無刺花椒離體培養再生體系的建立

張彩霞

（甘肅林業職業技術學院，甘肅天水 741020）

花椒屬蕓香科花椒屬落葉小喬木，是我國主要的香料和油料作物，近年來種植效益較高，人們種植的積極性也很高［1］。但由于花椒的枝干上均密生皮刺，其采摘困難，費時費工，制約了花椒產業的發展。雖然經過多年的試驗，但目前仍然未能找到很好代替人工采摘的機械或化學方法，因此，選用和種植無刺花椒是解決花椒采摘難、采摘成本高這一問題的主要途徑［2］。

目前，我國無刺花椒品種資源較為豐富，有從日本引進的葡萄山椒、朝倉花椒，我國自己培育出的隴南無刺椒、農城1 號、漢源無刺花椒等［3］。這些無刺花椒品種利用實生繁殖常會發生無刺性狀變異的現象［4］，因此目前普遍采用無性繁殖。植物組織培養與傳統無性繁殖技術相比，能保持品種的優良性狀，并且繁殖速度快、效率高，因此通過離體培養在短期內獲得性狀穩定的大量優良無刺花椒種苗，是促進無刺花椒發展的有效途徑［5-6］。以隴南無刺花椒嫩葉為材料，研究了不同消毒劑種類和不同消毒時間對外植體消毒效果的影響和不同配方的培養基對愈傷組織誘導率及芽分化率的影響，建立了初代離體再生體系，以期為無刺花椒種苗的工廠化生產提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

隴南無刺花椒，采集于甘肅省武都區，選擇具有典型性狀、無病蟲害的健壯無刺花椒植株，剪取當年生新梢，選取幼嫩葉片為外植體材料。試驗于甘肅林業職業技術學院林木組織培養實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒處理

將選取的嫩枝剪下葉片，沿中脈將葉片剪成 1～2 cm2的小塊，置于燒杯中流水沖洗60 min，然后將材料于70%的酒精中浸泡30 s，無菌水沖洗3～4 次，再分別用0.1% HgCl2和2% NaClO 進行消毒處理（0.1% HgCl2處理時間分別為3 min、6 min、8 min，2% NaClO處理時間分別為8 min、12 min、15 min）。最后用無菌水沖洗3～5次，然后將消毒好的嫩葉切成0.5 cm2的小塊，接種在培養基中培養，接種10～15 d 后觀察污染、死亡及啟動情況：有菌斑出現，即統計為污染，按瓶數計算；外植體保持新鮮，沒有出現變黑死亡，且10 d 后葉片周圍切口出現膨大腫脹，說明成活，成活率按照成活外植體數占接種葉片總塊數的百分比來計算。

1.2.2 愈傷組織誘導

以MS 培養基為基本培養基，培養基中添加蔗糖 30 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，將pH 值調至5.8～6.0。誘導外植體材料產生愈傷組織的培養基為MS+6-BA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）+2,4-D（0.1 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1），共9 個處理，每個處理20 瓶，3 次重復。15 d 后統計不同植物激素濃度配比下無刺花椒愈傷組織誘導率，用產生愈傷組織的外植體數量占培養外植體總數量的百分比表示。設置培養溫度（25±1）℃，光照時間12 h·d-1，光照強度1 500～2 000 lx。

1.2.3 芽誘導

誘導外植體產生愈傷組織后，選擇生長良好的愈傷組織，將其分離，轉接于不同激素配比的培養基中，配方為MS+6-BA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）+NAA（0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1），誘導愈傷組織再分化產生不定芽，統計芽分化率及芽生長狀況，用誘導產生芽的愈傷組織數占培養的總愈傷組織的百分比來表示。共9 個處理，每處理接種20 瓶，3 次重復。培養條件同上。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理對外植體消毒效果的影響

外植體消毒接種10 d 后開始觀察統計污染情況及外植體存活率，發現各處理均有不同程度的污染，污染類型多為白色、灰色霉菌污染及黏液狀白色細菌污染，菌落主要在外植體邊緣的培養基上，隨著時間的推移菌斑會向外擴散，污染嚴重的會長滿整個培養基表面，說明污染是由于外植體消毒不徹底造成的。2 種不同消毒劑消毒效果見表1。從表1 可以看出，0.1% HgCl2在3種不同消毒時間處理下污染率平均較2% NaClO 處理的低，成活率總體也較2% NaClO 處理的低，而且隨著2% NaClO 消毒時間延長，外植體成活率沒有降低。在使用0.1% HgCl2消毒的3 個處理中，消毒6 min 污染率較低，為18.3%，而外植體成活率較其他2 個處理要高，為55.3%；在使用2% NaClO 消毒的3 個處理中，消毒15 min 污染率較低，為13.3%，外植體成活率最高，為62.8%。說明隴南無刺花椒嫩葉采用70%酒精處理30 s后，再用0.1% HgCl2消毒6 min，或者用2% NaClO 消毒15 min 均能達到較好的消毒效果且能保證較高的外 植體成活率。

表1 不同消毒處理的消毒效果

2.2 不同激素濃度配比對外植體愈傷組織誘導的影響

在誘導外植體產生愈傷組織的試驗中，共9 個處理，激素配比組合如表2 所示。試驗結果表明，當培養基中添加6-BA 和2,4-D 濃度較低時，愈傷組織的誘導率較低，觀察發現愈傷組織生長也較為緩慢，但愈傷組織的質地較好，松散且顏色呈淡黃綠色。隨著培養基中6-BA和2,4-D 的濃度升高，愈傷組織誘導率有較大的提高，當6-BA 濃度為1.0 mg·L-1、2,4-D 濃度為0.3 mg·L-1和0.5 mg·L-1時，愈傷組織誘導率最高，分別為65.9%和60.6%。但當6-BA 濃度繼續增加，愈傷組織誘導率開始降低，且愈傷組織質地致密；當在培養基中添加相同濃度的6-BA 時，隨著2,4-D 濃度增大，愈傷組織誘導率會提高，但增加到0.5 mg·L-1時又呈下降趨勢，而且部分愈傷組織出現褐化。從表2 中可以看出，培養基配方為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1愈傷組織誘導率最高，為65.9%，誘導的愈傷組織結構松散、色澤鮮艷，增殖能力強。

表2 不同激素配比對愈傷組織誘導率的影響

2.3 不同激素濃度配比對芽分化率的影響

初代培養誘導外植體產生愈傷組織，之后將生長良好的愈傷組織轉入添加了不同濃度的6-BA 和NAA 的MS 培養基上進行分化誘導，統計不定芽分化率，結果見表3。從表3 可以看出，不同濃度6-BA 與NAA 組合，對無刺花椒愈傷組織誘導分化不定芽有顯著的影響，隨著6-BA 濃度的提高，芽分化率有所提高，但濃度過高會反而會抑制芽的分化，且隨著6-BA 濃度的提高芽分化的數量增加，但由于芽的密度過大導致芽生長細弱、顏色發黃。因此適宜的濃度配比才能同時保證較高的芽分化率和芽質量。在9 個濃度配比中，當6-BA 濃度為 1.0 mg·L-1、NAA 濃度為0.3 mg·L-1時，芽分化率最高，為82.6%，并且不定芽粗壯顏色深，生長良好，其次是6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA 濃度為0.2 mg·L-1時，芽分化率較高，為80.7%。因此篩選出誘導無刺花椒不定芽分化的最適培養基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。

表3 不同激素配比對芽誘導的影響

3 結論與討論

在離體培養過程中，外植體的消毒是影響培養成功的關鍵因子之一，而消毒劑的選擇和消毒時間的把控是外植體消毒的關鍵。通過2 種不同的消毒劑對無刺花椒嫩葉進行消毒處理，發現用70%酒精處理30 s 后，再用0.1% HgCl2消毒6 min，和 用2% NaClO 消毒15 min 均能達到較好的消毒效果且能保證較高的外植體成活率。HgCl2是消毒作用強且常用的一種消毒劑，但其對人體有一定危害，且容易殘留在外植體材料中不容易清除［7］，對外植體材料的生活力損害較大，試驗結果也表明隨著HgCl2消毒時間增加，外植體的成活率會下降。而2% NaClO 隨著消毒時間延長外植體成活率無明顯下降，且對人體安全無毒，因此在生產和科研中可以利用NaClO替代HgCl2作為常用的消毒劑。

誘導外植體材料產生優質的愈傷組織是無刺花椒離體培養建立再生體系、進而產生完整試管苗的基礎，是離體培養的重要階段。選用MS 基本培養基加入1.0 mg·L-16-BA 和0.3 mg·L-12,4-D，對隴南無刺花椒愈傷組織誘導率最高，誘導的愈傷組織結構松散、色澤鮮艷，增殖能力強。初代培養誘導外植體產生的愈傷組織，選擇生長良好的將其轉入添加不同濃度的6-BA 和NAA 的培養基中誘導芽的分化，結果表明，誘導無刺花椒不定芽分化的最適培養基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1，試驗結果為無刺花椒試管苗的生產奠定了基礎。

目前有關無刺花椒組織培養的研究較少。以隴南無刺花椒嫩葉作為外植體，獲得了較高的愈傷組織誘導和芽分化率，篩選出無刺花椒初代培養的最適培養基，建立了無菌再生體系。未來在初代培養研究的基礎上，還要進一步研究繼代增殖培養、生根培養技術，建立穩定的離體快繁技術體系，擴大規模，形成生產化模式，為無刺花椒良種繁育提供技術支撐。