基于網絡藥理學研究半夏治療功能性消化不良的作用機制

蒙毅，吳月霞，龔純，周瑞東，徐杉，朱永蘋

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是指具有餐后飽脹不適、早飽感、上腹痛、上腹燒灼感等中的一項或多項的癥狀，而不能用器質性、系統性或代謝性疾病等來解釋產生癥狀原因的疾病。羅馬Ⅳ診斷標準將FD分為餐后不適綜合征（PDS）和上腹痛綜合征（EPS）兩個亞型［1］。FD發病機制還沒有完全明確，業界普遍認為與胃腸動力障礙、胃酸分泌異常、內臟高敏感性、胃腸道激素、幽門螺桿菌感染、精神心理、基因等因素相關［2］。西醫治療需長時間持續用藥，而且會出現比較明顯的副反應，從而造成病人經濟負擔和生活質量下降［3］。FD根據其癥狀歸屬，以餐后飽脹不適、早飽為主癥者，應屬于中醫學“痞滿”“積滯”的范疇；以上腹痛、上腹燒灼感為主癥者，應屬于中醫學“胃痛”范疇。中醫對于本病的治療近年來也取得了不錯的療效［4］。

半夏來源于天南星科植物半夏的干燥塊莖，始載于《神農本草經》，列為下品。半夏性溫味辛、有毒，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效［5］。半夏常在臨證處方中大量運用，對治療脾胃不和、心下痞證、中焦不暢等具有良好地臨證效果。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統進行網絡分析，從整體水平觀察“藥物-靶點-疾病”的復雜網絡關系，強調對信號通路的多途徑調節，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，進而提高新藥臨床試驗的成功率，節省藥物的研發費用［6］。本研究采取網絡藥理學的研究方法，篩選半夏的活性成分和作用靶點，分析其生物功能及信號通路，與FD的治療靶點進行映射，探究半夏治療FD的作用機制，為臨床推廣半夏的使用提供科學依據。

1 資料和方法

1.1 半夏活性成分的篩選本研究于2020年1—2月借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP（網址為：http：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php），將半夏作為關鍵詞輸入數據庫檢索，同時滿足口服生物利用度（oral bioavailability，OB）值≥30%和生物活性分子類藥性（drug-likeness，DL）值≥0.18這兩個條件，得到半夏的活性成分。

1.2 半夏活性成分的作用靶點的選取通過TCMSP數據庫選取半夏活性成分的作用靶點（targets），利用UniProt、HCBI和PubMed等數據庫，得到藥物活性成分靶點對應的基因名（official gene symbol）。

1.3 FD的靶點篩選借助GeneCards（https：∕∕www.genecards.org∕）、OMIM（https：∕∕omim.org∕）數據庫，將functional dyspepsia作為關鍵詞檢索，得到FD的相關治療靶點。

1.4 半夏與FD的交集靶點篩選借助Venny 2.1（https：∕∕bioinfogp.cnb.csic.es∕tools∕venny∕），將半夏活性成分的靶點基因與FD的靶點基因取交集，從而得到交集靶點，并繪制相關的韋恩圖。得到的交集靶點將會是半夏治療FD的核心靶點。

1.5 中藥調控網絡可視化圖的繪制利用Cytoscape 3.7.2軟件構建藥物-活性成分-疾病-治療靶點四維中藥調控網絡可視化圖，通過網絡圖的角度研究半夏治療FD的作用機制。

1.6 FD的蛋白互作網絡的構建將得到交集靶點在STRING 11.0（https：∕∕string-db.org∕）數據庫檢索，進行蛋白質-蛋白質的相互作用分析，得到PPI網絡圖。同時將PPI網絡以TSV的格式導入“R”軟件（The R Project for Statistical Computing，https：∕∕www.r-project.org∕）進行可視化。

1.7 GO功能富集分析通過KOBAS 3.0平臺（http：∕∕kobas.cbi．pku．Edu.cn∕index．php），將半夏活性成分與FD的交集靶點基因進行GO富集分析，運用Omishare Tools（網址為http：∕∕www.omicshare.com∕tools∕index.php∕）可視化其分析結果，從而了解半夏治療FD核心靶點基因本體的作用功效。

1.8 KEGG通路富集分析采用DAVID 6.8數據庫（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https：∕∕david.ncifcrf.gov∕），將交集靶點基因名稱輸入數據庫檢索和轉化操作，以P＜0.05對半夏治療FD的核心靶點基因進行KEGG通路富集分析，運用Omicshare可視化分析KEGG通路，分析半夏治療FD相關重要的信號通路。

2 結果

2.1 半夏活性成分及其活性成分靶點的篩選通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP，同時滿足OB＞30%和DL＞0.18兩個條件檢索半夏，得到13個半夏活性成分（見表1）。將此13個半夏的活性成分繼續在TCMSP數據庫搜索得到173個活性成分靶點。借助UniProt、HCBI和PubMed等數據庫，得到藥物活性成分靶點對應的基因名74個。

表1 半夏的活性成分

2.2 半夏治療FD的作用靶點分析借助Gene-Cards（https：∕∕www.genecards.org∕）、OMIM（https：∕∕omim.org∕）數據庫，將functional dyspepsia作為關鍵詞檢索，得到FD的相關治療靶點基因1 627個。將74個半夏活性成分靶點基因與1 627個FD的靶點通過Venny 2.1取交集，得到35個交集靶點，這35個交集靶點將會是半夏治療FD的核心基因。交集靶點基因主要包括RACα絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、B淋巴細胞瘤-2基因（BCL2）半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）、半胱氨酸蛋白酶-9（CASP9）、凋亡調節因子（BAX）、α-2C腎上腺素能受體（ADRA2C）、α-2A腎上腺素能受體（ADRA2A）、孕酮受體（PGR）、維甲酸受體RXRα（RXRA）等。

2.3 半夏治療FD的靶點PPI網絡分析將半夏與

FD的交集靶點通過STRING 11.0數據庫進行檢索，蛋白質種類選擇“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設置為“medium confidence”，設置隱藏未連接的蛋白節點，進行交集靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建，該PPI網絡有35個節點，195條邊，平均節點degree值為11.1。同時將PPI網絡以TSV的格式導入“R”軟件（The R Project for Statistical Computing，https：∕∕www.r-project.org∕）進行可視化圖，處于該PPI網絡中心靶點蛋白質有AKT1、BCL2、CASP3、CASP9等，這可能是半夏治療FD的重要靶點蛋白。

2.4 半夏治療FD靶點GO功能富集分析通過KOBAS 3.0平臺，將半夏活性成分與FD的35個交集靶點基因以P＜0.05進行GO富集分析，同時運用在線繪圖Omishare Tools可視化其分析結果，了解半夏治療FD的核心靶點基因本體的作用。結果顯示35個交集靶點基因涉及66個GO條目，依據P-adjust大小進行排序，得到前20個GO條目。通過GO分析發現半夏治療FD主要通過兒茶酚胺結合、內肽酶活性、核受體活性、轉錄因子活性、凋亡過程中的半胱氨酸型內肽酶活性等功能。

2.5 半夏治療FD靶點KEGG信號通路富集分析采用DAVID 6.8數據庫，將35個交集靶點基因名稱輸入數據庫檢索和轉化操作，以P＜0.05對半夏治療FD的核心靶點基因進行KEGG通路富集分析，運用Omicshare可視化分析KEGG通路，分析半夏治療FD相關重要的信號通路。結果顯示35個交集靶點基因涉及97條信號通路，依據P-adjust大小進行排序，得到前20條半夏治療FD的主要信號通路。通過KEGG分析發現，半夏治療FD主要與凋亡-多物種（apoptosis-multiple species）、凋亡、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人類免疫缺陷病毒1型感染、大腸癌、腫瘤壞死因子等信號通路有關。

3 討論

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統的網絡分析，選取特定信號節點（Nodes）進行多靶點藥物分子設計的新學科。中醫的整體觀和辨證論治是將人類看作一個互相聯系的復雜網絡系統，中藥在該網絡系統中具有極其復雜的物質體系，其有效成分和作用靶點同樣是一個復雜的網絡關系。網絡藥理學與中醫整體觀相互結合，從整體水平揭示“藥物-靶點-疾病”的復雜網絡關系，更好闡釋了中藥多成分、多靶點、多通路的作用特點。通過網絡藥理學得到的結論，今后進行相關的實驗研究對其驗證，為中藥現代化的研究提供重要的指導方向，有利于提高藥物的治療效果，降低毒副作用，為藥物推廣至臨床使用提供重要科學的依據［7］。

通過上述的研究結果，通過篩選得到了13個藥物的活性成分、35個核心靶點基因、20個GO條目和20條KEGG通路。我們將這35個核心靶點基因通過STRING 11.0數據庫進行PPI網絡分析，發現這些蛋白質之間存在著復雜的關系，而不是單線作用，從而可以推斷靶點蛋白之間的相互作用調節可能是半夏治療FD的潛在機制之一。同時我們對35個半夏治療FD的核心靶點進行KEGG信號通路分析，以P＜0.05為條件，按照P-adjust大小進行排序，得到前20條半夏治療FD的主要信號通路，主要包括凋亡-多物種、凋亡、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人類免疫缺陷病毒1型感染、大腸癌、腫瘤壞死因子等信號通路有關。

FD的發病機制業界普遍認為由多種病理生理學機制參與。胃腸動力障礙和胃腸道激素屬于引發FD的重要發病機制［8］。形成胃腸動力障礙的原因主要與器官間功能的紊亂，胃腸平滑肌收縮功能失調，多種細胞的信號通路傳導障礙以及相關基因、蛋白表達的不足等，然而這些因素可能會誘導細胞凋亡。

細胞凋亡通常是指機體細胞在生長發育過程中或者在一定條件下，通過細胞內外因素調控下而發生的一種程序性死亡。細胞凋亡受到多種相關基因的調控，例如Bcl-2、Caspase、Bax等基因。Caspase調控細胞凋亡是指殺死細胞一般通過裂解核酸酶抑制蛋白激活核酸酶活性進行水解核酸和破壞細胞結構的完整性的兩種途徑實現的［9］。Caspase家族對于細胞凋亡過程中起到了至關重要的作用，其可發生在細胞凋亡的各個時期，凋亡的過程開始于激活的Caspase酶，通過線粒體、內質網、死亡受體這三個通路實現。Caspase-3在細胞凋亡的過程中處于核心的地位，是整個通路的關鍵因子。Caspase處于非活化的酶原狀態，不能具有生理活性，只有被激活的Caspase-3才能具有生理活性，引發細胞凋亡級聯反應［10］。在線粒體通路中，線粒體內的細胞色素C釋放入胞漿后，細胞色素C與Caspase-9形成凋亡復合物，同時作用于下游的Caspase-3，使得Caspase-3被激活，從而引發細胞凋亡級聯反應［11］。同時在細胞凋亡的研究中Bcl-2是最重要的基因之一，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白因子，能夠對多種組織的細胞凋亡起到抑制作用，增加細胞存活的時間［12］。有研究發現，Bcl-2在與Caspase的共同通路中處于Caspase-3上游，Bcl-2可以改變線粒體膜的通透性，抑制線粒體途徑中的細胞色素C的釋放，進而抑制Caspase-3的活性，最后抑制了細胞的凋亡。

因此Bcl-2與Caspase-3呈負相關的關系。而Bax表達增強則促進細胞凋亡的發生［13］。

我們從半夏治療FD的KEGG富集分析得到的Apoptosis-multiple species、Apoptosis、Hepatitis B、Colorectal cancer、p53 signaling pathway、TNF signaling pathway等信號通路，這些通路均與Bcl-2、Caspase、Bax等凋亡因子相關，參與到細胞凋亡的相關機制中。接下來我們主要分析Apoptosis-multiple species信號通路，有研究表明［14］，當胃內組織發生細胞凋亡時，促進了Bax mRNA表達，使Bcl-2mRNA的表達降低，從而造成Caspase被活化。因此在該通路提高Bcl-2的表達，進而抑制Bax、Caspase-9和通路下游Caspase-3的表達，最終抑制細胞發生凋亡，將可能是半夏治療FD的重要機制之一。

以上分析可以推斷出FD可能與胃腸內組織發生細胞凋亡有關，受到細胞凋亡相關基因的影響。因此，通過抑制細胞凋亡，從而促進胃腸動力的恢復，可以有效地治療FD，可能是半夏治療FD的重要的生物學機制之一。

半夏具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效，半夏在《中藥學》《中華本草》和《中藥大辭典》等權威著作中規定的用量5～10 g。但在中醫經典《傷寒論》和《金匱要略》中半夏均大劑量使用，按現代劑量換算約為10～30 g。蔡秋杰、曹洪欣［15］通過對仲景運用半夏的經驗學習中得出，發現仲景偏于重用生半夏，生半夏作為散劑服用是有毒性的，能讓人口舌麻木腫痛，但生半夏經過常規的湯劑久煎后是安全無毒的，同時也能增強半夏之功效。近些年來不少醫家也在研究中證實［16-17］，張仲景在《傷寒論》和《金匱要略》使用半夏頻率極高，而且是大劑量使用，但效果顯著。由此可以證實半夏在經典經方的地位極其重要，在半夏瀉心湯、半夏厚樸湯、小半夏湯、黃芩加半夏生姜湯、瓜蔞薤白半夏湯等健脾益胃、消痞散結方劑中，半夏的計量均大于其他藥物的劑量，處于君藥的地位。因此半夏對于治療“胃痛”“痞滿”等中焦疾病尤為重要。

劉余等［18］研究表明，半夏瀉心湯能夠增加Bcl-2mRNA表達，從而抑制其下游因子Caspase-3的表達，最終抑制胃內組織的細胞凋亡。晉紅賓等［19］的動物實驗研究中發現，瓜蔞薤白半夏湯能夠促進抗凋亡因子Bcl-2的表達，同時減少Bax蛋白的表達，達到了對心肌細胞凋亡的抑制作用。從上述討論中我們知道半夏在這些方劑中均處于君藥的地位，從而我們可以推斷出半夏能夠在細胞凋亡通路中增強Bcl-2的表達，同時抑制了Bax和Caspase-3的表達，這與我們半夏治療FD的KEGG分析得到的通路中相關的細胞凋亡機制相符，最終抑制了細胞的凋亡，促進了胃腸動力的恢復，有效地治療了FD，但是其具體凋亡通路的機制和改善以及后續的影響仍有待我們做進一步的實驗研究。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學平臺，探討了半夏治療FD的多成分、多靶點、多途徑的分析，具體從半夏的有效成分、靶點以及與FD相關靶點和交互蛋白進行分析，同時也對半夏治療FD的核心靶點進行GO功能和KEGG信號通路富集分析。通過分析我們可以初步地知道半夏治療FD相關靶點所發揮的作用。上述分析得到的結果與已發表的文獻基本符合，富集得到的多條通路均與細胞凋亡因子相關，為半夏對治療FD的作用機制提供了科學依據。但是，細胞凋亡通路的具體的機制和后續的改善作用仍需要做相關的實驗去研究證實。在PPI網絡中的中心蛋白、GO功能分析以及KEGG通路分析未討論的靶點，可能會成為今后研究半夏治療FD的作用機制提供線索。然而我們僅僅利用網絡藥理學平臺半夏的有效成分及作用靶點，可能存在原始數據不一致的因素，以及數據庫的信息更偏向于某些熱點領域，難免會遺漏有研究價值的重要信息，因此利用網絡藥理學對半夏全部成分的研究存在著困難，需要我們未來借助其他的信息技術以及實驗研究來驗證本次探究的成果。