APETx2及糞菌移植對母嬰分離誘導腸易激綜合征大鼠內臟敏感性的影響及機制

李歡，閆波，王金坤，袁麗萍，3△

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種常見的功能性胃腸道疾病，主要表現為持續性或陣發性腹痛、腹脹，以及排便習慣和（或）大便性狀改變。研究發現，IBS可能與腦-腸軸、黏膜屏障、精神心理因素、遺傳因素、腸道微生物改變、飲食、感染等有關［1］。越來越多的研究證實腸道微生物改變在IBS的發生和發展中起著重要作用。IBS腸道微生物改變可引起炎癥和疼痛，進一步導致內臟高敏感性和腸道動力異常［2-3］，但腸道微生物改變參與IBS發生的機制至今尚未完全明確。

酸敏感離子通道（acid sensing ion channels，ASICs）是一類廣泛存在于細胞膜上，由細胞外酸化激活的陽離子通道。ASICs在椎間盤退行性疾病、類風濕關節炎中的作用已被廣泛研究。在椎間盤退變中，ASICs通過乳酸介導核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（NLRP3）炎性小體調節髓核細胞炎癥和細胞焦亡［4］。在類風濕關節炎中，ASIC3感應細胞外pH值變化調節關節炎癥反應和痛覺敏感性［5］。另有研究發現ASICs在胃腸道內廣泛存在，并作為酸感受器對胃腸道酸性環境的改變作出反應，對維持胃腸道內環境穩定起著重要作用［6］。在炎性腸病、胃排空障礙等胃腸道疾病中，腸道ASIC3表達增加，參與胃腸道慢性炎癥和胃腸道動力功能紊亂［7］。本研究旨在探討母嬰分離誘導的IBS模型鼠腸道微生物對腸道ASIC3表達的影響，觀察給予ASIC3阻斷劑APETx2后內臟敏感性的變化并分析其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級健康SD孕鼠10只，孕齡16～18 d，SPF級健康雄性SD大鼠36只，平均體質量（220±10）g，購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.1.2試劑 ASIC3抑制劑APETx2（上海信裕生物科技有限公司），以生理鹽水溶解至所需濃度；ASIC3、c-kit一抗（Affinity）；兔二抗、DAB（Dako Denmark）；戊巴比妥鈉、EDTA抗原修復液（福州邁新）；含抗生素的雞尾酒（氨芐西林、新霉素、甲硝唑）、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）；DMEM/F12培養基、M199培養基（Hyclone）；Ⅱ型膠原酶（南京生興）。

1.2研究方法

1.2.1母嬰分離模型的制備 每只孕鼠約產下11只新生仔鼠，所有新生仔鼠在標準實驗室條件下飼養，進行12 h的明/暗循環，室溫為（23±1）℃，按照隨機數字表法分為母嬰分離組和未分離組。母嬰分離組仔鼠在出生后2～22 d，每天從母鼠籠中取出3 h，分離期結束后，仔鼠被放回各自的母鼠籠。未分離組仔鼠不進行干預。仔鼠第22天時斷奶，單獨飼養。當仔鼠8周齡時，在20、40、60、80 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）壓力下行結直腸擴張（colorectal balloon distention，CRD）刺激，引起大鼠的疼痛，表現為不同程度內臟痛引起的行為學反應，稱為腹部回撤反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）。根據AWR評分結果評估內臟敏感性，判斷造模是否成功。AWR評分標準：0分，無行為學反應；1分，大鼠有動作停頓后出現短暫的頭部運動行為；2分，可見腹部肌肉收縮；3分，有腹部抬起行為；4分，身體拱起，并抬起盆腔和陰囊。在充氣壓力為60 mmHg和80 mmHg時，與未分離組相比，母嬰分離鼠腹部回撤反射評分明顯升高，即為造模成功［8］。收集造模成功鼠的糞便，制備成糞菌液。

1.2.2糞菌液的制備 母嬰分離鼠糞便混合，置于無菌攪拌器內，加入PBS（糞便與PBS質量比為1∶10）攪拌，依次通過孔徑為2.0、1.0、0.5和0.25 mm的濾網過濾，勻漿并3 500 r/min離心20 min后分離純化得到糞菌液沉淀，-80℃保存備用。

1.2.3無菌鼠模型制備及糞菌移植 18只健康雄性SD大鼠按照隨機數字表法分為正常對照（Con）組、母嬰分離（NMS）組、NMS+APETx2組，每組6只。NMS組、NMS+APETx2組均予以含有抗生素的雞尾酒（ABX-water）連續灌胃5 d，構建偽無菌鼠模型［9］，之后給予NMS大鼠糞菌液（1.6 mL/kg）灌胃；Con組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次，連續灌胃5 d。灌胃結束后，NMS+APETx2組給予100μg/kg APETx2連續腹腔注射7 d，每天1次。Con組和NMS組則給予等體積生理鹽水連續腹腔注射7 d，每天1次。實驗結束后分別進行內臟敏感性和腸道動力評估，取結腸組織行免疫組化檢測。

1.2.4內臟敏感性檢測 大鼠放于特定的透明固定器，使之能自由活動，但不能轉身、掉頭，以便于觀察。參照1.2.1進行CRD刺激，觀察并記錄AWR評分。

1.2.5腸道傳輸速率測定 大鼠禁食24 h，禁水12 h，經口灌入印度墨汁0.5 mL。30 min后處死，剖腹，取出賁門至回腸末段的小腸，快速測量墨汁在腸道的推進距離及小腸全長，計算腸道推進率。腸道推進率=墨汁推進長度（cm）/小腸全長（cm）×100%。

1.2.6免疫組化染色檢測結腸中ASIC3和c-kit蛋白的表達 每組6只大鼠取結腸組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，常規包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復，滴加相應一抗，37℃過夜。滴加相應種屬二抗后，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，脫水封片，顯微鏡下觀察。每張切片隨機讀取400倍視野進行拍照。拍照時盡量使組織布滿整個視野，保證每張照片背景光一致。應用Image Pro Plus軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準，分析得出每張照片陽性的累積光密度值（integrated optical density，IOD），IOD值越大表明陽性表達水平越高。

1.2.7結腸cajal間質細胞（ICC）的分離 另取SPF級18只健康雄性SD大鼠，分組及處理方法同1.2.3。實驗結束后，大鼠禁食8 h，固定在操作臺上頸椎脫臼處死。在無菌條件下，取大鼠結腸組織，放入預先裝有D-Hank's液的培養皿中浸泡30 min，仔細剝去系膜和血管。參照文獻［10］分離細胞，用含有Ⅱ型膠原酶（1.3 g/L）的消化液處理組織塊。離心、用DMEM培養基重懸細胞后，200目篩網去除大塊組織，將細胞加入等體積的密度梯度分離液，離心獲得細胞懸液。細胞計數后，用M199培養基將細胞密度調整至1×105/mL，接種至6孔培養板。在37℃，5%CO2條件下培養，觀察ICC形態并計數。

1.3統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠糞菌移植及藥物干預后腸道動力變化 與Con組相比，NMS組大鼠小腸腸道推進率明顯減慢（P＜0.05）；與NMS組大鼠相比，NMS+APETx2組大鼠小腸腸道推進率明顯增加（P＜0.05），見圖1、2。

Fig.1 Ink movement state of small intestine in the three groups of rats圖1 3組大鼠小腸墨汁推進狀態

Fig.2 Comparison of intestinal transit rate between the three groups of rats圖2 3組大鼠小腸腸道推進率比較

2.2 各組大鼠糞菌移植及藥物干預后內臟敏感性的變化 當充氣壓力為20 mmHg時，3組大鼠AWR評分均為0。當充氣壓力為40、60和80 mmHg時，與Con組相比，NMS組腹部疼痛加重，AWR評分顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與NMS組相比，NMS+APETx2組腹部疼痛減輕，AWR評分下降（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the AWR scores of the three groups of rats under different pressures表1 3組大鼠在不同壓力下的AWR評分比較（n=6，分，±s）

Tab.1 Comparison of the AWR scores of the three groups of rats under different pressures表1 3組大鼠在不同壓力下的AWR評分比較（n=6，分，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與NMS組比較，P＜0.05

組別Con組NMS組NMS+APETx2組F 40 mmHg 0.00±0.00 0.67±0.18a 0.00±0.00b 10.000＊＊60 mmHg 0.33±0.18 1.33±0.18a 0.67±0.18b 5.833＊80 mmHg 1.00±0.22 2.00±0.22a 1.33±0.18b 4.375＊

2.3 各組大鼠糞菌移植及藥物干預后其結腸中ASIC3、c-kit蛋白表達水平變化 ASIC3主要表達于結腸黏膜層和黏膜下層的細胞胞漿中，呈暗黃色。c-kit主要表達于縱行肌和環形肌之間細胞的胞漿中，呈黃褐色，見圖3。與Con組相比，NMS組結腸組織中ASIC3、c-kit蛋白表達水平均上調（P＜0.05）；與NMS組相比，NMS+APETx2組ASIC3、c-kit蛋白表達水平下調（P＜0.05），見表2。

2.4 各組大鼠糞菌移植及藥物干預后結腸中ICC形態和數量變化 光鏡下Con組ICC胞體呈菱形或三角形，細胞核大，核周胞質較少，細胞胞體多見長突起；NMS組ICC胞體變大呈橢圓形，細胞胞體突起變短減少；NMS+APETx2組ICC胞體逐漸恢復呈菱形或三角形，細胞胞體的突起和鄰近細胞間的聯系增加，形態趨于正常，見圖4。Con組、NMS組、NMS+APETx2組ICC數量（個/視野）分別為45.00±11.45、73.50±14.04、52.67±11.66，NMS組較Con組明顯增多，NMS+APETx2組較NMS組明顯減少（F=8.435，P＜0.05）。

Fig.3 Immunohistochemical observation of ASIC3 and c-kit expression in rat colon tissue(×400)圖3 免疫組化觀察大鼠結腸中ASIC3、c-kit蛋白表達（×400）

Tab.2 Comparison of the expression levels of ASIC3 and c-kit protein in colon between the three groups of rats表2 3組大鼠結腸ASIC3、c-kit蛋白的表達水平比較（n=6，IOD值，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of ASIC3 and c-kit protein in colon between the three groups of rats表2 3組大鼠結腸ASIC3、c-kit蛋白的表達水平比較（n=6，IOD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與NMS組比較，P＜0.05

組別Con組NMS組NMS+APETx2組F ASIC3 1 400±230 4 178±438a 1 894±309b 116.219＊＊c-kit 1 309±331 5 141±687a 1 736±261b 122.242＊＊

Fig.4 The morphology of interstitial cells of Cajal in rat colon tissue(×100)圖4 大鼠結腸Cajal間質細胞形態（×100）

3 討論

腸道微生物在維持腸道內環境、腸道疾病的發生和自身穩態過程中起關鍵作用。研究發現，將IBS大鼠糞菌移植到無菌鼠后，糞便內的代謝物與內臟高敏感性的發生密切相關［11］。IBS患者短鏈脂肪酸、硫化氫（H2S）較健康者明顯增多，且短鏈脂肪酸濃度越高，腹痛越嚴重［12］。另外，腸道微生物可能調節宿主免疫應答，進一步影響IBS。IBS患者肥大細胞、T細胞等免疫細胞數量增多，其產生的活性物質可激活腸道的痛覺通路或增加腸道通透性［13］。本研究發現，IBS腸道微生物可以誘導NMS大鼠內臟敏感性增高及腸道動力改變，且既往研究已證實IBS糞菌移植引起無菌鼠腸道動力明顯異常［14］，但腸道微生物改變對腸道動力作用的機制未明確。

ASICs是一類由細胞外酸化直接激活的陽離子通道，ASICs在胃腸道分布廣泛，參與胃腸道炎性痛覺反應和機械傳導，對于維持胃腸道功能穩態起著特殊作用［6］。IBS和功能性便秘患兒糞菌移植大鼠腸道中ASIC3蛋白表達與健康兒童存在差異［15-16］。研究發現，一定的酸性環境可激活ASICs，提示其可介導炎癥或損傷后組織酸中毒引起的疼痛，ASIC3的高表達加劇了慢性炎癥性疼痛下的內臟超敏反應［7］。腸道菌群失調的代謝產物膽汁酸、乳酸、H2S以及大量的短鏈脂肪酸可降低細胞外pH［17］。另外，腸道菌群失調通過破壞黏膜屏障和改變腸道通透性，產生大量促炎因子，從而導致慢性低級別炎癥，進一步降低腸道的pH值［18-19］。本研究發現，IBS大鼠腸道微生物可以激活腸道ASIC3表達，這可能與腸道微生物介導的腸道pH值降低有關。進一步研究發現，ASIC3阻斷劑APETx2不僅能夠恢復IBS大鼠糞菌移植無菌鼠的腸道傳輸功能，且能降低內臟敏感性。此外，與NMS組相比，NMS+APETx2組ASIC3蛋白的表達水平下調，表明腸道微生物參與了IBS的產生，而ASIC3在其中發揮一定的作用，阻斷ASIC3對IBS有保護作用。

ICC是胃腸道起搏細胞，產生、傳播慢波調節腸道蠕動，并能傳導腸神經系統信號至平滑肌細胞，在腸道運動中起基礎作用。ICC數量和形態學改變與胃腸動力功能異常有密切關系，可誘發胃輕癱、慢性傳輸型功能性便秘、潰瘍性結腸炎［20-22］。SCF/c-kit系統是一個配體/受體酪氨酸激酶信號系統，介導平滑肌收縮和炎癥反應。SCF/c-kit系統刺激5-羥色胺、神經肽Y、降鈣素基因相關肽和組胺等相關介質釋放，參與神經內分泌-免疫調節，引起IBS的內臟高敏感性和胃腸動力紊亂；另外，SCF/c-kit與ICC相互依賴，兩者共同調控ICC細胞生長發育，而ICC反之可上調神經遞質控制其信號［23］。有文獻報道，阻斷SCF/c-kit信號明顯抑制IBS大鼠內臟超敏反應，ICC的活化程度也明顯降低［24］。本實驗中，APETx2能下調IBS大鼠糞菌移植無菌鼠結腸c-kit蛋白表達水平，使ICC胞體逐漸恢復呈菱形或三角形，增加細胞胞體的突起和鄰近細胞間的聯系，改善ICC形態和數量，提示ASIC3阻斷劑對IBS的保護作用可能與ICC相關的c-kit信號有關。

綜上所述，ASIC3在腸道微生物參與的IBS的發生中可能起著一定作用。阻斷體內ASIC3激活可以改善IBS內臟敏感性和腸道傳輸功能，其機制可能與ICC相關的c-kit信號有關。ASICs有可能成為IBS的潛在治療靶點。