炎癥性腸病中微小RNA的功能及臨床研究進展

朱鵬 覃剛 吳莉莉

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)是臨床上常見的慢性胃腸道炎癥性疾病，流行病學資料顯示在歐美發達國家地區IBD的總體發病率約為0.3%，在我國部分城市及地區的IBD發病率也呈逐年上升趨勢，導致了嚴重的衛生及社會負擔[1-3]。IBD主要包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)兩大類型，就病變范圍而言，UC所致病變僅局限于結腸，而CD則可累及胃腸道的任何部位。IBD常見的臨床癥狀表現為腹瀉、便血、疼痛等，嚴重的IBD可能并發腸道穿孔及梗阻，并可能合并一些腸道外并發癥且累及多個重要臟器，如強直性脊柱炎、硬化性膽管炎、結節性紅斑等[4]。IBD病程通常遷延不愈，均需要長期甚至終身治療，未得到有效控制的IBD可增加腸道惡性腫瘤的發病風險，給患者造成嚴重的疾病負擔[5]。IBD的致病機制十分復雜，腸道的炎癥性免疫應答反應在致病中發揮核心作用，其他如遺傳、環境、感染等因素均可能增高IBD的發病幾率[6,7]。對于IBD時機體的免疫調控機制的深入闡述一直是臨床研究的熱點，也是尋找IBD治療方法的重要突破點。微小RNA(microRNA，miRNA)是僅包含21～23個核苷酸序列的單鏈RNA分子，miRNA本身并不具有翻譯蛋白質功能，其可以直接結合到特定靶標基因的3’-非編碼區(3’-untranslated regions，3’-UTRs)并抑制靶基因的轉錄及相應功能蛋白的翻譯，從而實現對機體各種生理病理過程的調控功能[8]。特定的miRNA可能存在多個靶基因，而特定的靶基因則可被多個miRNA調控，因此miRNA與靶基因之間形成了復雜的信號調控體系。研究顯示，在IBD中存在多種miRNA的表達異常，這些miRNA并通過特定的信號通路參與對腸道炎癥免疫應答的調控，從而對IBD的致病及進展產生影響[9,10]。隨著分子生物學檢測技術的不斷發展，miRNA的檢測也更為便捷，而且檢測成本也在逐步降低，其作為IBD疾病診斷及預后無創評估指標的價值也逐步得到研究者的重視。此外，基于細胞及動物模型的研究結果也顯示出靶向特異miRNA的IBD治療方法具有潛在的療效，為開發更為安全有效的IBD治療新型藥物提供了重要參考。因此，本文對miRNA在IBD中的功能作用及相關臨床研究最新進展進行了簡要綜述。

1 miRNA參與IBD的致病調節

腸道組織的炎癥性免疫應答反應在IBD的致病中發揮核心作用，同時免疫炎性反應也受到多方面因素調節，不同的免疫細胞因子在其中形成復雜的調控網絡及信號通路[11]。人體內miRNA分布廣泛，研究顯示，特異性的miRNA通過影響特定靶基因的表達參與了IBD時的機體免疫及炎癥應答，從影響IBD的致病及進展過程[12]。一方面，miRNA參與了CD的致病過程，如Mohammadi等[13]研究使用mRNA芯片檢測了IBD患者(n=120)外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中共計74種miRNA的表達情況，結果顯示，與健康對照相比，CD患者存在10種miRNA表達升高；與UC患者相比，CD患者存在7種miRNA表達升高，其中升高最為顯著的是miRNA-874-3p。既往的研究也顯示，miRNA-874-3p的直接靶向調控基因是自噬相關樣-16-L1(autophagy related 16-like 1，ATG16L1)基因，ATG16L1基因及其編碼的自噬相關蛋白16-1能夠參與多個炎癥相關信號通路的調控，從而對CD的致病發揮重要的調控功能[14-16]。Zhao等[17]研究也發現，CD患者的結腸炎癥組織中的miRNA-124表達程度存在異常升高，且與芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)蛋白的表達水平存在負相關。基于Caco-2及HT-29細胞的功能實驗顯示，miRNA-124可以直接靶向結合到AHR的3-UTR，從而抑制AHR(AHR可與特異配體結合后啟動腸道炎癥應答通路)的表達，并對腸道炎性因子的表達進行調節，促進CD發生[17,18]。Lin等[19]研究也顯示，CD患者發生炎癥的腸道組織中的miRNA-143表達顯著升高，而ATG2B蛋白的表達則存在顯著降低。熒光素酶分析顯示，miRNA-143可以靶向結合自噬相關蛋白同源體2(autophagy-related protein 2 homolog B，ATG2B)基因的3-UTR，從而抑制ATG2B表達，干擾腸道上皮細胞正常的自噬作用，增強腸道組織的局部炎癥。

另一方面，針對UC的研究也發現，特異性miRNA的表達異常與UC的發生及發展存在重要的相關性。相關的研究方面，如Zhou等[20]發現，與健康對照組相比，UC及CD患者的糞便中的miRNA-16-5p表達水平均顯著升高，而miRNA-21-5p僅在UC患者中升高。生物信息學軟件分析顯示，6個靶基因可能是miRNA-16-5p及miRNA-21-5p的下游靶基因，包括PIK3R1、GRB2、SUZ12、NTRK2、Smurf2及WWP1，而這些功能基因及其表達的功能蛋白則與腸道局部炎癥及腫瘤變性存在重要相關性。Johnston等[21]基于葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulphate，DSS)誘導的UC小鼠模型的研究顯示，與野生型小鼠相比，敲除miRNA-21表達的小鼠腸道16S rRNA(反映腸道菌群構成差異)表達存在顯著差異，且更容易發生腸道菌群紊亂和UC，結果提示miRNA-21可能通過影響腸道菌群的定植來促進IBD的發生。功能分析顯示，miRNA-21主要可以通過調節PTEN/NF-κB信號通路表達來影響腸道炎性反應及細菌的定植，從而發揮上述功能作用。而Hou等[22]也發現，DSS誘導的UC小鼠模型的miRNA-155表達顯著升高，而miRNA-155的靶標基因Est-1表達則顯著降低，增強miRNA-155的表達可加重UC癥狀及結腸炎癥。同時，此項研究還發現結腸炎性組織中IL-23/17/6等Th17相關炎性細胞因子和Th17細胞均顯著增多，提示了miRNA-155可能靶向抑制Est-1表達來調節IL-23/17/6相關的Th17細胞通路，從而誘導UC的發生。流行病學資料也顯示，UC及CD均是腸道惡性腫瘤的風險因素，腸道長時間的慢性炎癥損害與惡性腫瘤的發生存在重要聯系，但是UC及CD患者進展為腸癌的相關機制目前仍未完全闡明，miRNA在其中的作用也仍不清楚，現有的研究也只是基于某個單一信號通路的表達異常來嘗試解釋IBD與腸道惡性腫瘤之間的關系[23]。相關的研究方面，如Wang等[24]研究發現，與正常結腸組織相比，IBD相關結腸癌小鼠模型模型及人類結腸癌組織的癌組織中miR-29a-5p表達程度顯著升高，并伴隨著IL-6及STAT3激活。因此，研究者認為miR-29a-5p/STAT3信號軸可能在炎癥相關結腸癌的發生發展中發揮重要作用，miR-29a-5p/STAT3正反饋環路可能放大炎癥作用，這一作用主要是通過抑制DNA羥甲基化酶10-11轉位蛋白(TET)的表達來實現，并最終導致IBD相關結腸癌的發生。Liu等[25]基于小鼠動物模型的研究也顯示，UC小鼠的腸道組織中miRNA-155的表達顯著升高，同時缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)蛋白表達則顯著降低，功能分析顯示HIF-1α是miRNA-155的靶向調控蛋白。此外，有大量的研究也顯示HIF-1α在包括結直腸癌在內的多種惡性腫瘤的發生中有著重要的調控作用，miRNA-155也通過對HIF-1α表達的影響來參與UC向結直腸癌的進展[26-28]。

上述研究結果均提示了特異的miRNA通過特定的調控途徑參與了IBD的致病及進展，然而目前的研究方法仍僅能從較為片面(針對單個或數個miRNA)的角度反映miRNA在IBD中的功能，但是參與腸道炎癥調控的分子通常都是以復雜的信號通路及調控網絡的形式來發揮相應的作用，在這方面的研究方法及證據還較為匱乏[29]。下步還需更深入的研究和更豐富的數據來進一步闡釋多類miRNA相關的信號調控網絡在IBD中的作用機制。

2 miRNA用于IBD的診斷評估價值

消化道內鏡及基于腸鏡的腸道活組織檢查仍是臨床上診斷IBD的金標準，但腸鏡檢查屬于侵入性操作，作較為復雜，且對設備、操作人員有一定要求，不便于在大規模人群中進行篩查診斷，且部分患者(如高齡、病變位置較高、腹腔感染、腸粘連等)無法耐受檢查，限制了內鏡在IBD診斷評估中的應用[30,31]。無創生物學指標具有檢測方便且易于重復的優點，其在IBD的篩查診斷中具有特殊的臨床價值。但是目前臨床上并沒有用于診斷及評估IBD較為可靠的無創生物學指標，學者也一直在探索準確的無創生物學指標來用于IBD的診斷、評估及預后判斷。基于特異性miRNA在IBD相關炎癥病變中的存在重要調控作用及表達異常，將其應用于IBD的臨床診斷評估也得到了研究者的關注[32]。

一方面，大量的數據顯示，特異miRNA的表達水平與IBD患者的疾病嚴重程度存在顯著相關性，其可能作為IBD嚴重程度的評價指標。如Ji等[33]研究納入117例IBD患者(UC，66例；CD，51例)，患者糞便中的特異性miRNA表達程度與IBD的嚴重程度存在相關性。在活動性UC患者中，miRNA-1226、miRNA-548ab、miRNA-515-5p的表達水平與潰瘍性結腸炎活動指數(ulcerative colitis activity index，UCAI)呈負相關；在活動性CD患者中，miRNA-1226、miRN-548ab及miRNA-515-5p的表達水平與克羅恩病活動指數(Crohn’s disease activity index，CDAI)呈顯著負相關。研究同時也發現，在給與相應的藥物治療及疾病嚴重程度得到改善后，上述特異性miRNA的表達可以得到升高。而Guo等[34]研究也發現，與健康對照相比，IBD患者(包含5例CD及3例UC患者)腸道炎性組織中的miRNA-7-5p表達存在顯著升高，而三葉肽因子(trefoil factor 3，TFF3)表達則顯著降低，且miRNA-7-5p表達程度與IBD患者腸道炎癥嚴重程度顯著正相關。同時研究者還在體外細胞模型中進行了驗證，得到了相似的結果，TFF3本身是具有腸道黏膜保護作用，在IBD時TFF3的表達程度降低也加重了腸道的炎癥損害。Feng等[35]研究顯示，UC患者中存在顯著的miRNA-146a表達降低，且重度UC患者miRNA-146a降低最為顯著，且miRNA-146a降低程度與多種炎性因子如NF-κB、C-反應蛋白、IL-1β、IL-6及TNF-α表達升高存在顯著相關性。此外，低miRNA-164a表達的UC患者DAI評分更高，癥狀嚴重程度及內鏡下炎癥評分更高。

另一方面，特異性miRNA在用于IBD的臨床診斷中具有重要的價值。如Sun等[36]針對CD患者(n=66)的研究顯示，與緩解期CD患者及健康對照相比，活動期CD患者血漿miRNA-125a表達顯著降低，miRNA-125a用于區別診斷活動期CD與緩解期CD的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.854，區別活動期CD與健康對照的AUC為0.780，此外，研究還發現，活動期CD患者的血漿miRNA-125a水平與反映炎癥和疾病嚴重程度的C-反應蛋白、血沉(ESR)、CDAI、IL-17及TNF-α等呈負相關，且藥物治療3個月后獲得臨床緩解的活動期CD患者基線miRNA-125a水平更高。Netz等[37]探討了血漿miRNA指標用于區別CD及UC的臨床診斷價值，結果顯示，CD患者的miRNA-598及miRNA-642顯著高于UC患者，miRNA-598聯合miRNA-642區別診斷CD及UC的AUC可達0.75。Ji等[38]研究顯示，與健康對照相比，UC患者外周血中的miRNA-148表達存在顯著升高，而且miRNA-148水平與患者血清C-反應蛋白及血沉存在顯著的相關性。ROC分析顯示，miRNA-148水平診斷UC的AUC可達0.837(P=0.008,95%CI：0.748～0.925)，診斷靈敏度可達86.9%，特異度可達91.5%。而且miRNA-148聯合CRP及ESR診斷活動性UC的準確度較單項指標更高。Schonauen等[39]的研究建立了2個獨立的IBD患者隊列，在檢測隊列中，miRNA-223用于診斷活動性IBD的AUC可達0.88，用于診斷活動UC的AUC為0.93，用于診斷活動CD的AUC為0.86，同時研究者也在驗證隊列中對miRNA-223的診斷價值進行了證實。葉玉蘭等[40]研究也發現，IBD患者腸黏膜組中的miRNA-155表達水平顯著高于健康對照，且UC患者的miRNA-155表達程度高于CD患者，腸黏膜miRNA-155診斷IBD的AUC可達0.83(95%CI：0.679～0.986)，診斷特異度為0.786，靈敏度為0.684，提示miRNA-155在用于IBD診斷具有一定的價值。Chen等[41]的研究也發現，與健康對照相比，CD及UC患者血清中miRNA-146b-5p的表達分別增高2.87及2.72倍，研究者還建立了針對CD患者的內鏡下炎癥活動程度預測模型(僅包含miRNA-146b-5p及PLT兩項指標)，模型用于預測CD患者腸道炎癥程度的AUC可達0.869，高于血清CRP的AUC(0.680)。此外，也有學者關注了唾液中特異性miRNA與IBD的相關性，結果發現在CD患者的唾液中miRNA101的表達存在升高，而UC患者唾液中miRNA-21、miRNA-31及miRNA-142-3p表達存在升高，研究者認為唾液中特異性miRNA可能作為CD及UC的潛在診斷標志物[42]。但是唾液中miRNA的表達容易受到多種因素，如口腔及牙齒疾病、鼻咽部疾病、食物等影響，相較于血清學指標可能應用價值不高。

上述研究結果均提示了特異性miRNA用于IBD的臨床診斷具有較好的價值，尤其是部分指標能夠發揮區別診斷UC及CD的作用，為臨床針對不同類型IBD的鑒別診斷提供了重要參考。此外，研究證據也顯示了特異性miRNA聯合多種指標(包括多種miRNA)的聯合模型較單項指標在用于IBD的臨床診斷時具有更高的價值。但是聯合模型也存在一定的局限性，主要是可能增加檢測成本，如何探索更為準確及合理成本的聯合模型是下步重點研究的方向。

3 miRNA用于IBD的臨床治療

IBD的治療仍是臨床上的難點，現有的藥物包括氨基水楊酸制劑、激素、免疫抑制劑等存在存在多方面(藥物耐受度、不良反應等)問題，臨床上一直在探索針對IBD的新型藥物，從而提高針對IBD的臨床療效，改善患者的長期生活質量[43]。由于特異性miRNA在IBD的致病及發展中發揮著重要的調控作用，通過靶向調控miRNA的方法來治療IBD也逐漸引起了研究者的重視，也取得了一定的進展[44]。然而，由于藥物設計、安全性不確定等原因，目前靶向miRNA的治療研究仍僅停留在細胞及動物模型層面，距離臨床驗證及實際應用還有一定的距離，還有很多技術及倫理問題需要進行探討研究。

在miRNA用于UC治療的相關研究方面，如Fang等[45]在來源于UC患者及UC模型小鼠的結腸炎癥組織中均觀察到miRNA-31-3p(靶標基因為RhoA基因)的表達升高，同時，通過靶向抑制劑來抑制NCM460細胞系中miRNA-31-3p的表達可以增高TNF-α、CXCL10及CCL2的mRNA的表達程度，而增高miRNA-31-3p的表達可以緩解DSS誘導的結腸炎癥。研究提示，負載miRNA-31-3p的藥物微粒可能作為IBD治療的潛在方法。Wu等[46]研究也發現，miRNA-206在UC中有重要的促炎癥作用，其主要通過抑制A4AR基因的表達并激活NF-κb信號來發揮促炎癥作用，在UC小鼠模型中，針對miRNA-206拮抗劑可增高A4AR的表達，并減弱TNF-α、IL-8、IL-1β等促炎性因子合成，從而緩解UC的炎性反應。He等[47]也發現，與健康對照相比，UC患者的炎性組織及外周PBMC中的miRNA-301a表達存在顯著升高，miRNA-301a表達增高可顯著抑制其靶標基因SNIP1的表達，并促進TH17細胞分化，從而加重UC時的腸道炎癥。研究者也在模型小鼠中證實，使用miRNA-301a抑制劑可通過上述途徑減弱炎癥相關Th17細胞的分化，從而緩解IBD時的腸道炎性反應，提示了miRNA-301a可能作為IBD治療的潛在靶點。如基于HT29細胞的體外試驗也顯示，增高miRNA-141表達可以降低CXCL5、MMP-2及MMP-9等，從而抑制磷脂酰肌醇三激酶-絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶(PI3K/AKT)信號通路(經典的細胞自噬調控信號通路)表達，從而抑制UC的結腸炎癥活動[48]。

在miRNA用于CD的治療相關研究方面，如Shi等[49]基于三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的CD小鼠模型的研究顯示，模型動物腸道炎癥組織中的miRNA-31表達存在顯著降低，且與IL-25表達存在顯著負相關，而且通過增強miRNA-31的表達可通過抑制IL-25來影響Th1/Th17細胞相關信號通路功能從而緩解CD動物的結腸炎癥，提示了miRNA-31/IL-25可能作為CD治療的潛在靶點。IL-25也被稱為IL-17E，其本身屬于IL-17超家族，其能夠調節2型免疫應答反應，在結腸上皮的炎癥應答中發揮重要的調節作用，功能實驗也顯示IL-25是miRNA-31的直接調控靶標蛋白[50]。Zhao等[51]的研究顯示，在TNBS誘導的CD小鼠模型腸道炎癥組織中，miRNA-130a-3p表達存在顯著升高，進一步的功能實驗顯示，miRNA-130a-3p靶向抑制ATG16L1的表達，從而促進NF-Κb相關信號通路的激活來促進CD的發生。而且研究者還發現，使用特異性miRNA-130a-3p抑制劑能夠誘導巨噬細胞相關自噬作用，從而抑制NLRP3炎癥小體活性，從而改善結腸炎情況，這也為開發新的CD靶向藥物提供了重要參考。

上述研究均顯示，靶向特定miRNA的治療方法可能有助于緩解IBD相關的腸道炎癥，作為IBD治療的可能靶點來篩選新型的藥物。但是這些研究均只是停留細胞或動物模型層面，距離開發高效安全的可用于人體的藥物還有很大距離。雖然這些靶向藥物(或分子)的安全性仍屬未知，但是基于靶向特性miRNA的新型藥物仍具有十分巨大的潛能，值得進一步更深入的研究。

綜上所述，特異性miRNA在IBD的致病中發揮著十分重要的調控作用，而且作為無創生物學標志物，miRNA可以作為IBD的臨床診斷、評估及預后指標。此外，靶向特異miRNA的治療為開發針對IBD的臨床新型藥物也提供可能。下步的研究方向仍需要更深入的探討miRNA在IBD致病中的調控機制，并通過開發基于特異miRNA的靶向藥物來改進IBD的臨床治療，從而使更多的患者從中獲益。