逍遙散類方治療肝癌的研究進展

李卓嫻 徐麗靜 夏猛

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發病率居全球惡性腫瘤第三位,具有起病隱匿、發病率高、致死率高、術后復發率高、預后差、生存率低的特點。世界衛生組織估計到2030年全球將有超過100萬的人死于肝癌。目前治療肝癌的方法主要有移植、切除、射頻消融、靶向藥治療等,但肝癌患者仍面臨著高死亡率、高復發率、耐藥性及嚴重副作用等問題。因此,尋求低毒、耐藥性小的肝癌治療策略仍是當前亟待解決的關鍵問題。肝癌屬于中醫學“癥瘕”“鼓脹”等范疇,從臨床證型看,肝郁脾虛型是其重要的一類證型。逍遙散出自《太平惠民和劑局方》,以疏肝解郁、健脾養血作用見長。目前用于治療肝癌的常見逍遙散類處方有黑逍遙散、加味逍遙散、四逆散、加味四逆散、肝積方、丹梔逍遙丸、柴胡疏肝散、逍遙丸等,這些處方對肝癌的細胞增殖、免疫功能、神經系統、肝功能以及腸道菌群調節等方面均具有干預作用。本文通過檢索相關的研究文獻,對以上功能和作用進行了搜集和整理,總結如下。

1 逍遙散類方對肝癌腫瘤細胞的影響

1.1 阻滯細胞周期抑制肝癌細胞增殖

細胞凋亡是由細胞內基因及其產物調控發生的一種程序性細胞死亡,阻滯細胞的周期進程可抑制細胞的增殖及誘導凋亡,對肝癌治療具有著重要意義。逍遙散主要成分姜黃素作用于肝癌細胞SMMC7721、Huh-7,誘導其S期細胞增加以及G0-G1期細胞減少,阻滯肝癌細胞的正常周期,顯著減少細胞增殖[1-3]。不同劑量的四逆散含藥血清處理肝癌HepG2細胞后發現[4],隨著劑量的濃度增加,G1期細胞隨之增加,G2期隨之減少,使肝癌細胞滯留于G1期,阻滯其細胞周期,抑制肝癌細胞的增殖,其中方中所含的山奈酚活性成分發揮著顯著作用[5]。山奈酚是多種疏肝藥物的重要成分之一,如白芍、梔子、甘草、柴胡、丹皮等疏肝重要中均含有該成分,而這幾種藥物也多包含在逍遙散類方中,說明逍遙散類方治療肝癌的重要機制之一可能與方中疏肝類藥物的活性成分山奈酚有關。

1.2 調控Ca2+信號誘導肝癌細胞凋亡

細胞間的信號傳導可作為腫瘤發生關鍵環節之一[6],Ca2+作為參與調節多種神經細胞功能活動的信使,Ca2+失衡會引起神經元損害并成為“最后共同通路”導致細胞死亡[7]。加味逍遙散對離體的肝癌SMMC-7721細胞的增殖具有較強抑制作用,且具有明顯的濃度依賴性[8],其由調控Ca2+凋亡信號從而調節與其相關敏感的關鍵酶誘導凋亡,以此抑制肝癌細胞增殖并誘導凋亡。另有研究表明,黑逍遙散及逍遙散中也存在著調控Ca2+信號的功能[9-10]。目前對于此方面的研究在逍遙散類方中還較少,但從已有研究表現出的效果看,逍遙散類方對其作用確切,但具體是什么成分對其發揮作用、其機制如何尚有待深入探討。

1.3 調控癌基因、抑癌基因誘導肝癌細胞凋亡

Bcl-2癌基因家族具備抑制細胞凋亡的作用,Bcl-2與Bax的聚合抑制Bcl-2的活性從而促進了細胞的凋亡。四逆散可使Bcl-2表達下降,Bax、Caspase-3、Caspase-9及Cyt-c表達升高,誘導肝癌細胞凋亡、抑制其增殖[4];肝積方也可通過調節Bcl-2癌基因家族并激活Caspase-3,誘導線粒體途徑發揮促細胞凋亡作用,最終抑制肝癌細胞的增殖并發揮抑瘤作用[11-15]。TP53為與人類半數腫瘤相關的基因,其所表達的P53蛋白可抑制腫瘤細胞的生長,促進腫瘤細胞的凋亡。四逆散中所含的槲皮素誘導TP53抑癌基因導致G2/M細胞周期阻滯,從而推動了細胞凋亡進程[5];運用其干預移植性肝癌裸鼠可使肝癌裸鼠腫瘤組織中Sirt1蛋白表達減少,p53乙酰化程度增加,經SIRT1/p53信號通路途徑[16-18],促進人肝癌HepG2細胞凋亡。逍遙散類方對于肝癌細胞凋亡的誘導和作用機制研究目前較為普遍,也基本成為評價逍遙散類方是否具有抗癌作用的有效評價指標之一。

1.4 調控血管生成因子,抗腫瘤血管生成,抑制肝癌細胞侵襲

腫瘤細胞的血管是腫瘤細胞獲得血氧、營養的重要通道,抗腫瘤血管生成可通過抑制血管的生存和數量,抑制腫瘤細胞的生長、轉移從而發揮抗癌作用[19-20]。使用加味四逆散干預治療H22腹水瘤小鼠與S180實體瘤小鼠,實驗結束后檢驗其血清中血管內皮生長因子的濃度水平并觀察經蘇木精—伊紅染色的腫瘤病理組織切片發現,加味逍遙散可降低模型小鼠血清血管內皮長生因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)濃度,減少肝癌組織內微血管的密度、數量,抑制腫瘤組織血管生成[21];逍遙散也可下調VEGF表達,抑制血管的生成并干預原發性肝癌[22]。肝積方作用于肝癌的差異基因包含與血管生長因子相關的早期生長反應基因-1,抑制腫瘤血管生成為肝積方作用于肝癌的重要機制之一[23]。

在抑制肝癌進展的過程中,抑制肝癌細胞的增殖、分化、侵襲以及促進凋亡發揮著重要作用,是抗肝癌的重要機制之一。聚焦于對肝癌腫瘤細胞的影響,對探究逍遙散類治療肝癌的具體作用機制具有重要意義。根據上述文獻得知,目前對逍遙散類方影響肝癌細胞的機制研究多匯聚在通過阻滯細胞周期,調控Ca2+信號、癌基因Bcl-2、抑癌基因TP53、血管內皮長生因子等方面發揮抑制肝癌細胞增殖、侵襲,促進其凋亡的作用,缺乏對其他影響肝癌細胞機制的研究,如肝癌細胞自噬[24]、黏附[25]、鐵死亡[26]、焦亡[27]等。逍遙散類方通過影響肝癌細胞治療肝癌層面的研究仍有許多未涉及的區域,有待各學者進一步的探索、發掘以及驗證。

2 逍遙散類方對免疫機制的調節作用

2.1 調控炎性細胞因子

細胞因子是一類具有調控細胞免疫激活、生長、分化作用的小分子或蛋白質物質,其中參與炎性反應的稱炎性細胞因子,包含白細胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等,可調節腫瘤微環境,參與腫瘤過程。使用四逆散加味治療肝郁肝癌模型大鼠,實驗結束后制備脾細胞懸液測定IL-2、γ-干擾素的活性,四逆散加味治療可增強肝癌大鼠脾淋巴細胞產生IL-2、γ-干擾素的能力,提升機體免疫功能[28];可提升肝癌荷瘤小鼠的TNF-α、IL-12、IL-6含量水平,提升脾臟指數,提高肝癌裸鼠模型的免疫力,發揮抗腫瘤免疫力的調控功能[16]。加味四逆散也同樣具備著調節免疫機制的作用,由提高肝癌荷瘤小鼠的IL-2活性而發揮作用[21]。此方面研究說明,在發揮抗腫瘤過程中,逍遙散類方對調節炎癥狀態具有作用,這可能也是中醫藥在臨床發揮抗腫瘤,改善患者生存質量的機制之一。

2.2 調節淋巴細胞亞群

淋巴細胞作為機體重要的免疫細胞,可分為T、B、NK細胞三大類,而淋巴亞群作為機體免疫功能及狀態平衡反映的重要指標,參與免疫過程,反映免疫狀態。加味四逆散可通過提高NK細胞增殖活性、T淋巴細胞活性,發揮調節免疫機制的作用[21]。四逆散提高肝癌大鼠的脾T、B淋巴細胞增殖能力,提高肝癌大鼠的免疫功能[28]。由肝積方進一步加工制成的疏肝清熱消積顆粒可通過調節CD4+、CD8+,增加肝癌荷瘤小鼠的T淋巴細胞增殖并刺激總T淋巴細胞的生長,發揮改善免疫的作用[29]。

在機體出現腫瘤時,免疫系統可迅速識別、清除微環境中的腫瘤細胞,免疫功能在抑制腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用。大量臨床研究發現,放、化療或其他介入療法的治療在殺滅腫瘤細胞的同時會損傷機體的免疫功能,逍遙散類方治療肝癌可有效增強肝癌患者的免疫功能,對增強機體抗腫瘤免疫能力及殺滅腫瘤細胞具有重要意義。但現階段對逍遙散類方發揮免疫機制調節治療肝癌的研究多集中于臨床研究,基礎研究鮮見,且多于進行其他作用機制研究時發現,對于逍遙散類方通過調節免疫機制發揮肝癌治療作用的相關研究較少,且多匯集于調控炎性細胞因子、淋巴細胞亞群方面,深入研究逍遙散類方通過調節免疫機制發揮肝癌治療作用的具體機制,為臨床運用提供新思路,以期提高肝癌患者的生存質量。

3 逍遙散類方對神經系統的調節作用

3.1 對單胺類神經遞質的調節作用

單胺類神經遞質為中樞神經遞質中的一種,其重要組成包括5-羥色胺及多巴胺等,當其神經元功能下降時會導致快感缺乏出現絕望、焦慮行為,與抑郁等精神疾病密切相關[30]。加味逍遙散提高肝癌大鼠腦內多巴胺、5-羥色胺等單胺類神經遞質水平,發揮調節神經系統的作用[31]。柴胡疏肝散、四逆散同樣具備著調節神經系統的作用,可下調抑郁小鼠模型大腦、肝臟、結腸中犬尿氨酸/色氨酸比值及上調肝臟中5-羥色胺/色氨酸比值,由調控色氨酸的代謝進而調節神經遞質發揮其抗抑郁作用[32]。臨床上,肝癌患者多伴有嚴重的情緒障礙,出現抑郁、焦慮等,逍遙散類方在調節患者情緒方面,具有疏肝解郁、調暢情志的作用,從其作用機制看,逍遙散類方對興奮性神經遞質的上調作用,可能正是其既能抗癌,又能改善患者情緒的重要原因之一。

3.2 調節神經營養因子

腦源性神經營養因子 (brain-derived neurotrophic factor,BDNF)具有修復、再生神經的功能。慢性應激及促抑郁的造模手段會導致海馬BDNF的減少、神經元凋亡的增加以及再生能力的受損。神經營養因子3則為最有效的神經支持因子之一,可促進神經元的發育、存活以及修復。逍遙散不但可降低由慢性應激所誘發的肝癌標志物甲胎蛋白水平的上升,預防由慢性應激所誘發的肝癌的早期發生[33-34],還具有保護神經系統、規避應激的作用,可恢復由慢性束縛應激所導致的神經營養因子BDNF的減少,并增加神經因子3表達,從而發揮保護神經系統的作用[35];還可增強抑郁小鼠海馬中神經營養因子BDNF的表達水平,恢復抑郁小鼠海馬中的神經損傷[36]。

在肝癌的治療過程中,中醫藥可發揮整體調節的作用。抑郁作為肝癌的一個重要并發癥,中醫藥可干預抑郁、焦慮等情緒問題,在臨床治療肝癌中運用疏肝解郁之法,對改善肝癌患者情緒、提高生活治療、延長生存期具有重要意義。除調節單胺類神經遞質、神經營養因子外,中醫藥還具有通過調節下丘腦—垂體—腎上腺軸、血管內皮生長因子以及相關的信號通路等調節神經系統并輔助治療肝癌的作用機制[37],但目前對逍遙散類方通過上述機制發揮神經系統調節并輔助治療肝癌的研究尚未見報道,仍有待進一步研究。

4 逍遙散類方可以抗氧化應激及控制炎癥反應,保護肝功能

4.1 調節相關抗氧化酶

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶均屬于抗氧化酶,可以降低機體氧化速度,降低氧化損傷對機體造成的傷害。機體清除氧自由基的能力常由超氧化物歧化酶活力間接反映,機體受自由基損傷程度則常由丙二醛含量間接反映。谷丙轉氨酶與谷草轉氨酶的顯著上升證明了肝臟的受損,通過減低二者的水平可發揮護肝作用。逍遙散可降低血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性并增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平,同時降低丙二醛的含量,經抗氧化應激而發揮護肝作用,其減輕氧化應激的損傷并發揮保肝作用[38-39],對肝功能具有一定的保護及修復作用[40],并具有一定濃度依賴性[41]。四逆散及加味四逆散也具備肝臟保護的作用[42-43],同樣由下調應激大鼠血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶表達水平來改善肝損傷[44-45]。逍遙散類方在肝癌的治療中往往表現出對肝臟的保護作用,其具體作用機制與調節抗氧化酶,抗氧化應激密切相關。

4.2 激活核因子E2相關因子2信號通路

核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2 related factor2,Nrf2)是胞外生物與氧化應激的主要協調者之一,可通過抗氧化響應元件(antioxidant response element,ARE)的結合來調節相關抗氧化、抑炎基因進而發揮調控氧化應激的作用[46]。逍遙散可激活Nrf2-ARE信號通路來發揮其抗氧化應激的作用[47],其對氧化應激的對抗作用還可通過激活Nrf2的上游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路并激活Nrf2-Keap1信號來改善氧化應激狀態[48]。Nrf2信號通路是抗氧化應激的重要通路之一,但目前逍遙散類方對于Nrf2信號通路的研究較少,仍有待挖掘。

4.3 抑制一氧化氮水平

一氧化氮(nitric oxide,NO)參與宿主的防御及免疫并調節炎癥反應,宿主在對病毒、細菌感染的反應中,NO會過量表達并通過促氧化應激促進某些發病機制,阻滯NO釋放從而抗氧化應激是阻滯炎癥損傷細胞、誘發肝損傷的重要方法之一。丹梔逍遙丸基于其方中組成中藥的藥物特性而具備抗氧化活性及NO抑制相關的抗炎特性[49]。四逆散可顯著降低應激負荷肝損傷小鼠肝組織中的NO水平[50]。

肝癌的治療除抑制腫瘤細胞的生長外,還可以通過保護自身肝臟功能發揮治療作用。中醫藥參與肝癌治療,可發揮緩解術后癥狀、保護肝功能、降低術后不良反應的發生率等多種作用。逍遙散類方可通過調節抗氧化酶、激活Nrf2信號通路以及抑制NO水平發揮抗氧化應激及控制炎癥反應從而保護肝功能的作用。

5 調節益生菌的豐度,恢復腸道菌群的構成

逍遙散可以增加腸道中梭菌綱、Faecalibaculum屬豐度,降低Muribaculaceae科的豐度,使有益菌豐度增加、致病菌豐度減少[51];還可以升高擬桿菌科Bacteroidaceae的豐度,恢復腸道微生物的多樣性,發揮調節腸道菌群的作用[52-53]。逍遙丸的主要成分芍藥苷可增加益生菌的豐度并調節腸道菌群的組成[54]。逍遙散及其拆方可保護菌群的構成及多樣性,部分恢復腸道菌群的正常結構,當健脾藥物被去掉時逍遙散對肝臟的保護作用會被減弱[55]。

最近幾年的研究表明,腸道在肝癌的治療過程中表現出良好的作用,人體腸道中正常菌群可形成保護屏障抵御病原體,而腸道菌群的失調會導致多途徑的推動肝癌的發生與發展,通過改善腸道菌群可起到改變甚至逆轉肝癌進展的作用。逍遙散類方可以通過調節益生菌的豐度來恢復腸道菌群的構成,但其如何通過調控腸道菌群來發揮肝癌治療的具體作用機制尚未見報道,仍待深入研究。

6 結語

逍遙散類方是一類以調和肝脾、疏肝解郁為主旨,在逍遙散基礎上隨證化裁衍化出來的方劑。逍遙散類方兼具備能疏肝解郁、健脾養血的特點,可廣泛應用于肝癌的現代臨床治療中。此類方藥在肝癌的臨床治療中,不但表現出抑制肝癌細胞的增殖與侵襲、促進肝癌細胞凋亡、修復患者免疫功能,對神經、肝功能的保護作用,而且還表現出對腸道菌群的調節作用。這充分的說明了逍遙散類方在抗癌過程中具有多靶點、多環節、多層次的綜合抗癌作用。但從目前的研究看,大部分的研究只從抑制腫瘤生長、侵襲、免疫等方面的某個環節入手,未能真正從網絡整體效應機制入手,并不能真實詮釋或揭示逍遙散類方的整體機制,也沒有真正體現其中醫功能特點。從以上文獻結合逍遙散類方本身的功能特點看,其疏肝解郁作用很可能與對神經功能的保護作用有關,如逍遙散、加味逍遙散均顯示出對BDNF和5-羥色胺水平的提升作用,正恰合了其對情志病證的調節作用。其健脾養血作用,則可能與對腸道菌群的調節作用以及對腫瘤血管的抑制作用(抑制腫瘤血管而達到促進全身血液運行的作用)有關,如逍遙散、肝積方等對VEGF及早期生長反應基因-1具有重要的調節作用。其抗癌作用則大多是通過抑制肝癌細胞生長、調節免疫功能實現。這些數據表明,在肝癌的治療過程中,逍遙散類方雖然具有一定的抗癌作用,但其主要的功能更多是對全身整體功能的調控而實現,在臨床及實驗研究中還需要通過整體網絡作用來全面闡釋其抗癌靶點和效應機制。