低氧對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖及HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響

袁爍，劉湘云，張家旗，鄧高丕△

氧濃度的改變是妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與侵襲的重要條件。在妊娠早期，低氧狀態(tài)介導(dǎo)的滋養(yǎng)層分化與生物學(xué)效應(yīng)對(duì)維系妊娠至關(guān)重要［1］。低氧狀態(tài)會(huì)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞入侵母體子宮內(nèi)膜，并影響子宮壁動(dòng)脈血管的重塑［2］。若妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞因活性氧生成與抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成滋養(yǎng)細(xì)胞入侵不足，可能會(huì)導(dǎo)致各種妊娠相關(guān)疾病，如子癇前期、宮內(nèi)生長(zhǎng)受限或流產(chǎn)等的發(fā)生［3-5］。有研究報(bào)道，物理低氧條件（8%O2）可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α上調(diào)，促進(jìn)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞分化與侵襲、遷移能力增強(qiáng)［6］；化學(xué)低氧條件［250μmol/L二氯化鈷（CoCl2）］可激活滋養(yǎng)細(xì)胞自噬途徑并介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9上調(diào)和細(xì)胞內(nèi)腺苷三磷酸（ATP）增多［7］。目前，有關(guān)不同濃度CoCl2對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖的干預(yù)效應(yīng)，以及CoCl2的濃度梯度對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中HIF-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）蛋白表達(dá)的影響鮮有報(bào)道。本研究旨在探討CoCl2的濃度變化對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖及蛋白表達(dá)的影響，為妊娠相關(guān)疾病的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo細(xì)胞購自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫（批號(hào)：CRL-3271）；南美胎牛血清購自武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司（批號(hào)：201909）；胰酶（批號(hào)：25200072）、DMEM/F12培養(yǎng)基（批號(hào)：C11995500BT）購自美國(guó)Gibco公司；CCK8試劑盒購自日本同仁公司（批號(hào)：CK04）；兔源HIF-1α一抗購自英國(guó)Abcam公司（批號(hào)：ab51608）；GAPDH抗體（批號(hào)：5174s）、兔源VEGF一抗（批號(hào)：3408s）、兔源MMP-9一抗（批號(hào)：13667s）購自美國(guó)CST公司；鼠源TIMP-1一抗購自美國(guó)R&D公司（批號(hào)：MAB970）。山羊抗鼠IgG（H+L）、山羊抗兔IgG（H+L）二抗均購自英國(guó)Jackson Immuno Research公司（批號(hào)分別為113035003、111035003）。CoCl2購自美國(guó)Sigma公司（批號(hào)：232696）。CO2培養(yǎng)箱（NBS公司）；超凈工作臺(tái)（東莞美維凈化設(shè)備有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Nexcelom公司）；常溫離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HTR8/SVneo細(xì)胞，加入含EDTA的0.25%胰酶消化，1～2 min后加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為900 r/min，時(shí)間為5 min，離心后棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸為約1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24～48 h換液。

1.3化學(xué)低氧狀態(tài)的藥物制備 參考相關(guān)文獻(xiàn)［8-9］，擬定適宜誘導(dǎo)低氧環(huán)境的CoCl2培養(yǎng)基母液的濃度梯度。將化學(xué)缺氧劑CoCl2加入胎牛血清中稀釋，配置成終濃度為50、100、200、400、800、1 000和1 200μmol/L的母液，用于模擬細(xì)胞低氧微環(huán)境。

1.4CCK8法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況 按1.3的濃度配置分組，另設(shè)立空白組，共8組，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度梯度的CoCl2培養(yǎng)基母液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h和48 h。每孔加入10μL CCK8，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，用FC型酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)改變，以細(xì)胞增殖程度適中作為原則，選擇最合適的時(shí)間點(diǎn)與梯度最適中的3個(gè)濃度作為CoCl2低、中、高濃度組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5Western blot法檢測(cè)CoCl2低、中、高濃度組HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1的蛋白表達(dá)量 HTR-8/SVneo細(xì)胞與相應(yīng)濃度的CoCl2培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌，細(xì)胞裂解液、超聲破碎儀處理，取上清液，檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)的蛋白濃度，電泳并轉(zhuǎn)膜，PBS清洗PVDF膜10 min，加入5%脫脂牛奶，置于室溫中封閉1 h后，加入HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1一抗，稀釋比例為均1∶1 000，4℃孵育過夜，洗膜后添加二抗IgG（1∶5 000），37℃孵育1 h，洗膜，顯色，曝片，Quantity One圖像分析軟件計(jì)算各蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni校正t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧狀態(tài)下不同時(shí)間點(diǎn)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖情況與形態(tài)變化 與空白組相比，CoCl2作用于HTR-8/SVneo細(xì)胞24 h后，濃度達(dá)200μmol/L時(shí)較100μmol/L時(shí)OD值略下降；達(dá)400μmol/L后隨濃度增加，OD值上升。CoCl2作用于HTR-8/SVneo細(xì)胞48 h后，OD值隨濃度增加而上升；同一CoCl2濃度作用下，作用48 h較作用24 h的OD值均上升，見圖1。CoCl2各濃度組作用24 h及48 h后，HTR-8/SVneo細(xì)胞形態(tài)的改變隨濃度變化顯現(xiàn)出差異，但不同作用時(shí)間下同一濃度，細(xì)胞形態(tài)差異不明顯。0μmol/L CoCl2組細(xì)胞形態(tài)以多邊形、梭形為主，伸展良好，呈上皮樣細(xì)胞表現(xiàn)；隨著CoCl2濃度的增加，細(xì)胞密度均逐漸增加；400μmol/LCoCl2組細(xì)胞呈梭形、類圓形，細(xì)胞飽滿，胞漿豐富，部分聯(lián)合成片；800、1 000、1 200μmol/LCoCl2組細(xì)胞逐漸密集，同時(shí)見核固縮及縮小的死亡細(xì)胞。鏡下細(xì)胞形態(tài)變化見圖2、3。選擇作用時(shí)間為48 h，擬定CoCl2100μmol/L為CoCl2低濃度組，200μmol/L為CoCl2中濃度組，400μmol/L為CoCl2高濃度組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CoCl2低、中、高濃度組細(xì)胞HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)情況 與空白組相比，CoCl2低、中、高濃度組的HIF-1α、MMP-9的蛋白表達(dá)水平和MMP-9/TIMP-1比值逐步上調(diào)（P＜0.05）；與空白組相比，CoCl2低、中、高濃度組的TIMP-1蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），但隨著CoCl2濃度增加而呈上升趨勢(shì)；與空白組相比，CoCl2低濃度組的VEGF的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，CoCl2中、高濃度組的VEGF的蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），見表1、圖4。

Fig.1 The proliferation of HTR-8/SVneo cells after treatment with different concentrations of CoCl2 for 24 h and 48 h圖1 CoCl2各濃度組作用24 h和48 h后HTR-8/SVneo的細(xì)胞增殖情況

Fig.2 Proliferation of HTR-8/SVneo cells after treatment with different concentrations of CoCl2 for 24 h(×200)圖2 CoCl2各濃度組作用24 h后HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖情況（×200）

Fig.3 Proliferation of HTR-8/SVneo cells after treatment with different concentrations of CoCl2 for 48 h(×200)圖3 CoCl2各濃度組作用48 h后HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖情況（×200）

Tab.1 The effects of different concentrations of CoCl2 on expression levels of HIF-1α,VEGF,MMP-9,TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1表1 CoCl2各濃度組對(duì)HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達(dá)的影響 （n=3，±s）

Tab.1 The effects of different concentrations of CoCl2 on expression levels of HIF-1α,VEGF,MMP-9,TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1表1 CoCl2各濃度組對(duì)HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達(dá)的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白組比較，b與CoCl2低濃度組比較，c與CoCl2中濃度組比較，P＜0.05

組別空白組CoCl2低濃度組CoCl2中濃度組CoCl2高濃度組F HIF-1α 0.378±0.003 0.402±0.007a 0.486±0.002ab 0.570±0.006abc 920.214＊VEGF 0.509±0.001 0.463±0.004a 0.618±0.004ab 0.620±0.005ab 1 312.614＊MMP-9 0.344±0.002 0.387±0.001a 0.626±0.003ab 0.690±0.007abc 5 355.389＊TIMP-1 0.886±0.003 0.737±0.003a 0.801±0.003ab 0.835±0.003abc 1 401.658＊MMP-9/TIMP-1 0.388±0.002 0.525±0.002a 0.782±0.003ab 0.827±0.009abc 5 471.943＊

Fig.4 The expression levels of HIF-1α,VEGF,MMP-9 and TIMP-1 protein detected by Western blot assay in different concentration of CoCl2 groups圖4 Western blot檢測(cè)CoCl2各濃度組HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

在一個(gè)完整孕期中，滋養(yǎng)細(xì)胞的局部氧環(huán)境一直處于動(dòng)態(tài)變化過程。在妊娠早期，局部的生理性低氧環(huán)境刺激滋養(yǎng)細(xì)胞，使其侵襲能力明顯增強(qiáng)［10］。當(dāng)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞通過侵襲效應(yīng)在子宮內(nèi)膜遷移，侵入子宮蛻膜，浸潤(rùn)到子宮約1/3的肌層與血管后，螺旋動(dòng)脈重塑，逐漸獲得血液供應(yīng)，為胚胎建立適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，滋養(yǎng)細(xì)胞局部氧濃度才隨之逐漸上升［11］?？梢?，胚胎著床與發(fā)育早期是在相對(duì)缺氧的環(huán)境下進(jìn)行的。本研究以CoCl2作為化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑模擬體外低氧環(huán)境以研究滋養(yǎng)細(xì)胞的行為，從CoCl2濃度為0、50、100、200、400、800、1 000、1 200μmol/L的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，作用時(shí)間為48 h，HTR-8/SVneo的細(xì)胞增殖隨濃度增加呈上升趨勢(shì)。在CoCl2濃度為100～400μmol/L時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞的增殖程度適中。

HIF-1α作為低氧狀態(tài)下的一種活性轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境和低氧反應(yīng)的調(diào)節(jié)，影響滋養(yǎng)細(xì)胞在不同氧濃度狀態(tài)下的細(xì)胞活動(dòng)［12］。低氧促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和血管生成，上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，HIF-1α抑制劑抑制了滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和血管生成［2］。VEGF是HIF-1的靶標(biāo)之一，以低氧環(huán)境為介質(zhì)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，促進(jìn)新生血管形成，故而在受精卵著床、胎盤血管形成、胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育等妊娠過程的多個(gè)階段有重要作用。有研究報(bào)道，低氧狀態(tài)下（300μmol/L CoCl2），HTR-8/SVneo細(xì)胞中VEGF和MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平同向上調(diào)，影響HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成能力［13］。本研究結(jié)果表明，HIF-1α蛋白表達(dá)隨低氧濃度增加呈上升趨勢(shì)，表明本研究在HTR8/SVneo細(xì)胞中誘導(dǎo)了低氧反應(yīng)，而VEGF在CoCl2中、高濃度組較空白組表達(dá)上調(diào)，與研究報(bào)道的低氧提高滋養(yǎng)細(xì)胞的VEGF表達(dá)水平結(jié)果一致［14］。新生血管形成和血管通透性增加是細(xì)胞對(duì)低氧狀態(tài)的一種代償性反應(yīng)。CoCl2低濃度組VEGF不升反降，推測(cè)可能100μmol/L的CoCl2濃度尚未到達(dá)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞中VEGF升高的閾值，而200μmol/L的CoCl2濃度達(dá)到了啟動(dòng)VEGF對(duì)低氧應(yīng)答調(diào)控的閾值。

MMPs是一個(gè)鋅依賴家族，通過參與降解細(xì)胞外基質(zhì)而影響細(xì)胞侵襲能力，其表現(xiàn)出的蛋白水解活性與滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮有關(guān)，MMP-9的減少是干擾妊娠早期螺旋動(dòng)脈正常重構(gòu)的原因之一［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，HTR-8/SVneo細(xì)胞暴露于低氧（2%O2）條件下的遷移和侵襲性較常氧（20%O2）條件下增加，MMP-1、MMP-9表達(dá)顯著增加［16］。TIMPs是一組小分泌糖蛋白，以1∶1的比例抑制MMPs的激活。TIMP-1作為MMP-9的特異性抑制劑，可降低滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)水平［17］。對(duì)感染人巨細(xì)胞病毒的早孕絨毛細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，病毒可降低原代早孕滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，上調(diào)TIMP-1的表達(dá)，使MMP-9/TIMP-1比值下降，繼而削弱滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力［18］。與妊娠相關(guān)的滋養(yǎng)細(xì)胞侵入屬于生理性的精準(zhǔn)調(diào)控，故MMP-9表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，TIMP-1亦會(huì)受到調(diào)節(jié)適當(dāng)上調(diào)，以保持MMP-9/TIMP-1的動(dòng)態(tài)平衡。有研究推論，這種動(dòng)態(tài)平衡是胚胎著床后發(fā)揮類似腫瘤細(xì)胞的侵襲行為，但又有節(jié)制地僅浸潤(rùn)至子宮肌層1/3以維持正常妊娠，而不發(fā)生滋養(yǎng)細(xì)胞疾病等侵襲性疾病的重要原因［19］。本研究結(jié)果表明，隨著CoCl2濃度的增加，MMP-9的表達(dá)上升，且呈濃度依賴性；TIMP-1的表達(dá)與空白組比較均下降，但隨CoCl2濃度增加而逐漸上升。這個(gè)結(jié)果看似矛盾，但TIMP-1的上升可能是對(duì)于MMP-9的上升做出的適應(yīng)性反應(yīng)，以維持兩者比值的動(dòng)態(tài)平衡。低氧狀態(tài)下MMP-9/TIMP-1的比值隨著CoCl2濃度增加而上升，呈濃度依賴性，該比值的上升與促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力有關(guān)［20］。

綜上，本研究結(jié)果表明，化學(xué)模擬的低氧狀態(tài)可增強(qiáng)HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖，可通過HIF-1α的介導(dǎo)使VEGF的表達(dá)與MMP-9/TIMP-1比值上調(diào)。低氧狀態(tài)下滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為與早期妊娠的生理狀態(tài)更加貼近，可為后續(xù)探索妊娠相關(guān)疾病的機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。