預后等方面的功效目前還完善，尚需要大樣本的臨床實驗結果來驗證其功效。

綜上，β-蒎烯對SW872細胞的生長、增殖和分化功能具有抑制作用。因此，利用不同濃度的β-蒎烯調控脂肪細胞的生長、增殖，對脂肪肉瘤的臨床治療極具開發前景，可為防治脂肪肉瘤提供新的思路。

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（本文編輯：崔莎）