熱輔助超聲波處理對獼猴桃濁汁的殺菌效果及品質影響研究

葉 青 趙武奇 白斯可 張濟英 聶聰怡 錢 蕊 伍小丫

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119)

獼猴桃(Actinidiachinensis)富含氨基酸、礦物質、維生素等多種營養物質[1]，與清汁、復配汁相比，獼猴桃濁汁能更多地保留獼猴桃原有的營養成分，具有原料利用率高，香氣及口感純正等優點，受到越來越多消費者的青睞[2]。但新鮮的濁汁易受微生物和酶的影響，導致品質變差，因此，殺菌滅酶是果汁生產中的關鍵工序[3]。目前，濁汁殺菌主要采用高溫短時殺菌和超高壓殺菌。高溫短時殺菌存在熱敏性營養物質損失嚴重、色澤變暗及穩定性降低的缺點[4]；超高壓殺菌存在設備投入大及密封性要求嚴格的缺點[5]。熱輔助超聲波處理是一種聲熱結合的殺菌技術[6]，具有安全性高、殺菌效果好、營養物質損失少的優點[7]，已在蘋果汁[8]、甘蔗汁[9]、南瓜汁[10]、楊梅汁[11]、草莓汁[12]等果蔬汁加工中取得了一定的效果，將其應用于獼猴桃濁汁的殺菌對于提高產品質量具有重要意義。本試驗在研究不同熱輔助超聲波處理工藝參數對獼猴桃濁汁理化特性的影響及殺菌效果的基礎上，優化得出最佳工藝參數，以期為熱輔助超聲波技術應用于獼猴桃濁汁的加工過程提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦美獼猴桃，于2019年9月采自陜西省西安市周至縣佰瑞獼猴桃種植基地。選取成熟度基本一致、大小均勻、未軟化、無病蟲害、無機械損傷的獼猴桃。試驗前將獼猴桃置于0±0.5℃條件下貯藏。

抗壞血酸，成都市科龍化工試劑廠；平板計數瓊脂，北京市奧博星生物技術有限公司；碳酸氫鈉，西安化學試劑廠；草酸、蒽酮、碳酸鈣、蔗糖、石英砂、氫氧化鈉、氯化鈉，天津天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AB104-N電子天平，上海第二天平儀器廠；NS色差儀，深圳三恩馳科技有限公司；UV-1800紫外分光光度計，日本島津公司；8101手持式阿貝斯折光儀，大連先超科技有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，上海新苗醫療器械制造有限公司；XO-SM50超聲波微波協同反應工作站，南京先歐儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 獼猴桃濁汁樣品的制備 獼猴桃清洗→去皮→切塊→榨汁→過濾(300目)→獼猴桃濁汁。

1.3.2 獼猴桃濁汁殺菌試驗 取50 mL獼猴桃濁汁樣品，密封包裝，以超聲功率、溫度、超聲時間為影響因素，進行Box-Behnken三因素三水平響應面試驗，其中超聲工作模式為：超聲工作2 s后停1 s。每個試驗重復3次，取平均值。響應面試驗因子與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計因子與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.3 試驗指標的測定與計算

1.3.3.1 濁度的測定 將樣品搖勻后置于比色杯中，使用色差儀在總透射(total transmission,TTRAN)模式下測定濁度，使用前用蒸餾水校正[13]。

1.3.3.2 顏色、褐變度的測定 果汁顏色測定：通過色差儀直接測定L*、a*、b*值，按照公式計算色差值(△E)：

(1)

式中，L0、a0、b0為初始樣品的測定值；L*、a*、b*為殺菌后樣品測定值。

褐變度的測定[14]：使用分光光度計，以蒸餾水為空白，用420 nm波長下的吸光度表示褐變度。

1.3.3.3 營養組分的測定 參考《GB/T 10468-1989水果和蔬菜產品pH值的測定方法》[15]測定酸堿度(potential of hydrogen,pH)；用酸堿滴定法測定可滴定酸(titratable acid,TA)含量，以檸檬酸計，參照《GB/T 12456-2008食品中總酸的測定》[16]；采用蒽酮試劑法測定可溶性糖含量[17]；抗壞血酸(vitamin C,Vc)含量測定采用2,6-二氯靛酚滴定法，參照《GB 5009.86-2016食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》[18]；用紫外分光光度計測定總酚含量[19]；葉綠素含量用比色法測定[20]；用手持式糖度儀測定可溶性固形物(total soluble solids,TSS)含量[21]。

按照公式計算糖酸比、Vc保存率、葉綠素保存率：

(2)

(3)

(4)。

1.3.3.4 抗氧化物酶活性測定 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、過氧化物酶(peroxidase,POD)活性的測定分別采用鄰苯二酚比色法和愈創木酚比色法[22]。

1.3.3.5 菌落總數的測定 測定方法參照《GB 4789.2-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[23]。根據公式計算殺菌率[24]：

殺菌率=

(5)。

1.3.4 特征指標的篩選及最優工藝參數的確定 將響應面試驗數據進行相關性分析，在此基礎上利用主成分分析(principal component analysis,PCA)提取獼猴桃濁汁的理化特征指標，建立理化特征指標和殺菌率的二次方程回歸模型，分析影響各指標的主次因素及因素間的交互作用[25]。通過綜合優化得出熱輔助超聲波處理獼猴桃濁汁的最佳工藝參數，其中各指標綜合的權重計算采用熵權法[26]確定。

1.3.5 數據分析 采用SPSS 20.0軟件進行相關分析及PCA；使用Design Expert 10設計三因素三水平響應面試驗、進行數據分析、建立回歸方程，顯著水平設置為0.05。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果

獼猴桃濁汁殺菌試驗的設計與試驗結果見表2。表中1～17號是響應面設計的17組殺菌條件所得樣品的測定值，18號是未處理樣品測定值。

2.2 獼猴桃濁汁理化特征指標提取

殺菌是果汁加工生產中的重要環節，因此選取殺菌率作為優化工藝參數的主要指標之一。對表2，表3中的pH、濁度(nephelometric turbidity unit,NTU)、TA含量、L*、a*、b*、△E、褐變度(degree of browning,DB)、Vc保存率、糖酸比、TSS含量、總酚含量、可溶性糖含量、葉綠素保存率、POD活性、PPO活性16個指標進行相關性分析，結果見表4。

表2 獼猴桃濁汁殺菌試驗設計與結果Table 2 Experimental design and result of sterilization of cloudy kiwi juice

表3 獼猴桃濁汁殺菌試驗設計與結果Table 3 Experimental design and result of sterilization of cloudy kiwi juice

由表4可知，16個指標的相關性較高，可利用變量相關性合理分組的主成分分析法減少變量個數，提取理化特征指標，其中PPO和POD活性與獼猴桃果汁的外觀品質、營養物質相關性高，因此，可將這兩種酶與其他理化指標一起進行特征提取。

表4 16項指標的相關性分析Table 4 Correlation coefficient of 16 indices

圖1為對16個評價指標進行主成分分析時的成分特征值貢獻碎石圖，圖中越陡峭的線段對應的成分對變異貢獻率越大，反之則越小。可以看出，前4個成分曲線陡峭，第5個成分之后曲線斜率明顯增大。表5為主成分分析解釋總變量，前4個成分的累計方差貢獻率達到78.787%，表明這4個成分表達了獼猴桃濁汁理化指標的絕大多數信息。因此，可以將評價獼猴桃濁汁的理化指標壓縮為4個主成分。

表5 成分分析解釋總變量Table 5 Total variance explained of component analysis

由表6可知，成分1中代表性指標有葉綠素保存率、POD活性、pH、TA、Vc保存率，體現了獼猴桃汁的熱敏性成分保存率和酸味特征，其中葉綠素保存率的權重最大(0.881)，葉綠素保存率與pH、POD活性、Vc保存率之間呈顯著相關，因此可選取葉綠素保存率作為成分1的特征指標；成分2中代表性指標有PPO活力、DB、NTU、a*值，體現了獼猴桃汁的外觀特征和貯藏品質，其中PPO活性權重最高(0.928)，PPO活性與NTU、DB之間呈極顯著相關，可選取PPO活性作為成分2的特征指標；成分3中代表性指標有△E值與b*、L*，體現了獼猴桃汁的色澤特征，其中△E值權重最高(0.958)，△E值與b*值、L*值均呈極顯著負相關，可選取△E為成分3的特征指標；成分4的代表性指標有TSS、可溶性糖含量、總酚含量、糖酸比，體現了獼猴桃濁汁的風味特征，雖然TSS的權重最高(0.886)，但考慮到糖酸比能更好地反映獼猴桃濁汁的風味特征，且糖酸比與TSS、可溶性糖含量均呈極顯著正相關，因此選擇糖酸比作為成分4的特征指標。綜上所述，篩選出的評價獼猴桃濁汁的理化特征指標為葉綠素保存率、PPO活性、△E值及糖酸比。

表6 旋轉成分矩陣Table 6 Rotated component matrix of factor analysis

2.3 響應面回歸模型的建立與分析

采用Design-Expert軟件進行數據分析，建立回歸模型，可分別得到獼猴桃濁汁的葉綠素保存率(Y1)、PPO活性(Y2)、△E值(Y3)、糖酸比(Y4)和殺菌率(Y5)與熱輔助超聲波處理工藝條件之間的多項式模型，其中A、B、C為編碼自變量：

Y1=26.79-2.36A-14.86B-4.48C+7.08AB+4.25AC-0.94BC-11.98A2+15.85B2+10.19C2

(10)

Y2=37.18+0.14A-6.47B+1.10C+14.27AB+15.78AC+2.24BC+37.53A2-13.26B2+0.08C2(11)

Y3=2.85-0.65A+1.04B-0.14C+0.21AB+2.02AC-1.36BC+1.99A2+2.27B2-0.004C2

(12)

Y4=6.38-0.11A-0.19B+0.21C+0.49AB+0.06AC-0.38BC

(13)

Y5=81.47+6.28A+28.50B+9.73C-3.69AB-0.81AC-4.14BC-6.17A2-11.60B2-6.47C2

(14)

由表7可知，各指標失擬項均不顯著，建立的模型均顯著，表明回歸方程可信度高，可用于試驗結果的預測。各參數對葉綠素保存率的影響大小順序依次是B>C>A，B和B2對葉綠素保存率影響極顯著，A2和C2影響顯著；對PPO活性的影響大小順序依次是B>C>A，A2對PPO活性影響極顯著，AB、AC和B2對PPO活性影響顯著；對ΔE值影響的大小順序依次是A>C>B，B2和C2對ΔE值的影響極顯著，A和A2影響顯著；對糖酸比影響的大小順序依次是C>B>A，AB對糖酸比影響極顯著，C、BC和B2影響顯著；對殺菌率影響的大小次序依次是B>C>A，B、C和B2對殺菌率影響極顯著，A影響顯著。

表7 葉綠素保存率、PPO活性、△E值、糖酸比、殺菌率的回歸方程系數顯著性檢驗結果Table 7 Test of significance for regression equation coefficients of ratio of preservation rate of chlorophyll,activity of PPO,ΔE value,the ratio of sugar to acid,antibacterial rate

2.4 參數間交互作用分析

采用Design-Expert軟件進行數據分析，響應曲面圖可以直觀表現出各參數之間交互作用，拋物面越明顯，則參數之間的交互作用越強；反之則越弱。

圖2是超聲時間為17.5 min時，PPO活性與超聲功率和溫度的交互作用曲面圖。隨著超聲功率的增大，PPO活性呈先減小后增大的趨勢。這是由于當超聲功率小于450 W時，隨著超聲功率的增加，空化作用、熱效應和機械作用增強，滅酶效果增強，當超聲功率過高時，高強度超聲波易在超聲波探頭周圍形成稠密的空化云，阻礙了能量的傳播，滅酶效果反而越差[27]。

圖2 超聲功率與溫度交互作用對PPO活性的響應面圖Fig.2 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and temperature on activity of PPO

圖3是溫度為42.5℃時，PPO活性與超聲功率和超聲時間的交互作用曲面圖。當選用較低超聲功率及固定溫度時，隨著超聲時間的延長，空化作用時間延長，使得空化效果及滅酶效果更佳，PPO活性呈現減小的趨勢；當選用較高超聲功率時，由于空化效果較強，隨著超聲時間的延長空化效果更強，導致PPO的分子結構改變，提高了PPO活性，滅酶效果變差。

圖3 超聲功率與超聲時間交互作用對PPO活性的響應面圖Fig.3 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and ultrasonic time on activity of PPO

圖4是超聲功率為450 W時，糖酸比與超聲時間和溫度的交互作用曲面圖。隨著溫度升高，超聲時間增加，獼猴濁汁糖酸比呈現增大的趨勢。這是由于超聲時間的延長對細胞破壞程度加大，細胞呼吸速率加快，一方面果實內不溶性淀粉轉化為可溶性糖；另一方面加速了有機酸的TAC循環和糖異生，使有機酸被轉化為糖或被氧化，致使TA含量減少[28]，這與張琪等[29]的研究結果一致。

圖4 超聲時間與溫度交互作用對糖酸比的響應面圖Fig.4 Response surface plots of the interaction of ultrasonic time and temperature on ratio of sugar to acid

圖5是超聲時間為17.5 min時，糖酸比與溫度和超聲功率的交互作用曲面圖。當超聲時間一定時，隨著溫度的升高，超聲功率的增大，糖酸比先減小后增大，這可能是由于溫度較低和超聲功率較小時，熱輔助超聲波處理對細胞破壞程度小，僅使得細胞內有機酸釋放量增大，產生更多可滴定酸，而未能達到加速細胞呼吸的程度，可滴定酸消耗速率不變，整體表現為獼猴桃濁汁可滴定酸含量增大，糖酸比減小；當溫度和超聲功率增大時，細胞呼吸作用顯著增強，有機酸被大量消耗，從而使糖酸比增大，其中可滴定酸的變化趨勢與曾祥媛等[30]的研究結果一致。

圖5 超聲功率與溫度交互作用對糖酸比的響應面圖Fig.5 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and temperature on ratio of sugar to acid

2.5 熱輔助超聲波處理獼猴桃濁汁最佳工藝參數的確定及驗證

將表2和表3中1～17組樣品的殺菌率及理化特征指標的數據進行標準化處理，根據標準化矩陣計算得出的信息熵和熵權如表8所示，可得出5個指標的權重比近似為2∶2∶4∶1∶2。

結果表明，葉綠素保存率越高，濁汁色澤越佳，外觀品質越好，同時，葉綠素是熱敏性物質，獼猴桃汁葉綠素保存率越高，其他熱敏性物質的保存率也相對越高。PPO是催化果蔬酶促褐變的關鍵酶，PPO活性與果蔬褐變程度相關，PPO活性較低時，能有效抑制褐變的發生[31]。ΔE值越小說明處理后的濁汁與鮮樣色差越小，色澤保持度越高。糖酸比代表獼猴桃汁的風味特征，數值過大表示風味偏甜，味道單調，數值過小表示口感過酸，食用品質差[32]。糖酸比為5～7的獼猴桃果汁酸甜可口[33]。

因此，以殺菌率最高、ΔE值最小、糖酸比為5～7、葉綠素保存率最高、PPO活力最小作為優化目標，并根據指標權重比將5個指標的權重分別設為2、2、4、1、2，應用軟件的綜合優化功能，對熱輔助超聲處理獼猴桃汁的工藝參數進行優化，得到最佳工藝參數為：超聲功率422.14 W、超聲時間30 min、溫度59.99℃。考慮到實際條件，調整為：超聲功率420 W、超聲時間30 min、溫度60℃。在此工藝參數下處理的獼猴桃汁的試驗結果見表9。

表9 回歸方程預測效果表Table 9 Prediction effect of regression equation

由表9可知，在此工藝參數下理化特征指標和殺菌率的測定值與預測值的相對誤差均小于5%，表明建立的回歸模型可信度高，可用于熱輔助超聲波處理獼猴桃濁汁各項指標的預測。

3 討論

3.1 熱輔助超聲技術對獼猴桃濁汁的殺菌效果

最佳工藝條件下熱輔助超聲波對獼猴桃濁汁的殺菌率為95.68%，這與Nayak等[34]的研究結果一致。最佳工藝參數下，獼猴桃濁汁的菌落總數為27.2 CFU·mL-1，符合國家飲料食品衛生標準GB 4789.2-2016的要求 (≤100 CFU·mL-1)[23,35]。熱輔助超聲波技術具有“熱效應”和“非熱效應”雙重殺菌作用，殺菌效果顯著。超聲波主要通過的空化作用進行殺菌，大量氣泡在液體媒質中產生，運動中產生較大剪切力，同時在氣泡破裂瞬間形成局部的高溫高壓，微生物的細胞結構被破壞，導致細胞溶解[36]。熱輔助超聲波各參數對殺菌率的影響由大到小依次是溫度(B)>超聲時間(C)>超聲功率(A)，3個參數對殺菌率均有顯著影響。隨著溫度的升高，超聲殺菌效果增強，這可能是因為在溫度升高的過程中，細胞膜流動性增強，導致細胞膜更易破裂，殺菌效果增強。而超聲功率增大，超聲時間延長都會增強超聲波的空化效果，進而提高殺菌率。

3.2 熱輔助超聲技術對獼猴桃濁汁理化特征指標的影響

在果蔬汁中由于酶的作用，營養物質被分解，外觀品質變差。POD與果蔬褐變和異味產生密切相關，是果蔬成熟和衰老的生理指標。本研究結果表明，熱輔助超聲波處理后的獼猴桃濁汁POD活性與未處理樣品相比有所降低(表2、表3)，說明熱輔助超聲處理可以抑制POD活性。POD具有熱穩定性，通常當溫度達到80℃，POD才會完全失活。本研究發現，獼猴桃濁汁POD活性與葉綠素保存率、Vc保存率呈顯著正相關(表4)。這可能是因為高溫會降低POD活性，但同時也會破壞葉綠素和Vc等熱敏性成分。因此為了避免因高溫引起的營養物質及外觀品質的變化，不能將POD徹底滅活。PPO在有氧條件下與酚類物質發生反應，酚類物質被氧化成醌類物質，再通過一系列脫水-聚合反應，最終形成黑褐色物質，發生酶促褐變[37]。熱輔助超聲波對酶的作用機理較復雜，主要通過空化作用改變酶的結構從而抑制酶的活性[38]。

熱輔助超聲處理能夠較好地保持獼猴桃汁的風味物質和外觀品質。與未處理樣品相比，熱輔助超聲處理的獼猴桃汁糖酸比有不同程度地增大，但均在5～7之間，在最佳工藝條件下，糖酸比為6.17，果汁酸甜可口，風味口感好，熱輔助超聲波技術可用于獼猴桃濁汁的加工。在最佳參數下，獼猴桃濁汁△E值為4.43，葉綠素保存率為30.99%，與未處理樣品差異較大。葉綠素在pH值為3.3左右的濁汁中很不穩定，且耐熱性差，高溫處理使得葉綠素分解，導致獼猴桃濁汁綠色變淺。

4 結論

獼猴桃濁汁的理化特征指標為葉綠素保存率、糖酸比、△E值、PPO活性，建立的獼猴桃濁汁的理化特征指標及殺菌率的回歸方程模型具有統計學意義(P<0.05)，可用于分析和預測熱輔助超聲處理參數對獼猴桃濁汁理化特征指標及殺菌率的影響；熱輔助超聲處理獼猴桃濁汁的最佳工藝條件為：超聲功率420 W、超聲時間30 min、溫度60℃，在此工藝條件下對獼猴桃濁汁進行處理，獼猴桃汁的殺菌率為95.68%、△E值為4.43、糖酸比為6.17、葉綠素保存率為30.99%、PPO活性為19.48 U·mL-1。熱輔助超聲波處理獼猴桃濁汁具有污染少，安全性好，無毒副作用等優點，處理后的獼猴桃濁汁殺菌率高，品質較好，結果表明熱輔助超聲波技術可用于獼猴桃濁汁的加工。