姜黃素對酒精性肝損傷大鼠CYP3A的影響及機制探討

陳潔，劉斌，袁橋玉

酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）由長期過量飲酒造成，若不及時治療，可導致肝硬化，甚至肝癌［1］。姜黃素作為姜黃、莪術、郁金等姜黃科植物干燥根莖中的有效成分，具有抗癌、抗氧化、降脂、抗衰老等重要藥理學功效，可以改善ALD大鼠的腸損傷和肝損傷，實現對肝損傷的保護［2］，但具體機制尚不清楚。細胞色素P450 3A（cytochrome P450 3A，CYP3A）作為肝細胞主要代謝酶，其表達增強可實現對肝毒性的保護［3］。孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）、組成型雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）同作為核受體（nuclear receptors，NRs）家族成員，在調節藥物代謝、轉運、糖異生等方面具有重要作用［4］。另有研究發現，PXR/CAR通路可調控CYP3A的表達［5］。基于以上研究背景，筆者推測姜黃素在ALD中對肝細胞的保護可能與藥物代謝有關。因此，本研究通過建立ALD大鼠模型及乙醇誘導的體外肝細胞損傷模型，探討姜黃素對ALD的作用，并初步探討其代謝機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雄性SD大鼠72只，SPF級，7周齡，平均體質量（260±10）g，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠在溫度23℃、濕度40%、12 h黑暗/12 h光照條件下暫養7 d進行實驗。本研究經本院倫理學會審核并通過，實驗過程符合實驗動物3R原則。大鼠原代肝細胞由本實驗室自備。

1.2試劑與儀器 姜黃素購自美國R&D Systems公司；乙醇購自天津化工廠；siRNA-CYP3A25、siRNA-NC購自美國Sigma公司；腺苷蛋氨酸購自上海麥克林生化科技有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；一抗PXR、CAR、GAPDH購自英國Abcam公司。全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，型號BS-280）；熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time PCR，qPCR）儀（美國ABI公司，型號7500）。

1.3動物實驗

1.3.1動物造模及分組 參考文獻［6］并改進建立ALD模型，灌胃10 mL/kg 56度白酒（體積分數56%的乙醇）、2 mL/kg玉米油、25 mg/kg吡唑混合物，1次/d；同時腹腔注射0.3 mL/kg四氯化碳橄欖油溶液（四氯化碳∶橄欖油=1∶3），1次/周，連續6周，參考酒精性肝病防治指南［7］判定ALD模型成功與否。60只建模成功大鼠按隨機數字表法分為模型組，姜黃素低、中、高劑量組及陽性對照組，每組12只。姜黃素低、中、高劑量組分別用40、80、160 mg/kg姜黃素灌胃，陽性對照組腹腔注射200 mg/kg腺苷蛋氨酸，連續6周。另取12只正常飼養的大鼠為對照組，對照組和模型組均灌胃等體積生理鹽水。期間觀察大鼠一般情況。

1.3.2樣本收集 造模12周末，股動脈采血并處死大鼠，血液室溫靜置2 h，1 000 r/min離心10 min，上清液置于-20℃冰箱保存待用；肉眼觀察肝臟大體形態，取部分肝臟右葉置于4%多聚甲醛中固定，其余部分置于-80℃冰箱保存待用。

1.3.3肝功能生化指標檢測 取出血清，全自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）水平。

1.3.4HE染色觀察肝臟形態變化 取經4%多聚甲醛固定的肝臟，梯度乙醇脫水，連續切片，厚度4μm。經二甲苯脫蠟、梯度乙醇和蒸餾水水化后，蘇木素染色、流水沖洗、鹽酸乙醇分色，伊紅染色后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。光學顯微鏡下（×200）觀察肝組織情況。

1.3.5qPCR檢測肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA水平 取-80℃凍存肝臟組織30 mg，添加500μL Trizol，Trizol法提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，qPCR檢測組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA水平。引物序列見表1。上樣體積20μL：50 mg/L cDNA 1μL，2×SYBR qPCR Mix 10μL，上、下游引物（均為10μmol/L）各0.5μL，ddH2O 8μL。反應條件：94℃90 s；95℃50 s，58℃（PXR）或60℃（CAR）或61℃（CYP3A25）30 s，40個循環。2-ΔΔCt法計算PXR、CAR、CYP3A25mRNA相對表達量。

Tab.1 Sequences of the primers and product size表1 引物序列及產物大小

1.3.6Western blot檢測肝臟組織中PXR、CAR蛋白表達水平 取-80℃凍存肝臟組織30 mg，手術剪剪碎，冰上研磨，添加1 mL蛋白裂解液冰上裂解20 min，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣20μg，凝膠電泳分離蛋白質，PVDF膜轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入一抗PXR（1∶500）、CAR（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000），4℃孵育過夜；對應加入二抗，室溫孵育2 h；DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

綜上所述，雖然IgD型MM發病率低，但初發時或病程中易出現髓外累及和病情進展，臨床表現不典型，需盡早進行IgD、IgE免疫固定電泳及游離輕鏈的檢測，避免漏診或誤診。

1.4細胞實驗

1.4.1細胞培養與干預 將細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養液，37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞處于對數生長期時進行實驗。將細胞以1×105個/mL置于96孔板中，每孔100μL，分別添加0、100、200、300、400、500 mmol/L乙醇培養細胞，處理24 h，添加CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育2 h，酶標儀在490 nm處檢測光密度（OD）490。分別添加0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/L姜黃素培養細胞24 h，添加CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育2 h，酶標儀在490 nm處檢測OD490。增殖抑制率=（1-實驗組OD490/對照組OD490）×100%。

1.4.2細胞分組 以300 mmol/L乙醇、4.0μmol/L姜黃素進行下一步研究。實驗分對照組、乙醇組、姜黃素組、姜黃素+siRNA-NC組和姜黃素+siRNA-CYP3A25組。細胞處于對數生長期時以Lipofectamine 2000分別轉染siRNA-NC、siRNACYP3A25，轉染6 h后更換為完全培養液。對照組正常培養；乙醇組以300 mmol/L乙醇培養細胞24 h；姜黃素組、姜黃素+siRNA-NC組、姜黃素+siRNA-CYP3A25組均用300 mmol/L乙醇、4.0μmol/L姜黃素分別處理正常細胞、轉染siRNA-NC細胞、轉染siRNA-CYP3A25細胞24 h。每組均設6個平行孔。

1.4.3CCK-8檢測細胞增殖情況 按1.4.2處理各組細胞，添加CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育2 h，酶標儀在490 nm處檢測OD490。

1.4.4qPCR檢測細胞中CYP3A25mRNA水平 將1×105個/mL細胞置于6孔板中，參考1.4.2各劑量分別添加乙醇、姜黃素，處理24 h，Trizol法提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，qPCR儀檢測細胞中CYP3A25mRNA水平。引物序列見表1。其余步驟參考1.3.5進行。

1.4.5Western blot檢測細胞中PXR、CAR蛋白水平 按照1.4.2方法處理各組細胞，添加1 mL蛋白裂解液冰上裂解20 min，參考1.3.6方法檢測細胞中PXR、CAR蛋白水平。

1.5統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量數據均采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對大鼠一般情況的影響 對照組大鼠毛色發亮、反應靈敏，食欲和大便均正常；模型組，姜黃素低、中、高劑量組及陽性對照組均出現四肢癱軟、步履蹣跚癥狀，以及不同程度的毛色無光澤，食欲減退，反應遲鈍。模型組大鼠出現明顯的稀便現象。隨著姜黃素劑量的增加，大鼠的癥狀減輕。

2.2 姜黃素對肝功能生化指標的影響 與對照組相比，模型組ALT、AST、ALP水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，除姜黃素低劑量組的AST與其差異無統計學意義外，其余姜黃素各劑量組血清ALT、AST、ALP水平均降低，且隨著姜黃素劑量的增高，效果愈加明顯（P＜0.05）；而陽性對照組血清中ALT、AST和ALP水平較模型組亦降低，其AST水平與姜黃素高劑量組相當，ALT和ALP水平與姜黃素中劑量組相當（P＞0.05），但ALT和ALP水平高于姜黃素高劑量組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of ALT,AST and ALP between the six groups of rats表2各組大鼠血清中ALT、AST、ALP水平比較（n=12，U/L，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of ALT,AST and ALP between the six groups of rats表2各組大鼠血清中ALT、AST、ALP水平比較（n=12，U/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與姜黃素低劑量組比較，d與姜黃素中劑量組比較，e與姜黃素高劑量組比較，P＜0.05

組別對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F ALT 36.46±6.16 175.41±12.12a 133.35±10.54ab 83.48±6.51abc 49.87±5.37abcd 76.86±8.45abce 448.542＊＊AST 134.58±5.19 276.59±12.46a 246.45±12.15a 203.15±7.58abc 164.46±9.56abcd 173.16±12.15abcd 328.714＊＊ALP 103.16±8.46 213.25±9.13a 176.45±8.15ab 139.48±6.85abc 129.11±7.41abcd 143.12±7.52abce 272.341＊＊

2.3 姜黃素對肝臟大體形態及肝組織病理學的影響 肉眼觀察，對照組大鼠肝臟呈紅褐色，質地均勻，邊緣銳利，被膜光滑；模型組肝臟體積增大，表面充血，呈淺紅色，表面可見黃色顆粒，邊緣變鈍，被膜緊張；姜黃素低、中、高劑量組隨著姜黃素劑量的增加，肝臟損傷出現不同程度的改善，體積增大、表面充血程度緩解，姜黃素高劑量組肝臟呈紅褐色，質地均勻，邊緣銳利，被膜稍緊張；陽性對照組肝臟體積稍大，表面可見少許黃色顆粒，邊緣稍變鈍，被膜緊張。

Fig.1 Liver histomorphology of rats in each group(HE staining,×200)圖1 各組大鼠肝臟組織形態學情況（HE染色，×200）

鏡下可見，對照組肝臟組織細胞核大，位于細胞中央，肝細胞體積大，呈多面體形；模型組肝細胞大小不均，細胞漿出現不同程度的空泡；姜黃素低、中、高劑量組隨著姜黃素劑量的增加，細胞漿內空泡數量降低，但肝細胞體積變小現象未緩解；陽性對照組細胞漿內可見少數空泡，肝細胞體積增大，見圖1。

2.4 姜黃素對肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA水平的影響 對照組、模型組、陽性對照組肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）。分別與上述3組相比，姜黃素各劑量組肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25mRNA表達水平升高，且隨著姜黃素劑量增加，3種基因表達水平逐漸升高（P＜0.05），見表3。

2.5 姜黃素對肝臟組織中PXR、CAR蛋白表達水平的影響 對照組、模型組、陽性對照組肝臟組織中PXR、CAR蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。分別與上述3組相比，姜黃素各劑量組肝臟組織中2種蛋白表達水平升高（P＜0.05）；且隨著姜黃素劑量的增加，PXR表達水平逐漸升高（P＜0.05），而姜黃素中、高劑量組CAR表達水平高于姜黃素低劑量組（P＜0.05），但姜黃素中、高劑量組CAR表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表3。

Tab.3 Comparison of PXR,CAR,CYP3A25 mRNA and PXR,CAR protein levels in liver tissues between the six groups of rats表3各組大鼠肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25 mRNA及PXR、CAR蛋白水平比較 （n=12，±s）

Tab.3 Comparison of PXR,CAR,CYP3A25 mRNA and PXR,CAR protein levels in liver tissues between the six groups of rats表3各組大鼠肝臟組織中PXR、CAR、CYP3A25 mRNA及PXR、CAR蛋白水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與姜黃素低劑量組比較，d與姜黃素中劑量組比較，e與姜黃素高劑量組比較，P＜0.05

組別對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F mRNA PXR 1.02±0.13 1.13±0.13 3.46±0.45ab 4.15±0.56abc 6.46±0.43abcd 1.43±0.12cde 449.135＊＊CAR 1.01±0.08 0.96±0.08 1.83±0.12ab 2.36±0.20abc 3.17±0.41abcd 1.12±0.14cde 223.885＊＊CYP3A25 0.99±0.08 0.86±0.12 1.58±0.15ab 2.57±0.34abc 5.61±0.43abcd 0.97±0.08cde 693.187＊＊組別對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F蛋白PXR 0.12±0.03 0.09±0.01 0.34±0.04ab 0.59±0.06abc 0.79±0.06abcd 0.08±0.01cde 644.873＊＊CAR 0.34±0.03 0.29±0.03 0.56±0.04ab 0.65±0.05abc 0.68±0.06abc 0.31±0.04cde 206.898＊＊

Fig.2 The expression levels of PXR and CAR protein in kidney tissues of rats in each group圖2 各組大鼠腎臟組織中PXR、CAR蛋白表達水平

2.6 乙醇和姜黃素對細胞增殖的影響 0、100、200、300、400、500 mmol/L乙醇處理細胞的增殖抑制率 分 別 為0、（21.85±3.18）%、（36.19±3.82）%、（48.46±3.94）%、（64.15±4.75）%、（76.16±6.16）%（n=6，F=278.171，P＜0.01），隨著乙醇濃度的升高，細胞增殖抑制率依次升高（均P＜0.05）。當300 mmol/L乙醇處理細胞時，細胞增殖抑制率約為50%。0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/L姜黃素處理細胞的增 殖 抑 制 率 分 別 為0、（45.16±4.52）%、（42.02±6.48）%、（31.42±4.36）%、（15.84±3.48）%、（26.46±3.41）%、（31.45±2.85）%，組間比較差異有統計學意義（n=6，F=89.404，P＜0.01）。與0μmol/L姜黃素組相比，0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/L姜黃素組細胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；其他組間比較顯示，4.0μmol/L姜黃素組細胞增殖抑制率最低（P＜0.05）。因此，選擇300 mmol/L乙醇、4.0μmol/L姜黃素進行后續研究。

2.7 干擾CYP3A25對姜黃素處理細胞增殖的影響 與對照組相比，乙醇組細胞增殖抑制率升高（P＜0.05）；與乙醇組相比，姜黃素組細胞增殖抑制率降低（P＜0.05）；與姜黃素組相比，姜黃素+siRNA-NC組細胞增殖抑制率差異無統計學意義（P＞0.05），而姜黃素+siRNA-CYP3A25組細胞增殖抑制率升高（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of cell proliferation rate,CYP3A25 mRNA,PXR and CAR protein levels between the five groups of cells表4各組細胞中細胞增殖率、CYP3A25 mRNA及PXR、CAR蛋白水平比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of cell proliferation rate,CYP3A25 mRNA,PXR and CAR protein levels between the five groups of cells表4各組細胞中細胞增殖率、CYP3A25 mRNA及PXR、CAR蛋白水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與乙醇組比較，c與姜黃素組比較，d與姜黃素+siRNA-NC組比較，P＜0.05

組別對照組乙醇組姜黃素組姜黃素+siRNANC組姜黃素+siRNACYP3A25組F增殖抑制率（%）0.00±0.00 43.16±4.71a 14.58±3.46ab 15.03±3.76ab 34.49±4.17abcd 135.868＊＊CYP3A25 mRNA 1.01±0.18 0.76±0.15 3.78±0.32ab 3.84±0.55ab 1.26±0.18acd 145.289＊＊PXR蛋白0.53±0.06 0.09±0.01a 0.56±0.06b 0.58±0.08b 0.21±0.02abcd 110.064＊＊CAR蛋白0.34±0.04 0.11±0.02a 0.86±0.05ab 0.89±0.09ab 0.38±0.04bcd 249.570＊＊

2.8 干擾CYP3A25對姜黃素處理細胞中CYP3A25mRNA水平的影響 對照組與乙醇組細胞中CYP3A25mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與乙醇組相比，姜黃素組細胞中CYP3A25mRNA水平升高（P＜0.05）；與姜黃素組相比，姜黃素+siRNA-NC組細胞中CYP3A25mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05），而姜黃素+siRNA-CYP3A25組細胞中CYP3A25mRNA水平降低（P＜0.05），見表4。

2.9 干擾CYP3A25對姜黃素處理細胞中PXR、CAR蛋白水平的影響 與對照組相比，乙醇組細胞中PXR、CAR蛋白水平降低（P＜0.05）；與乙醇組相比，姜黃素組細胞中PXR、CAR蛋白水平升高（P＜0.05）；與姜黃素組相比，姜黃素+siRNA-NC組細胞中PXR、CAR蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05），而姜黃素+siRNA-CYP3A25組細胞中PXR、CAR蛋白水平降低（P＜0.05），見表4、圖3。

Fig.3 PXR and CAR protein expression levels in each group of cells圖3 各組細胞中PXR、CAR蛋白表達水平

3 討論

3.1 姜黃素對ALD的改善作用 過量飲酒會引起中毒性肝損傷，乙醇及其代謝產物進入體內，80%～90%在肝內代謝，乙醇與細胞膜直接結合可以改變細胞膜的通透性和流動性，干擾氨基酸的代謝過程，改變肝細胞氧化還原過程，影響肝臟微循環系統，危害嚴重［8］。目前尚缺乏有效治療ALD的藥物，糖皮質激素、己酮可可堿、秋水仙素、中藥等雖有一定療效，但其作用機制尚不明確。中藥及其有效成分具有療效好、價格低等優點，這為ALD的治療提供了方向［9］。姜黃素是姜黃制品中具有活性的有效成分，在肝病中具有抗氧化、抗炎、清除自由基等多方面功效［10］。本研究發現，模型組大鼠出現四肢癱軟、精神狀態差、食欲減退等癥狀，肝臟大體形態改變并存在明顯的組織病理損傷，提示ALD大鼠模型構建成功；而經不同劑量姜黃素灌胃后，ALD大鼠精神狀態、肝臟大體形態和組織病理損傷出現不同程度的改善，提示姜黃素可以改善ALD大鼠的精神狀態和肝損傷。

3.2 CYP3A在藥物代謝中的機制 CYP3A作為藥物代謝酶，可能改變藥物代謝而影響藥效。CYP3A被藥物誘導后表達量發生變化，但受個體差異的影響，藥物的生物利用度亦不同［11］。NRs可影響脂質代謝、炎癥反應等，在許多代謝類疾病、炎癥相關疾病治療和預防中發揮重要作用，改變NRs水平可能改變藥物對ALD的療效［12］。PXR和CAR均是NRs家族的非固醇類受體，PXR表達于肝臟，在結腸和小腸中少量表達，可以通過DNA反應元件與視黃酸X受體α（PXRα）結合成二聚體來活化靶基因，且PXR是CYP3A的外源性誘導關鍵介質［13］。CAR存在于肝細胞胞漿中，當細胞接觸誘導劑后移至細胞核中，與PXR反應元件起作用，直接調控CYP3A的表達［14］。本研究發現，對照組與模型組中CYP3A25mRNA及PXR、CAR蛋白水平差異無統計學意義，提示乙醇本身對PXR-CAR-CYP3A25這一藥物代謝途徑的作用可能較小。隨著姜黃素劑量的升高，肝臟組織中PXR、CAR mRNA和蛋白水平、CYP3A25mRNA水平升高，提示姜黃素可能通過上調ALD大鼠肝臟組織中PXR、CAR表達誘導CYP3A25水平升高，進而提高藥物的生物利用度。陽性藥物腺苷蛋氨酸雖然也可以緩解ALD大鼠肝損傷，但卻不是通過PXR、CAR誘導CYP3A25水平升高這一途徑發揮作用。

本研究進一步在細胞中驗證姜黃素功能，發現不同濃度乙醇處理后，肝細胞均出現增殖抑制率升高現象，以增殖抑制率約50%時的乙醇濃度進行后續研究；不同濃度姜黃素處理肝細胞后，在4.0μmol/L時對肝細胞影響較小，因此本研究以300 mmol/L乙醇、4.0μmol/L姜黃素進行干預，結果顯示乙醇可促進細胞增殖抑制率升高，而姜黃素可緩解該種情況，提示姜黃素可緩解乙醇誘導的肝細胞損傷。此外，本研究結果顯示，乙醇對肝細胞中CYP3A25表達的影響較小（與對照組比較P＞0.05），而姜黃素能夠促進乙醇誘導的肝細胞中CYP3A25表達，并且促進PXR、CAR表達；且在姜黃素干預基礎上添加siRNA-CYP3A25后，姜黃素對上述指標的作用減弱，提示姜黃素通過上調CYP3A25表達實現對肝細胞的保護，且PXR、CAR表達水平升高也可能參與了此過程。

綜上所述，姜黃素通過上調CYP3A25的表達提升藥效，進而提高治療ALD藥物的生物利用度，且這一過程可能與上調PXR、CAR表達有關。