桃不同品種對低溫脅迫的生理響應及評價

王召元 田啟航 常瑞豐 劉國儉 陳 湖 李永紅

(河北省農林科學院 昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600)

低溫是限制桃樹生長發(fā)育的主要環(huán)境因子之一，在我國華北桃栽培區(qū)，冬季絕對低溫低，導致桃樹凍害現(xiàn)象經常發(fā)生，給當地桃產業(yè)帶來了嚴重損失，選用抗寒桃品種是解決凍害的最有效途徑之一[1]。因此，準確評價不同桃種質的抗寒能力，對種質資源的利用及優(yōu)良抗寒品種的選育具有重要意義。

抗寒性是桃的一個重要性狀，其評價方法已有不少報道，枝條電導法是比較常用的評價方法。通過測定不同溫度處理下枝條的相對電導率(REC)，擬合Logistic方程求解低溫半致死溫度(LT50)，可以有效的反映桃品種的抗寒能力[2-4]。王小麗等[2]和趙秀梅等[3]利用此方法篩選出‘隴蜜9號’‘隴蜜12號’‘丁家壩青皮桃’‘夏至早紅’等高抗寒種質，‘農神蟠桃’‘2010西藏17號’‘2010西藏54號’不抗寒種質。電阻抗法也是有效的抗寒性評價方法，張海旺等[5]研究認為，胞外電阻率和弛豫時間是鑒定桃枝條抗寒性的最佳參數，并鑒定出‘燕紅’為高抗寒種質，‘中華壽桃’為不抗寒種質。趙雪輝等[6]和張立磊等[7]研究表明，可溶性糖與抗寒性相關性不顯著，電解質滲出率、丙二醛、脯氨酸和可溶性蛋白等指標是桃抗寒性評價的敏感指標。然而桃的抗寒性受多種因素影響，并且不同品種對低溫的響應存在差異，單獨用某一生理指標難以客觀評價抗寒性的強弱。目前，隸屬函數法是果樹抗寒性評價研究中普遍采用的方法之一，此方法是根據模糊數學原理，計算各構成指標相應的隸屬函數值，進行加權得到其綜合評估值，可較為全面的對考察對象進行綜合評價，評價結果更加準確、客觀[8]。目前這一方法已在蘋果、核桃和葡萄等果樹抗寒性評價中得到廣泛應用[8-10]。

本研究通過測定12個桃品種在低溫梯度處理條件下的相對電導率、滲透調節(jié)物質質量分數(可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸)、丙二醛質量摩爾濃度和束縛水/自由水的變化，采用隸屬函數法對其抗寒性進行綜合評價，以期為桃抗寒種質創(chuàng)新以及品種的適宜種植區(qū)域劃分提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用12個桃品種分別為‘承德1號’‘承德2號’‘金奧’‘秋燕’‘秋戀’‘03-22-034’‘02-13-140’‘03-49-079’‘晚蜜’‘慶豐’‘春雪’‘大久保’，定植于河北省農林科學院昌黎果樹研究所桃資源圃，露地栽培。圃內土壤為沙壤土，土壤肥力中等，各桃品種以毛桃為砧木，采用2主枝開心形，株行距2 m×5 m，樹齡11年，管理水平一致，選取1年生休眠枝條為試驗材料。

1.2 試驗處理

2019年1月12日，于樹冠外圍中部隨機剪取長勢相近、粗度一致的1年生枝條，取枝條樣品中部枝段，用自來水洗凈，去離子水沖洗3次，濾紙吸干表面水分，兩端剪口封蠟。之后每品種隨機選取15根枝條為一組，共計8組，裝入聚乙烯自封袋中，分別置于GDJS-500L型高低溫濕熱交變試驗箱(蘇州市奧貝思環(huán)境試驗設備有限公司)中進行低溫處理，設置0 (CK)、-10、-15、-20、-25、-30、-35 和-40 ℃ 8個低溫處理，每處理均以4 ℃/h降溫速率降溫至目的溫度后保持12 h，之后以同樣速率升溫至0 ℃，保持2 h，后放入0 ℃冰箱中備用。各項指標測定前，需將冷凍枝條于室溫(20 ℃)下放置8 h。每個處理3次重復，每個重復處理5根枝條。

1.3 測定指標及方法

1.3.1相對電導率的測定

相對電導率采用電導法測定[11]。將低溫處理后的枝條避開芽眼剪成0.3 cm的小段，準確稱取2 g，放入30 mL刻度試管中，加入去離子水25 mL，封口，在室溫(20 ℃)下浸泡24 h，中間不斷搖動試管，用DDS-11A 型電導率儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)測定浸提液初始電導率(C1)；然后封口，沸水浴30 min殺死組織，靜置3～4 h后搖勻，再測定終電導率(C2)，重復3次。相對電導率(REC)=C1/C2×100%。

1.3.2枝條萌芽率

枝條萌芽率采用恢復生長法調查[12]。將低溫處理后的枝條，置于PR系列微電腦人工氣候箱中(南京紅龍儀器設備廠)水培培養(yǎng)(25 ℃，3 000 lx)，每天換水1次，20 d后調查累計發(fā)芽數。待發(fā)芽數恒定后，計算萌芽率。萌芽率=萌芽數量/總芽數量×100%，重復3次，每次選取3根枝條。

1.3.3其他生理指標的測定

參照李合生[13]的方法測定各生理指標。丙二醛(MDA)質量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸法測定,可溶性糖質量分數采用蒽酮法測定,脯氨酸質量分數采用酸性茚三酮法測定,可溶性蛋白質量分數采用考馬斯亮藍法測定,束縛水與自由水含量采用阿貝折光儀法測定。

1.4 數據處理和分析

試驗數據利用Microsolft Excel 2007進行處理，利用SPSS 20.0進行相關性分析(雙變量)和差異顯著性分析(單因素ANOVA)。參照唐士勇[14]的方法計算低溫半致死溫度(LT50)，將處理溫度(x)和相對電導率(y)間的關系用Logistic方程進行擬合，擬合曲線方程為y=K/(1+ae-bx)，其中K為相對電導率的飽和值，a、b為方程參數，求該方程的二階導數并令其等于0，可獲得方程曲線的拐點x=—ln(1/a)/b，x即為半致死溫度。運用隸屬函數法計算各抗寒指標隸屬度[15]，如果指標與抗寒性呈正相關，指標隸屬度計算公式為：

Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(1)

如果指標與抗寒性呈負相關，指標隸屬度計算公式為：

Uij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(2)

式中：Uij表示i品種j指標的抗寒隸屬函數值；Xij表示i品種j指標的測定值；Xjmin表示j指標的最小值；Xjmax表示j指標的最大值。

2 結果與分析

2.1 不同低溫處理對桃枝條相對電導率的影響

不同低溫處理對桃枝條相對電導率的影響見圖1。隨著溫度的降低，各品種枝條相對電導率均呈逐漸上升的趨勢，整體變化呈“S”形曲線，但上升的速率存在差異。說明不同桃品種對低溫脅迫響應一致，枝條相對電導率變化趨勢出現(xiàn)明顯拐點時所處的溫度各不相同。

圖1 不同低溫處理下桃枝條相對電導率的變化Fig.1 Changes of relative elective conductivities of peach branches under different low-temperature treatment

利用Logistic方程結合相對電導率計算不同桃品種的LT50，可以直接反映枝條對低溫的敏感和耐受程度，LT50越低，抗寒性越強[12]。由表1可見，各品種Logistic方程擬合的相關系數為0.767～0.865，均大于臨界相關系數(r=0.707，α=0.05)，擬合度較好，各品種LT50介于-24.30～-17.88 ℃。根據LT50得出12個桃品種抗寒性順序為‘秋戀’>‘晚蜜’>‘秋燕’>‘承德2號’>‘大久保’>‘03-49-079’>‘承德1號’>‘慶豐’>‘02-13-140’>‘03-22-034’>‘春雪’>‘金奧’。將各品種相對電導率與LT50進行相關性分析，結果表明溫度為-15、-25、-30和-40 ℃的處理，相對電導率與LT50極顯著正相關，相關系數分別為0.735、0.789、0.821和0.850。

表1 12個桃品種Logistic方程及半致死溫度Table 1 The Logistic equation and semilethal temperature (LT50)of 12 peach varieties

2.2 不同低溫處理對桃枝條發(fā)芽率的影響

不同低溫處理對桃枝條發(fā)芽率的影響見表2，各品種的發(fā)芽率隨溫度的降低呈下降趨勢。當溫度為-10 ℃時，‘春雪’‘金奧’‘03-22-034’‘03-49-079’‘02-13-140’發(fā)芽率首先出現(xiàn)下降；當溫度降低到-20 ℃時，各品種的發(fā)芽率急劇下降，其中‘秋戀’‘春雪’‘金奧’與其他品種相比，枝條發(fā)芽率差異顯著；當溫度低于-30 ℃，各品種發(fā)芽率均為0。-20 ℃時各桃品種的發(fā)芽率大小順序為‘秋戀’>‘晚蜜’>‘秋燕’>‘大久保’>‘03-49-079’>‘承德2號’>‘承德1號’>‘慶豐’>‘02-13-140’>‘03-22-034’>‘春雪’>‘金奧’，與根據LT50所得的抗寒性排序基本一致。將各品種發(fā)芽率與LT50進行相關性分析，結果表明溫度為-10、-15和-20 ℃的處理，發(fā)芽率與LT50呈極顯著負相關，相關系數分別為-0.811、-0.908和-0.944。

2.3 不同低溫處理對桃枝條束縛水/自由水比值的影響

不同低溫處理對桃枝條束縛水/自由水比值的影響見圖2。隨著處理溫度的降低，各品種枝條束縛水/自由水比值均呈“先升高后降低”的變化趨勢，但各品種束縛水/自由水比值達到峰值所對應的溫度不同。‘金奧’‘春雪’‘03-22-034’‘03-49-079’‘慶豐’束縛水/自由水比值達到峰值時的溫度為-15 ℃，‘承德2號’‘晚蜜’‘秋戀’‘秋燕’束縛水/自由水比值達到峰值時的溫度為-30 ℃，其他品種束縛水/自由水比值在-20 ℃達到峰值。在整個降溫過程中，‘秋戀’‘承德2號’束縛水/自由水比值增加較多，分別較對照增加了130.18%和123.70%，‘金奧’‘大久?！`水/自由水比值增加較少，分別較對照增加了63.20%和66.92%。將各品種束縛水/自由水比值與LT50進行相關性分析，結果表明溫度為-30 ℃的處理，束縛水/自由水比值與LT50呈極顯著負相關，相關系數為-0.875。

圖2 不同低溫處理下桃枝條束縛水與自由水比值的變化Fig.2 Changes of ratios to bound and free water of peach branches under different low-temperature treatment

2.4 不同低溫處理對桃枝條丙二醛質量摩爾濃度的影響

不同低溫處理對桃枝條丙二醛質量摩爾濃度的影響見圖3。隨著處理溫度的降低，各品種枝條丙二醛質量摩爾濃度均呈“先升高后降低”的變化趨勢，但各品種的丙二醛質量摩爾濃度達到峰值所對應的溫度不同?！貉饖W’和‘03-22-034’的丙二醛質量摩爾濃度達到峰值時的溫度為-20 ℃，‘晚蜜’的丙二醛質量摩爾濃度達到峰值時的溫度為-35 ℃，其他品種的丙二醛質量摩爾濃度分別在-25 ℃和-30 ℃達到峰值。在整個降溫過程中，‘金奧’‘春雪’‘03-22-034’的丙二醛質量摩爾濃度較高，‘晚蜜’‘秋戀’‘秋燕’的丙二醛質量摩爾濃度較低；‘秋戀’‘晚蜜’‘秋燕’的丙二醛質量摩爾濃度增加較少，分別較對照增加了33.39%、45.27%和48.12%，‘承德1號’‘承德2號’‘慶豐’‘02-13-140’的丙二醛質量摩爾濃度增加較多，均較對照增加了80.00%以上。將各品種丙二醛質量摩爾濃度與LT50進行相關性分析，結果表明：0、-10、-15、-20、-25、-30、-35 和-40 ℃的溫度處理，丙二醛質量摩爾濃度均與LT50呈極顯著正相關，相關系數分別為0.722、0.833、0.888、0.888、0.887、0.926、0.790和0.746。

圖3 不同低溫處理下桃枝條丙二醛質量摩爾濃度的變化Fig.3 Changes of MDA molalities of peach branches under different low-temperature treatment

2.5 不同低溫處理對桃枝條可溶性糖質量分數的影響

不同低溫處理對桃枝條可溶性糖質量分數的影響見圖4。隨處理溫度的降低，各品種枝條可溶性糖質量分數呈“升-降-升-降”的變化趨勢。分別在-15 ℃和-30 ℃達到質量分數高峰，且第2個峰值大于第1個峰值。在整個降溫過程中，‘秋戀’‘晚蜜’可溶性糖質量分數增加較多，分別較對照增加了310.94%和228.90%，‘春雪’增加較少，較對照增加了64.80%。將各品種可溶性糖質量分數與LT50進行相關性分析，結果表明溫度為-15、-25和-30 ℃的處理，可溶性糖質量分數與LT50呈極顯著負相關，相關系數分別為-0.744、-0.797和-0.824。

圖4 不同低溫處理下桃枝條可溶性糖質量分數的變化Fig.4 Changes of soluble sugar mass fractions of peach branches under different low-temperature treatment

2.6 不同低溫處理對桃枝條可溶性蛋白質量分數的影響

不同低溫處理對桃枝條可溶性蛋白質量分數的影響見圖5。隨處理溫度的降低，除‘02-13-140’‘03-49-079’外，各品種枝條可溶性蛋白質量分數均呈“先升高后降低”的變化趨勢，但各品種達到峰值所對應的溫度不同。在-25 ℃時，‘承德2號’‘03-22-034’‘02-13-140’‘金奧’‘春雪’‘大久?！扇苄缘鞍踪|量分數達到峰值，其余品種可溶性蛋白質量分數在-30 ℃達到峰值。在整個降溫過程中，‘晚蜜’‘秋燕’‘秋戀’可溶性蛋白質量分數增加較多，分別較對照增加了73.48%、79.27%和85.91%，‘03-22-034’‘金奧’可溶性蛋白質量分數增加較少，分別較對照增加了41.52%和 43.08%。將各品種可溶性蛋白質量分數與LT50進行相關性分析，結果表明溫度為-30 ℃的處理，可溶性蛋白質量分數與LT50呈極顯著負相關，相關系數為-0.794。

圖5 不同低溫處理下桃枝條可溶性蛋白質量分數的變化Fig.5 Changes of soluble protein mass fractions of peach branches under different low-temperature treatment

2.7 不同低溫處理對桃枝條脯氨酸質量分數的影響

不同低溫處理對桃枝條脯氨酸質量分數的影響見圖6。隨處理溫度的降低，各品種枝條脯氨酸質量分數總體呈“升-降-升-降”的變化趨勢。在-15 ℃時，‘承德1號’‘03-22-034’‘秋燕’‘晚蜜’‘慶豐’‘春雪’‘大久?！彼豳|量分數達到第1個峰值，而其他品種脯氨酸質量分數在-20 ℃時達到第1個峰值，之后各品種脯氨酸質量分數出現(xiàn)小幅度的下降，在-30 ℃時，除‘03-22-034’外，各品種脯氨酸質量分數均達到第2 個峰值，且第2個峰值高于第1個峰值。在整個降溫過程中，‘金奧’‘春雪’脯氨酸質量分數較低，增加較少，分別較對照增加了67.82%和41.25%，‘秋戀’‘晚蜜’脯氨酸質量分數較高，增加較多，分別較對照增加了101.69%和108.82%。將各品種脯氨酸質量分數與LT50進行相關性分析，結果表明溫度為0、-10、-15、-25、-30和-40 ℃的處理，脯氨酸質量分數與LT50呈極顯著負相關。相關系數分別為-0.757、-0.723、-0.793、-0.774、-0.896和-0.795。

圖6 不同低溫處理下桃枝條脯氨酸質量分數的變化Fig.6 Changes of proline mass fractions of peach branches under different low-temperature treatment

2.8 桃各抗寒指標的相關性分析

通過以上分析可以看出，各品種-30 ℃時的6個生理指標和-20 ℃的枝條萌芽率均與LT50極顯著相關，并且品種間差異顯著。因此，選取枝條發(fā)芽率(-20 ℃)和6個生理指標值(-30 ℃)進行相關性分析，結果見表3。從表中可以看出，相對電導率與丙二醛質量摩爾濃度之間呈顯著正相關，與可溶性蛋白質量分數之間無相關性，其他各指標之間均存在極顯著相關關系。由此可見，各抗寒指標間均存在一定的聯(lián)系，它們提供的信息會有一定的重疊和疏漏，因此在桃抗寒性鑒定中，不能依賴單個或少數幾個指標進行評價，應用多個抗寒指標進行綜合評價。

表3 桃枝條各抗寒指標間相關系數Table 3 Correlation coefficient of cold resistance indexes of peach branches

2.9 不同桃品種抗寒性綜合評價

為了全面、客觀地反映不同桃品種的抗寒能力，運用隸屬函數法，以7個抗寒指標隸屬度的平均值對12個桃品種枝條抗寒性進行綜合評價，平均隸屬度越大，抗寒性越強，反之抗寒性越弱。結果如表4所示，12個桃品種的平均隸屬度為0.11～0.98，‘金奧’的平均隸屬度最小，‘秋戀’的平均隸屬度最大，根據平均隸屬度的大小可得12個桃品種枝條抗寒性強弱順序為：‘秋戀’>‘晚蜜’>‘秋燕’>‘03-49-079’>‘承德2號’>‘承德1號’>‘大久?！?‘慶豐’>‘02-13-140’>‘03-22-034’>‘春雪’>‘金奧’。此排序結果與LT50的排序結果基本一致。

表4 不同桃枝條抗寒性指標隸屬函數值Table 4 Subordinate function value of cold resistance indexes of different peach branches

3 討論與結論

基于電解質外滲量測定開發(fā)的電導法是植物上應用比較廣泛的抗寒性鑒定方法[16-17]，電導率結合Logistic方程，可對LT50進行預測，預測結果與物種的田間表現(xiàn)基本一致[18-19]。本研究中，12個桃品種枝條的相對電導率，隨處理溫度下降呈“S”形曲線增加，并且在不同的處理溫度下，抗寒性強的品種相對電導率較低，抗寒性弱的品種相對電導率較高，這與趙國棟等[12]和李桂榮等[20]的研究結果一致。‘承德1號’‘承德2號’為承德平泉地區(qū)的野生桃品種，平泉地區(qū)1月份平均最低氣溫-17 ℃，歷史最低氣溫達到-26 ℃以下，在平泉地區(qū)這2個品種均沒發(fā)生明顯凍害，而在實驗室條件下，‘承德1號’‘承德2號’的LT50分別為-21.56、-22.35 ℃，抗寒表現(xiàn)顯著低于平泉田間?？赡芘c試驗低溫持續(xù)時間長、溫度變化的速率較快有關，說明應用電導法可以快捷的判定桃品種間的抗寒性強弱，但半致死溫度受試驗取材和試驗控制條件等方面制約，與品種實際可忍受的低溫極限值存在一定的差異，馬小河等[21]和李遠發(fā)等[22]在釀酒葡萄和麻風樹上的研究也有類似情況。本研究結果中‘晚蜜’‘大久?！畱c豐’‘春雪’‘金奧’的LT50與之前的研究結果有一定差異[23]，但抗寒性的強弱順序基本一致，可能與取材時間或試驗條件不同有關，還有待于進一步驗證。

恢復生長法是評價植物抗寒性的最直觀和可靠的方法，由于桃枝條難以生根、形成愈傷組織，枝條遭受低溫傷害的程度，主要通過芽對低溫的敏感性反映出來，通過統(tǒng)計枝條的發(fā)芽率，可以直接確定枝條抗寒性強弱，所得結果與LT50所得抗寒性排序基本一致。

丙二醛是膜脂過氧化分解的最終產物，其質量摩爾濃度可以反映植物遭受凍害的程度[24]。葡萄上的研究表明[25-26]，枝條中丙二醛質量摩爾濃度隨著溫度的降低呈逐漸增加的趨勢。而本研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，丙二醛質量摩爾濃度先升高后降低，不同品種達到峰值所對應的溫度不同，這與藕丹等[27]在毛白楊上的研究結果一致，可能與樹種有關。抗寒性強的桃品種丙二醛質量摩爾濃度低，變化幅度小，達到峰值對應的溫度低，說明丙二醛質量摩爾濃度、變化幅度和達到峰值時的溫度可以作為桃抗寒性的鑒定指標。

在低溫條件下，植物體通過提高可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調節(jié)物質質量分數，降低細胞液滲透勢，從而提高機體的抗寒性[28]?？购詮姷奶移贩N滲透調節(jié)物質質量分數較高，增加的幅度大。這與李斌等[29]和李萍萍[30]在海棠和扁桃上的研究結果一致。本研究中，當溫度下降到-25 ℃時，各品種可溶性蛋白質量分數呈上升趨勢，在此期間，枝條內部可能產生了其他種類的可溶性蛋白，如抗凍蛋白(AFPs)、離子通道蛋白或酶類等功能性蛋白質[31]，這些功能性蛋白質可能影響了脯氨酸和可溶性糖的合成，導致在-25 ℃和-20 ℃時，脯氨酸和可溶性糖質量分數出現(xiàn)小幅降低，當溫度進一步降低，這些功能性蛋白質活性鈍化，脯氨酸和可溶性糖質量分數又呈增加趨勢，當溫度低于-30 ℃時 枝條組織結構被破壞，細胞嚴重受損，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸在植物體內正常合成受到抑制，質量分數降低。

植物的抗寒能力與機體內的水分變化息息相關。束縛水冰點為-25～-20 ℃，不易結冰；自由水可自由移動，0 ℃以下就會結冰[32]。低溫條件下，桃枝條通過自身生理調節(jié)，增加束縛水含量，提高束縛水與自由水比值，減緩自由水結冰對細胞膜系統(tǒng)的破壞，抗寒性強的桃品種比值達最大時對應的溫度較低，并且增加的幅度大，這與陳佰鴻等[32]和劉鈺璽等[33]在葡萄上的研究結果一致。因此，束縛水/自由水比值的變化可以作為鑒定桃枝條抗寒性強弱的指標之一。

植物抗寒性是受多種因素影響的復雜的生理過程，用任何單一的生理指標難以全面客觀地反映植物抗寒性的強弱。本研究利用隸屬函數法對12個桃品種的7個生理指標進行綜合分析，得出其抗寒性強弱順序與單獨運用LT50或恢復生長法所得抗寒性結果基本一致，表明該方法適用于桃抗寒性評價。本研究認為各桃品種抗寒性強弱依次為：‘秋戀’>‘晚蜜’>‘秋燕’>‘03-49-079’>‘承德2號’>‘承德1號’>‘大久保’>‘慶豐’>‘02-13-140’>‘03-22-034’>‘春雪’>‘金奧’。目前，這12個桃品種，部分為我國不同桃產區(qū)的優(yōu)良品種，某一桃產區(qū)進行引種栽培時，應以產區(qū)內已有的本研究中涉及的品種為參考，對擬引入品種的抗寒性進行科學預判，避免抗寒性不適宜帶來的生產損失。