流感病毒與肺炎鏈球菌共感染動物模型的國內外研究進展

赫昊， 王雪峰， 張秀英， 黃婉怡， 王爽

流感是影響人類健康的常見傳染病之一。流感病毒其抗原變異性強，傳播迅速，每年可引起季節性流行，在人群聚集機構易發生爆發疫情。肺炎鏈球菌是一種革蘭陽性厭氧菌，在正常人的口腔及鼻咽部經常存在，只形成帶菌狀態，通常不致病，在免疫力低下，嬰幼兒、年老體弱者易發生肺部感染。據統計，自16世紀以來，全球性的“大流感”至少爆發過30次。一百年前的1918年流感是第一次世界范圍傳播的流感，據保守估計造成了全球約5 000萬人死亡。據推算，全球每年有300萬人因流感感染住院，25萬人死亡[1]。盡管抗菌藥物、流感疫苗早已問世，肺炎鏈球菌疫苗投入使用也已10余年，但是流感流行期間，其繼發的細菌感染仍可導致嚴重疾病，甚至在世界范圍內造成嚴重的死亡率和發病率[2]。流感與細菌混合感染病情復雜，機制混亂，因此成功構建流感病毒與肺炎鏈球菌混合感染動物模型對明確共感染的免疫應答機制及探索正確治療順序是及其重要的環節。本文主要對構建共感染模型動物的選擇、病原測定、造模時間選擇等過程方法進行綜述，以期為今后的相關科學研究做好鋪墊。

1 流感病毒與肺炎鏈球菌共感染現狀

研究表明，在過去100年的4次流感大流行期間，50%～90%的嚴重或致死性流感病毒感染與細菌感染有關[3-6]。據報道，至少有15種能合并流感病毒感染的細菌。其中至少4種類型的細菌包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺軍團菌和流感嗜血桿菌增加了肺炎的風險和隨后的死亡率[7-10]。

流感病毒與肺炎鏈球菌的共同感染存在多種因素可導致肺炎[11-14]。與單一感染相比，流感病毒感染后，低劑量的肺炎鏈球菌即可造成嚴重感染[15]。有研究證實，共感染期間TH17免疫應答受到抑制、自然殺傷細胞功能受限、營養因素、宿主自身因素等都會改變宿主的免疫反應或肺內穩態，從而阻礙病毒細菌清除[16-19]。

2 模型研究

2.1 動物種類 根據國內外文獻記載，目前共感染模型普遍選擇小鼠，常用類型為BALB/c、CBA/J、C57BL/6三種。性別選擇雌雄均可，鼠齡6～12周。有研究結果表明，滴鼻感染流感病毒PR8可引起小鼠在急性期體質量下降，肌肉酸痛，活動性降低，伴隨明顯的抑郁焦慮情緒；且BALB/c小鼠對流感病毒PR8的敏感度較C57BL/6小鼠明顯，更適宜做流感病毒PR8感染的小鼠[20]。另外雌性小鼠有動情周期，激素水平可能會影響行為[21]。

2.2 病原種類的選擇

2.2.1 流感病毒 流感病毒通常選用流感病毒A/PR/8/34(H1N1)。流感病毒持續進化，不斷出現新的亞型。有研究表明，流感病毒A/PR/8/34(H1N1)是一種高致病性的小鼠適應病毒，肺炎鏈球菌可以黏附在氣管內暴露的部分基底膜上，此型流感可與細菌共同孵育[22]。

2.2.2 肺炎鏈球菌 肺炎鏈球菌的選擇以普遍流行為原則。肺炎鏈球菌可根據莢膜多糖抗原的不同，分為90多種血清型。在中國，19群肺炎鏈球菌(主要為19F和19A)一直是兒童中最為流行的血清群，其他較為流行的血清型為6B、14和23F[23-25]。

2.3 病原滴度的測定

2.3.1 流感病毒的測定 流感病毒的滴度測定一般有兩種常用方法，半數組織感染量(TCID50)[26]和空斑分析。空斑分析是檢測病毒感染顆粒滴度的一種常用方法。感染性滴度的單位一般表示為PFU/mL，其中PFU(plaque forming unit)表示空斑形成單位。空斑分析的優勢在于可以直接用肉眼看到一個一個空斑，但是它的重復性比較差。TCID50基于泊松分布的統計學原理，所得結果更穩定。

2.3.2 肺炎鏈球菌的測定 肺炎鏈球菌的計數方法一般有兩種方法：平板菌落計數法和麥氏比濁法。平板菌落計數法[27]是取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養，根據培養出的菌落數，可算出培養物中的活菌數，以CFU為單位。此法靈敏度高，目前在國際上廣泛應用。麥氏比濁法是根據菌懸液的透光量間接地測定細菌的數量，可用光電比色計測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。此法簡便快捷，但只能檢測含有大量細菌的懸浮液，得出相對的細菌數目。

2.4 造模方法

2.4.1 流感病毒感染后與肺炎鏈球菌混合感染 流感病毒感染后2～3日，病毒滴度達到高峰，隨后接種肺炎鏈球菌。在流感病毒與細菌感染的重癥肺炎的免疫動力學研究中，選擇在分組后先對小鼠接種流感病毒，按50 μg/kg的戊巴比妥鈉進行麻醉，直立狀態下經鼻接種1×104PFU/mL流感病毒50 μL，混合感染組2日后經鼻接種1×108CFU/mL肺炎鏈球菌50 μL，隨后分析小鼠肺中病毒滴度、細菌數量和免疫反應的動力學，如細胞因子和趨化因子。一些關鍵免疫介質，包括Toll樣受體/絲裂原活化蛋白激酶信號、環氧合酶表達和前列腺素E2的產生[26]。有學者在實驗中通過流感病毒感染后3 d接種肺炎鏈球菌，來探索顆粒蛋白前體調控流感病毒感染后小鼠對細菌易感性的機制[28]。

2.4.2 流感病毒感染恢復后繼發肺炎鏈球菌感染 在流感病毒感染后增強對肺炎鏈球菌易感性的研究中，小鼠用異氟醚吸入麻醉，流感組小鼠滴鼻接種10 TCID50流感病毒，空白組接種磷酸鹽緩沖液50 μL為對照，接種流感病毒14 d后，通過實時定量PCR法測定小鼠體內流感病毒清除干凈，14 d后滴鼻接種1×104CFU/mL肺炎鏈球菌50 μL。從流感病毒感染中恢復過來的小鼠對隨后的肺炎鏈球菌高度敏感，實驗組小鼠致死率較對照組大大增加，流感恢復期小鼠肺組織白細胞介素-10比對照組高50倍。接種前用抗白細胞介素-10單抗處理，可使繼發性細菌性肺炎的細菌生長減少，致死率明顯降低[29]。

2.4.3 肺炎鏈球菌感染后與流感病毒混合感染 此種造模順序用于致死性研究。麻醉狀態下的小鼠滴鼻5×105CFU/mL肺炎鏈球菌致死劑量100 μL(50 μL/鼻孔)，7 d后滴鼻相同劑量流感病毒致死劑量3 000 TCID50。研究表明流感病毒和肺炎球菌雙重感染小鼠模型中存在協同死亡率，肺炎鏈球菌攻擊后發生100%致死率流感病毒感染需7 d。盡管在第3天和第5天組中也觀察到了100%的死亡率，但第7天的死亡最快，發生在24 h內。在所有小鼠中，第3天接受流感病毒感染的小組，平均生存期為3.3 d，在第5天接受感染的小組，平均生存期為2.5 d。第21天失去了協同作用。這些數據表明必須有一定時間序列的事件才能發生協同殺傷力，揭示在此模型中，肺炎球菌感染后7 d感染了流感病毒以最快，最徹底的死亡率死亡[15]。

2.5 模型鑒定

2.5.1 一般狀態 接種病原后，小鼠出現體質量下降，精神萎靡、進食減少、活動量減少及毛發立起等狀態[30]，臨床中，流感病毒感染除引發呼吸道癥狀外，嚴重時還會造成流感相關腦癥綜合征，研究中小鼠還會出現自發行為改變，伴隨抑郁、焦慮、緊張等情緒[20]。

2.5.2 肺葉中病原滴度測定 處死小鼠后，在無菌條件下取出肺，用無菌磷酸鹽緩沖液在肺中洗滌3次，肺同源物直接用于細菌培養(可離心)，上清液用于定量肺炎球菌菌落計數，肺炎球菌的鑒定通過目視檢查和標準識別菌落形態來完成[15]。流感病毒的鑒定可應用克隆測序基因比對方法結合反轉錄聚合酶鏈式反應病毒載量檢測[31]。

2.5.3 肺部病理切片 肺部改變通常涉及肺氣道或肺實質。肺部切除后進行蘇木精-伊紅染色，并在顯微鏡下檢查病理學改變。氣道改變主要見于感染病毒的小鼠，管腔、黏膜上皮壞死或過度增生。多發性實質性灶伴肺泡發炎，肺泡上皮細胞肥大和增生，肺泡壞死和纖維蛋白沉積[15]。

3 討論

一直以來，流感的爆發是威脅世界衛生的主要因素，而流感后繼發細菌感染更是提高了肺炎致死率，其中以兒童、老人及體弱者尤為易感。流感病毒不僅嚴重危害了畜禽養殖業，并且對公共衛生安全具有巨大的潛在威脅。據WHO統計，2013年H7N9流感病毒爆發以來，目前已經造成1 567例人感染，其中死亡615人，致死率高達39.2%[32]。肺炎鏈球菌是引起繼發性肺炎的主要病原體。中醫在共感染動物實驗研究中，共感染模型動物可以選用BALB/c、CBA/J、C57BL/6小鼠，流感病毒則最宜采用流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，病毒滴度的測定可根據實驗室條件和實驗人員技術進行優化選擇，常用方法為TCID50和空斑實驗。細菌計數常用平板計數和麥氏比濁法。共感染造模方式為麻醉后滴鼻接種，接種時間的確定則根據研究目的而選擇。近幾年，有實驗采用氣管造模的方法，在霧霾環境下進行IV感染，在采用PM2.5氣管滴注聯合IV感染對小鼠進行造模后，其成模的顯著性高于單一IV感染[33]。造模將小鼠深度麻醉后懸吊，從前切牙成60°～70°，將一根鈍頭彎曲的18 g針頭插入氣管，懸浮于隆突上方，直接向肺中注入50 μL感染液。然后將小鼠的鼻孔阻塞，直到觀察到大喘氣[34]。此種方法研究結果更加準確，但難度較大，需要實驗人員熟練的技術配合。實驗中要注意病原劑量、小鼠致死率等問題。目前，國內外共感染動物實驗例數較少，還需要通過大量基礎實驗來驗證最優模型,同時有利于其他合并病原感染的研究，腺病毒與支原體等感染同樣是兒童常見重癥肺炎的原因[35]。流感和細菌共感染發病機制復雜，致死率高，成功構建共感染模型將為明確共感染發病機制、預防、治療重癥流感打下基礎。