Wnt/β-catenin信號通路與膝關節骨性關節炎軟骨代謝

丁小芬 周友龍 田明月 賈夢雅 李彥華 楊志孟

(河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046)

膝關節骨性關節炎是一種以軟骨破壞、軟骨下骨改變、骨贅形成及韌帶和半月板改變為特征，多見于老年人關節退行性疾病〔1〕，軟骨破壞是膝骨性關節炎主要的病理狀態〔2〕。膝骨性關節炎被認為是65歲以上人群致殘的主要原因，由于肥胖和人口老齡化，其發病率正在上升〔3〕。調查顯示，膝關節骨性關節炎60歲以上患病率達50%，在75歲以上人群中患病率高達80%，致殘率為53%，發病率的增加帶來了嚴重的醫學和社會問題〔4～6〕。Wnt信號通路是調節發育、生長、內穩態和疾病中的關鍵生物過程，特別是在關節和骨骼中，膝骨性關節炎的發病和嚴重程度與關節軟骨中Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路明顯相關〔7〕。本文通過Wnt/β-catenin信號通路探討膝骨性關節炎發生發展的分子機制、研究軟骨代謝對膝骨性關節炎的相關作用，為臨床診療提供支持。

1 Wnt信號通路

Wnt名字的由來：Wingless最早在果蠅中被發現，是可以導致翅膀組織缺失的基因。Int1基因發現位于小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)整合位點附近，且與Wingless基因具有同源性、功能相似，故將二者名字合并得名為Wnt〔8〕。Wnt信號轉導通路分為經典的Wnt/β-catenin信號通路、Wnt/Ca2+信號通路、Wnt/平面細胞極性(PCP)信號通路。近年來，學者發現研究最多的經典Wnt/β-catenin信號通路在膝骨性關節炎的發病過程中起到重要的作用〔9，10〕，與膝骨性關節炎患者軟骨細胞的分化、增殖和凋亡有關，此通路的異常會導致膝骨性關節炎的形成。

1.1經典Wnt/β-catenin信號通路的組成 經典信號通路是由細胞外的信號蛋白、細胞膜上的跨膜受體、內源性抑制劑、胞質蛋白、核內轉錄因子、下游靶基因組成〔11〕。其中信號蛋白是Wnt蛋白家族，該蛋白是一類廣泛存在的分泌型糖蛋白，已發現有19個成員，其中Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10a等已被證實參與β-catenin上游基因激活經典通路〔12～15〕；跨膜受體包括低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5/6、卷曲蛋白(Fzd)；胞質蛋白包括軸蛋白(Axin)、散亂蛋白(Dsh)、腺瘤性結腸息肉病基因(APC)、β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β；核內轉錄因子有T淋巴因子(TCF)和淋巴增強因子(LEF)；下游靶基因包括基質金屬蛋白酶(MMP)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、骨形態發生蛋白(BMP)等。Wnt通路特異性抑制物有分泌性Dickkopf相關蛋白(DKK)-1、分泌型FZ相關蛋白(sFRP)、Wnt抑制因子(WIF)、硬化蛋白(SOST)等〔16〕，Wnt/β-catenin信號通路的各靶點都至關重要，在生理調控方面起關鍵作用。

1.2經典Wnt/β-catenin信號通路的轉導 Wnt信號轉導是一種進化上保守的信號轉導途徑，控制發育的多個方面，包括細胞增殖、細胞命運決定、凋亡、細胞遷移和發育過程中的細胞極〔17〕。當細胞外存在Wnt信號通路特異性抑制物(如DKK-1、SOST、WIF1、sFRP等)時，Wnt蛋白無法與受體Frz和輔助受體LRP5/6結合，APC、GSK-3β、Axin三者形成的降解復合物與細胞質中的β-catenin結合，該降解復合物上的GSK-3β可使β-catenin磷酸化后通過泛素蛋白酶體途徑降解，導致細胞質中的β-catenin水平顯著降低；當不存在Wnt信號通路抑制物時，Wnt蛋白通過與膜上的跨膜受體Frz和LRP5/6結合，阻礙APC、GSK-3β和Axin三者形成降解復合物，從而抑制β-catenin的磷酸化，導致β-catenin在細胞質內聚集，當達到一定量時，β-catenin向細胞核內轉移與TCF/LEF轉錄復合物結合，該復合物作為轉錄激活因子可引起經典Wnt信號通路的靶基因表達，從而發揮調控作用〔18〕。在正常機體內，Wnt/β-catenin信號通路的抑制和激活同時存在，維持動態平衡，并與機體生長狀態相適應〔19〕。

2 Wnt/β-catenin信號通路與膝骨性關節炎軟骨代謝

Wnt/β-catenin信號通路的傳導在膝關節骨性關節炎期間調節軟骨細胞分化中起著重要作用〔20〕，該通路下游基因和蛋白表達可影響關節軟骨生長代謝，與關節軟骨損傷相關〔21〕，這一經典途徑的激活，已被認為參與膝骨性關節炎的加重〔22〕。

2.1DKK-1 DKK是Wnt/β-catenin信號通路的信號抑制劑，經典的Wnt拮抗家族，可與跨膜受體LRP5/6結合，阻止細胞外Wnt蛋白的配體作用，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉導〔23〕。DKK-1是一種分泌性糖蛋白，是Wnt/β-catenin信號通路上游的主要抑制因子之一，可以抑制骨形成〔24〕。Oh等〔23〕觀察到無論是通過關節內注射表達DKK-1的腺病毒(AdDKK-1)還是在軟骨細胞特異性DKK-1轉基因小鼠的背景下，關節軟骨中DKK-1的過度表達對包括關節軟骨破壞、骨贅形成和軟骨下骨硬化在內的膝骨性關節炎發病都具有保護作用，且DKK-1的抑制作用與其抑制Wnt介導的分解代謝因子(如MMP-13)在關節軟骨細胞中的表達能力有關。Sassi等〔10〕使用DKK-1處理的去分化人類關節軟骨細胞模型，研究結果顯示成纖維細胞樣形態出現延遲，表明DKK-1能起到抑制膝骨性關節炎發生發展的作用。Funck-Brentano等〔25〕發現DKK-1可能通過介導的Wnt/β-catenin信號通路，抑制β-catenin移位進入細胞核，控制軟骨下骨的激活，降低骨贅的破壞生成，導致膝骨性關節炎的嚴重程度降低。

2.2Wnt3a Wnt蛋白是Wnt/β-catenin信號通路的啟動因子。Wnt信號的穩態水平對干細胞增殖、軟骨細胞分化和功能至關重要，該信號在膝骨性關節炎關節組織中上調，并驅動骨分化、軟骨降解、軟骨細胞肥大和炎癥〔26〕。在哺乳動物中，鑒定出19種Wnt蛋白，小鼠Wnt3a蛋白是第一個具有生化特性的蛋白〔10〕。Liu等〔27〕發現正常運動誘導膝骨性關節炎和損傷運動誘導膝骨性關節炎大鼠模型中，Wnt3a和β-catenin蛋白水平增加，Ⅱ型膠原減少。Wnt3a是Wnt/β-catenin信號通路典型的、特征良好的激活劑，在關節炎中有既定的作用，并且在關節軟骨中表達〔28〕。Thomas等〔29〕研究發現在Wnt3a刺激的軟骨細胞中分解代謝蛋白酶(MMP、ADAMTS-4和5)的表達上調，促進細胞外基質(ECM)的降解；Wnt3a會誘導MMP13基因在小鼠原代軟骨細胞中快速表達，導致骨關節炎樣表型〔30〕；Lietman等〔31〕也發現Wnt3a略微增加了人軟骨細胞中MMP-13的表達。Bouaziz等〔32〕發現Wnt3a可通過增強β-catenin到細胞核中的易位來增加Wnt/β-catenin的轉錄活性，增強分解代謝物(ADAMTS-4和5、MMP3、MMP-13)的表達。

2.3β-catenin β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的核心元件〔33〕，在軟骨細胞的分化、成熟、凋亡中發揮重要作用，細胞中β-catenin表達多少決定著經典Wnt信號通路是否被激活〔34〕。Zhu等〔35〕發現成年小鼠關節軟骨細胞中β-catenin的激活導致MMPs的明顯增加，引起ECM降解，軟骨細胞過早分化并發展成膝骨性關節炎樣表型。Zhou等〔36〕發現條件性激活β-catenin信號的轉基因小鼠表現出嚴重的軟骨變性、軟骨下骨侵蝕和骨贅形成。Held等〔37〕通過對β-catenin進行染色，測試該蛋白是否作為典型Wnt信號轉導的突出效應器，實驗觀察到隨著膝骨性關節炎分級的增加，β-catenin染色增加，這證實了人膝骨性關節炎軟骨中典型Wnt信號的激活。Bouaziz等〔38〕發現阻斷β-catenin/TCF的相互作用，能夠減輕小鼠的膝骨性關節炎表型并下調MMP-13的表達。研究表明〔39，40〕，β-catenin缺失的軟骨細胞降低了骨保護素的表達或增加了核因子(NF)-κB配體的受體激活因子的活性，導致破骨細胞形成增加，小梁骨形成和重塑減少。

2.4MMP-13 MMPs是一種蛋白水解酶，是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因。在人類MMP家族中至少有26種類型的分子，與正常軟骨相比，MMP-1、MMP-3、MMP-13和MMP-28在膝骨性關節炎軟骨中的表達明顯增強，特別是MMP-13在軟骨破壞中發揮中心作用〔2〕。MMP-13是在對乳腺癌組織研究時被發現與鑒定出來的，其在正常組織中不表達，而在膝骨性關節炎軟骨細胞中有高表達〔41〕。MMPs主要參與膝骨性關節炎中ECM的分解，其表達增加與膝骨性關節炎的進展密切相關，在這些MMPs中，MMP-13通過降解ECM被認為在膝骨性關節炎的進展中發揮關鍵作用，例如Ⅱ型膠原的降解，這是ECM的主要組成成分〔42〕。Yuasa等〔43〕發現Wnt3a激活Wnt/β-catenin途徑后，兔關節軟骨中的MMP-3和MMP-13的基因表達增加。先前的一項研究還發現，轉基因小鼠中MMP-13的高表達水平可導致膝骨性關節炎樣病理改變的出現〔44〕，Wnt/β-catenin信號通路在這一過程中起重要作用，β-catenin的過度表達可導致MMP-13基因表達增加，從而導致軟骨基質降解〔27〕。因此，抑制MMP-13的表達可能給予軟骨保護，這在膝骨性關節炎的治療中具有治療價值〔45〕。

3 中西醫調控Wnt/β-catenin信號通路與膝骨性關節炎軟骨代謝

Wnt/β-catenin信號通路的轉導是調節膝骨性骨關節炎發展的獨特信號通路，參與了膝關節骨性關節炎的發病機制〔46〕。越來越多的研究者通過大量的實驗，用不同的干預方法證實了Wnt/β-catenin通路與膝骨性關節炎有著特殊的聯系。

3.1中醫療法 顏春魯等〔47〕研究發現大劑量右歸丸干預后，能夠有效促進膝骨性關節炎模型組大鼠DKK-1mRNA和蛋白的表達，抑制WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5 mRNA和蛋白質表達，進而推測右歸丸可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路起到治療膝骨性關節炎的目的。還發現富硒黃芪皂苷的治療機制可能是通過升高DKK-1基因和蛋白的表達，降低WISP1、β-catenin、LRP5基因和蛋白的表達，實現對膝骨性關節炎的治療作用〔48〕。何曉娟等〔49〕研究結果顯示跳骨片治療膝關節骨性關節炎可能通過上調GSK-3β的表達、下調β-catenin、Frizzled-2的表達，調控Wnt/β-catenin信號通路，達到保護關節軟骨的作用。Zhong等〔50〕發現青蒿素通過抑制白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α和MMP-13等促炎趨化因子和細胞因子的表達，在IL-1β誘導的大鼠OA軟骨細胞和OA患者來源的細胞中顯示出強大的抗炎作用。鄺高艷等〔51〕研究發現加味獨活寄生合劑治療膝骨性關節炎的作用機制可能與調控Wnt信號通路有關，通過抑制炎癥反應，從而減輕疼痛，改善膝骨關節功能。馬勇等〔52〕研究初步證明了姜黃素對軟骨細胞的保護作用是通過調控Wnt/β-catenin信號通路，從而促進正常軟骨細胞增殖，中藥姜黃具有抗骨關節炎作用，是因為姜黃素是有效成分之一。張媛媛等〔53〕通過電針“內膝眼”“犢鼻”可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉導，降低下游靶基因MMP-13的表達，從而抑制軟骨基質的降解和軟骨細胞的凋亡，起到延緩膝骨性關節炎發展進程的作用。周偉等〔54〕在對活血膏作用于膝骨性關節炎作用機制探討中發現膝骨性關節炎發病后的確存在Wnt/β-catenin信號通路被激活，抑制該通路過表達是治療膝骨性關節炎的關鍵，發現活血膏可明顯抑制這一過程。

3.2西醫療法 Yu等〔55〕發現辛伐他汀可以緩解膝骨性關節炎相關的疼痛，抑制OA患者的Wnt/β-catenin信號轉導，該信號通路途徑的調節在辛伐他汀誘導的軟骨細胞分化的調節中起重要作用。Xu等〔56〕通過研究首次證明聚半乳酸通過抑制Wnt/β-catenin和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路抑制大鼠軟骨細胞MMPs的表達和軟骨細胞的炎癥反應，表明聚半乳酸可以作為OA的治療劑。姜鵬等〔57〕研究發現關節腔注射臭氧后膝關節軟骨β-catenin和MMP-13表達降低，臭氧可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活治療膝關節骨性關節炎。吳小川〔58〕探討阿侖膦酸鈉治療膝骨性關節炎作用機制發現Wnt/β-catenin可與骨保護素(OPG)/NF-κB受體活化因子(RANK)/RANK配體(RANKL)等信號通路共同作用于軟骨細胞軟骨下骨，并影響下游MMP-13、β-catenin及Ⅱ型膠原蛋白的表達，起到治療膝骨性關節炎的作用。

綜上，近年來，學者們主要著眼于細胞因子水平的研究，調控內環境穩態的眾多信號通路成為研究的熱點，炎癥介質、生長因子和不同的信號通路可能同時參與了這個過程并相互影響，如Wnt、NF-κB、MAPK、OPG/RANK/RANKL、Notch等信號通路〔59，60〕與膝骨性關節炎的發病關系均可查到相關文獻，為進一步闡明膝骨性關節炎的發病機制奠定了基礎。開發選擇性地針對該途徑的關鍵調控因子，作為治療膝骨性關節炎等許多骨疾病的新治療方式的基礎療法似乎具有很大潛力，并且在這方面的動物實驗已經取得了一些進展。雖然動物實驗對于闡明Wnt信號轉導調節軟骨生物學和病理學的細胞和分子機制至關重要，但人類生物學方面的多樣性和復雜性遠遠高于其他生物，人類是高級生物，因此，我們不應該高估動物實驗的結果，應該謹慎地將這些發現應用于人類。我們已經了解到該途徑在骨生物學的許多方面發揮的核心作用，但還需要更細致的了解Wnt/β-catenin信號通路在生理和病理環境下是如何運作的，才能尋找出該通路上最有效增強劑或抑制劑來治療膝骨性關節炎。