糯玉米耐貯藏相關性狀的主效QTL定位

蔣 鋒 劉偉杰 陳青春 張姿麗 孫 偉 劉鵬飛*

(1.仲愷農業工程學院 農業與生物學院，廣州 510225;2.廣州市花都區獅嶺鎮農業農村辦公室，廣州 510326)

種子是農業生產中最基本的生產資料，也是植物生命周期的基本組成部分，儲存著下一代所需的全部遺傳信息[1]。種子質量的高低直接影響著良種特性的發揮，關系到農業生產的豐歉[2]。種子貯藏就是使用一定的貯藏設備和貯藏技術，有效地保持種子質量，從而保證種子的種用價值。提升種子的耐貯藏性對保持種子質量、保存和利用種質資源、延長種子的使用周期具有重要意義[3]。

種子耐貯藏性除受貯藏環境條件的制約外，同時還受其生理指標和遺傳特性的影響[4-6]。調節種子貯藏環境如低溫貯藏、超低溫貯藏、超干貯藏、真空貯藏，可有效地延長種子壽命，延緩種子老化進程，增強種子耐貯藏性[3]。生理指標研究表明，種子內脂肪氧化酶活性、抗氧化酶活性和非酶類抗氧化物質含量等與種子耐貯藏性顯著相關[7-15]。脂肪氧化酶可以與磷脂中的不飽和脂肪酸反應，降低細胞膜的流動性、完整性和透性，導致細胞液滲漏，最終引起種子活力逐步喪失[7-10]。已有研究表明過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GSHPX)等抗氧化酶可以清除種子在貯藏過程中產生的活性氧和自由基，增強種子的耐貯藏性[11-13]。此外，維生素C和E等非酶類抗氧化物質可防止脂質過氧化、清除活性氧，從而增強種子的耐貯藏性[14-15]。從遺傳特性方面說，種子耐貯藏性是一個受多種因素影響的綜合性的數量性狀，對其進行遺傳分析比較困難。然而，隨著基因組作圖技術的迅速發展，數量性狀基因座(QTL)分析技術為研究種子耐貯藏性遺傳提供了有力的工具[16]。已有研究通過自然老化和人工老化試驗，對水稻[17]、小麥[18]、玉米[1,19-20]、大麥[21]、油菜[22]、擬南芥[23]和大豆[24]種子耐貯藏相關性狀進行了QTL定位分析。

人工老化是采用高溫、高濕處理種子，加速種子活力的喪失；自然老化是指種子在自然儲藏的環境條件下逐漸喪失活力。人工老化可縮短老化時間，克服了自然老化所需時間較長的限制；自然老化試驗周期長，但因符合種子貯藏的自然特性，更能反映種子貯藏實際[2]。人工老化和自然老化屬于不同的基因調控系統[16]。因此,只有通過自然老化的方法,分析與挖掘耐儲藏相關基因,才能更準確地了解其遺傳機制，最終實現科研成果的實際應用。現有對玉米耐貯藏性QTL定位的研究多基于人工老化試驗[1,19-20]。通過自然老化試驗對玉米耐貯藏相關基因挖掘定位的研究尚未見報道。因此，本研究擬以2個耐貯藏性差異顯著的糯玉米自交系N7和N32為研究對象，應用BSA群體分離分析法(Bulked segregant analysis)，以雜交組合N7×N32的216個F2單株為作圖群體，構建遺傳連鎖圖譜，并以各單株果穗種子儲藏2年后的單位質量電導率和發芽率作為耐儲藏性狀指標數據，用復合區間作圖法檢測耐貯藏相關QTL，以期為耐貯藏相關QTL精細定位、圖位克隆和標記輔助選擇耐貯藏新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 親本材料

試驗親本材料N7(母本)和N32(父本)是廣東省鮮食玉米遺傳育種工程技術研究中心選育而成的鮮食型糯玉米自交系。經多年試驗鑒定，兩親本自交授粉后45 d收獲的種子活力和發芽率均無顯著差異，室溫儲藏1年以上，N32的種子活力與發芽率均顯著高于N7。

1.2 田間試驗設計

2016年春季，種植親本自交系N7(不耐儲藏)和N32(耐儲藏)。配制雜交組合N7×N32，同時兩親本自交，收獲兩親本及F1種子。

2016年12月底，在海南九所新村種植雜交組合N7×N32 的F1，自交獲得F2種子。

2017年春季，同時種植兩親本、F1和F2。提取兩親本、F1和F2各單株葉片基因組DNA；各世代單株套袋自交授粉，于授粉后45 d收獲果穗，風干脫粒，每單株果穗種子隨機數取100粒裝袋封口儲藏，記錄種子袋編號。

2017年8月—2019年8月，216個F2單株果穗種子室溫儲藏2年。

1.3 耐貯藏相關性狀的數據獲取

2019年8月，從封口袋中取出種子，將F2每一果穗上的100粒種子用去離子水清洗后分成2份，每份50粒分別稱重，分別放入裝有250 mL去離子水的杯子中，蓋上杯蓋浸泡24小時后，用電導率儀測得電導率，得出2個重復的電導率均值。

由于電導率與種子活力成負相關，將216個F2電導率數據進行線性轉化。轉化方法是：用216個電導率的最大值減去各F2單株的電導率，然后再歸一化到0～100。經轉化后的數值作為第一個耐貯藏性狀值。

測得種子電導率后將同一果穗上的100粒種子，置于發芽盒，沙床28 ℃發芽，7 d后數出正常幼苗數，算出發芽率作為第二個耐貯藏性狀值。

1.4 極端DNA池的組成

從216個F2果穗種子中挑選出單位質量電導率最小的20個，記錄編號；同時挑出發芽率最高的20個，記錄編號；將編號相同的種子對應的16個DNA混合組成極端耐儲藏DNA池。挑出單位種子質量電導率最大的20個，同時挑出發芽率最低的20個，混合編號相同的種子對應的16個DNA組成極端不耐儲藏DNA池。

1.5 DNA分子標記分析

采用CTAB法[25]提取DNA。據趙茂俊等[26]、Wang等[27]、于永濤等[28]、劉宗華等[29]和李永祥等[30]已發表過的玉米連鎖遺傳圖譜合成引物，結合玉米遺傳和基因組數據庫(www.maizegdb.org)，選擇分布于玉米10 對染色體上的 600 對 SSR引物對2個極端DNA池進行多態性標記篩選。針對多態性引物所在的染色體，增加引物，以F2為作圖群體構建分子標記連鎖圖譜，結合F2果穗種子的2個貯藏性狀值掃描耐貯藏相關QTL。

SSR 引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。參照張軍等[31]的PCR 反應體系、聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色方法進行。

1.6 連鎖群構建及QTL定位

采用JoinMap 3.0軟件對216個F2單株的多態標記基因型進行連鎖關系分析，構建分子標記連鎖圖譜[32]。采用WinQTLCart2.5軟件，復合區間作圖法掃描耐貯藏相關QTL。LOD(Likelihood of Odd)閾值為3.0。

按照“q+性狀+染色體號+數字”命名QTL。性狀以英文縮寫表示，如電導率QTL以CE(Converted electroconductibility)表示，發芽率QTL以GP(Germination percentage)表示。同一條染色體上的各QTL以數字表示。

2 結果與分析

2.1 親本及F2耐貯藏相關性狀的參數統計

貯藏2年后，N7和N32果穗種子的單位質量電導率(CE)分別為(7.64±4.1)μS/(cm·g)和(93.4±3.3)μS/(cm·g)，兩親本差異極顯著；N7的發芽率(GP)平均值為(70.0±0.8)%，N32的發芽率平均值為(86.9±1.0)%，兩親本差異極顯著。

216個F2果穗種子的CE(圖1(a))和GP(圖1(b))分布見圖1。由兩親本和F2的CE和GP值算得CE的遺傳方差為538.9 (μS/(cm·g))2，環境方差為13.9 (μS/(cm·g))2；GP的遺傳方差為23.1(%)2，環境方差為0.8(%)2，2個耐貯藏指標的遺傳方差均>環境方差，適合作QTL定位分析。

圖1 216個F2單株種子貯藏2年后單位質量電導率及發芽率分布Fig.1 Distribution of converted electroconductibility (a)and germination percentage (b)after 2 years storage in 216 F2 individuals

2.2 DNA混池間多態性標記篩選

用600對玉米SSR引物在耐儲藏DNA池和不耐貯藏DNA池之間進行多態性引物篩選，發現位于第4號染色體上的引物umc1284和位于第6號染色體上的bnlg2097在混合DNA池間存在差異。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構建

在第4和6染色體上分別設計100對SSR引物，并在親本間篩選其中的多態性標記。以雜交組合N7×N32的F2為作圖群體，利用Joinmap3.0軟件構建玉米第4和第6染色體的分子標記連鎖圖，結果見圖2。可知：在第4染色體的連鎖圖的長度為113.68 cM，含有18個SSR分子標記；在第6染色體的連鎖圖的長度為121.24 cM，包含21個SSR分子標記。

黑色矩形區域和須狀線區域分別代表1-LOD置信區間和2-LOD置信區間。Bars and whiskers indicate 1-LOD and 2-LOD QTL likelihood intervals,respectively.圖2 遺傳連鎖圖譜及耐貯藏相關QTL分布Fig.2 Genetic linkage map and storability related QTL distribution

2.4 耐貯藏相關QTL定位分析

2.4.1電導率的QTL定位

結合216 個F2果穗種子的CE和分子標記數據，用WinQTLCart 2.5軟件，采用復合區間作圖法在第4和6染色體上掃描QTL，結果見圖2。在第4染色體上定位到1個QTL(qCE-4-1)，位于分子標記bnlg1265～bnlg1755，加性效應為-18.96，顯性效應為3.58，貢獻率是30.5%(表1)，LOD值為19.3(圖3)；第6染色體上定位到2個電導率QTL(qCE-6-1、qCE-6-2)，分別位于umc1014～bnlg1154和phi077～bnlg2097，加性效應分別為-10.41和12.10，顯性效應分別為11.35和20.85，可分別解釋15.0%和5.4%的表型變異(表1)，LOD值分別為11.2和4.7(圖3)。

2.4.2發芽率的QTL定位

分子標記數據結合F2果穗種子的發芽率，采用復合區間作圖法在第4和6染色體上檢索QTL。結果顯示，在第4染色體上定位到1個QTL(qGP-4-1)，位于標記區間bnlg1265～bnlg1755上，加性效應為-3.63，顯性效應為0.73，貢獻率是25.9%(表1)，LOD值為18.1(圖3)。第6染色體上定位到3個QTL(qGP-6-1、qGP-6-2、qGP-6-3)分別定位于umc1014～bnlg1154、bnlg1154～umc1614和umc1127～umc1248上，加性效應分別為-2.41、-2.73和-1.31，顯性效應分別為0.40、1.91和1.46，可分別解釋10.3%、8.2%和4.6%的表型變異(表1)，LOD值分別為8.2、5.6和3.4(圖3)。

圖3 耐貯藏相關性狀LOD值在連鎖群上的分布Fig.3 LOD distribution of storability related traits in linkage

表1 復合區間作圖檢測到的耐貯藏相關QTLTable 1 Storability related QTL with the method of CIM

3 討 論

作物種子耐貯藏相關QTL定位研究主要集中在水稻、小麥、擬南芥上，對玉米種子的耐貯藏性相關QTL的研究報道不多。Wu等[19]對148個甜玉米BC4F3單株進行簡化基因組測序，結合人工老化后測得的4個發芽性狀指標，定位到18個耐貯藏相關QTL。其中qGR10在第10染色體上，在2季實驗中均被檢測到。Han等[20]用8個人工老化處理，在2個有共同父本的重組自交系群體里檢測到4個穩定的主效耐貯藏QTL，分別位于第2、3和5染色體上。Wang等[1]用多種人工老化處理，在重組自交系群體和永久F2群體中同時定位到一個穩定的主效耐貯藏QTL(qGP5)，位于第5染色體bin5.01上。本研究，通過測定自然老化的糯玉米種子的2個耐貯藏指標，應用連鎖分析的方法在F2群體中檢索到7個耐貯藏相關QTL，分別位于第4和6染色體上。

Tanksley[33]指出，貢獻率>10%的QTL可視為主效QTL。本研究在第4染色體標記區間bnlg1265～bnlg1755內同時定位到電導率和發芽率2個指標的QTL(qCE-4-1和qGP-4-1)，LOD值分別為19.3和18.1，貢獻率分別為30.5%和25.9%，表明在bnlg1265～bnlg1755標記區間內可能存在1個穩定的主效耐貯藏QTL。同時，在第6染色體umc1014～bnlg1154內同時定位到電導率和發芽率2個指標的QTL(qCE-6-1和qGP-6-1)，LOD值分別為11.2和8.2，貢獻率分別為15.0%和10.3%，表明在第6染色體umc1014～bnlg1154區間內可能也存在1個穩定的主效耐貯藏QTL。后期將通過擴大群體、加大標記密度對主效耐貯藏QTL進行精細定位，找到可用于輔助選擇的分子標記，以期應用于育種實踐。

4 結 論

本研究以糯玉米組合N7×N32的F2為作圖群體，應用BSA方法，以自然老化后種子電導率和發芽率為耐貯藏指標，在第4和6染色體上定位到7個耐貯藏相關QTL。其中，在第4染色體bnlg1265～bnlg1755和第6染色體umc1014～bnlg1154內分別定位到2個穩定的耐貯藏指標主效QTL。