禽腺病毒血清4型Fiber-2蛋白在畢赤酵母中的優化表達及其免疫原性分析

袁 楓 宋慧琦 侯 磊 韋 莉 朱珊珊 全 榮 王 菁 王 丹 姜海軍 劉 浩 劉 爵*

(1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300222；2.北京市農林科學院 畜牧獸醫研究所，北京 100097；3.揚州大學 獸醫學院，江蘇 揚州 225009；4.揚州大學 江蘇省重大動物傳染病與人畜共患病防控合作創新中心，江蘇 揚州 225009)

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的主要感染對象為3～5周齡的雛雞，感染后在一周內會發病死亡。病死雞剖檢表現出心包積液-肝炎綜合征(Hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS)的典型癥狀，心包內積聚大量的液體，肝臟出現明顯的病毒包涵體，死亡率達到30%～80%[1-2]。2013 HHS傳入我國后只見散發性流行[3-4]，直到2015后，超強毒力的禽腺病毒血清4型(hvFAdV-4)已成為國內HHS的主要的病原體，導致雞群的死亡率節節攀升，給國內外的養禽業帶來極大威脅[5]。

自2010年以來，研究者們采用細胞培養系統相繼地研發出禽腺病毒血清4型的滅活疫苗和弱毒疫苗[6-10]，其中部分疫苗保護率可高達100%[8]。但是這類疫苗產量有限、成本較高，而且容易出現病毒滅活不完全或毒力返強的現象，存在著很大的生物安全隱患。近年來，隨著生物技術的不斷發展，亞單位疫苗作為新一代疫苗憑借著成本低、產量高、安全可靠和保護效果好等優點，在傳染性疾病預防方面已廣泛應用。

在FAdV-4的亞單位疫苗研究中，主要應用的表達系統有大腸桿菌[11-13]、昆蟲細胞[14-15]和哺乳動物細胞[16]等。研究人員利用不同的表達系統進行了病毒結構蛋白(Fiber-1、Fiber-2[17]、Hexon和Penton)和非結構蛋白(100 K)的外源表達。結果發現不同的蛋白保護效率差異性較大，這些系統表達的結構蛋白Fiber-1、Penton和Hexon雖然都能提供一定程度的保護，但是無法完全抵御FAdV-4的感染，而非結構蛋白(100 K)幾乎不能刺激機體產生有效的免疫反應[18]。Fiber-2是FAdV-4特有的結構蛋白，在病毒感染過程中的吸附和進入中發揮重要作用[19]。研究表明，不同系統表達的Fiber-2蛋白均可激發機體產生高效的免疫保護力[20-21]。

目前，為制備FAdV-4 Fiber-2蛋白的亞單位疫苗，很多研究采用了原核表達系統(大腸桿菌)和真核表達系統(昆蟲細胞和畢赤酵母)對Fiber-2蛋白進行了表達[11-13,15,22]。雖然，大腸桿菌生長繁殖快、培養簡單，但是表達的蛋白無法進行有效折疊和修飾，導致不能激發機體產生高效免疫應答。真核表達系統表達的病毒蛋白與活病毒更為接近，更有利于刺激機體產生高效的免疫應答。在所有的真核表達系統中，畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統由于其具有菌體繁殖快、培養基廉價，而且還能對目的蛋白進行折疊和修飾并以外分泌的形式表達的優勢。同時，經過優化后的畢赤酵母表達系統有著很高的產量，外分泌的目的蛋白可以達到g/L。如此高的產量是其他原核和真核表達系統都無法做到的，因此，近年來畢赤酵母表達系統被研究者廣泛用于亞單位疫苗的制備。

雖然先前有關研究已經發現FAdV-4 Fiber-2蛋白可在畢赤酵母表達系統進行表達[22]，然而其表達量及蛋白純度較低，無法滿足批量化生產的需求。在實際生產實踐中，通常未經優化的畢赤酵母表達系統表達的蛋白量較低，并達不到應用于工業化發酵生產的需求。因此，通過酵母發酵工藝的優化來提高外源蛋白的表達，對亞單位疫苗的制備至關重要[23-25]。本研究旨為提高Fiber-2蛋白在畢赤酵母(P.pastoris)表達系統中的外分泌表達，將病毒的Fiber-2基因按照酵母密碼子偏好進行了優化，然后通過不同濃度的G418選取高拷貝的重組菌株后，采用搖瓶優化誘導溫度、時間和甲醇濃度。并采用動物試驗評估了優化后的畢赤酵母表達Fiber-2蛋白制備的亞單位疫苗對高致病性FAdV-4毒株(GD616)的免疫保護作用。該研究成果為FAdV-4亞單位疫苗進行大規模發酵生產提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)GD616毒株和Fiber-2豚鼠多克隆抗體由研究室保存；酵母真核載體pPIC9K和畢赤酵母菌(P.pastoris)GS115株由蘇州泓迅生物公司提供；限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ購自NEB公司；HRP標記的羊抗豚鼠IgG和羊抗雞IgG購自Sigma公司；氨芐霉素(Amp+)購自Invitrogen公司；增強型HRP底物顯色試劑盒購自Thermo公司；ISA-201-VG免疫油佐劑購自SEPPIC公司;純化所用的鎳柱(HisTrapTM FF，5 mL)購買于GE公司；PierceTMBCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific；SPF雞購自購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。BMGY培養基和BMMY培養基自配。

1.2 Fiber-2基因序列的密碼子優化和pPIC9K-Fiber-2載體構建

根據研究室測得FAdV-4-GD616毒株的Fiber-2基因序列，對該基因序列進行酵母密碼子偏好性優化，全序列由蘇州泓迅生物合成。優化后序列連接至酵母真核載體pPIC9K載體上，命名為pPIC9K-Fiber-2。優化過的全序列編碼485個氨基酸，包括Fiber-2蛋白以及His標簽(6-His)。

利用網絡公共平臺提供(http:∥www.cbs.dtu.dk/)的軟件TMHMM和SignalP 3.0 Server，預測Fiber-2蛋白質的信號肽和跨膜結構。

根據對優化后的Fiber-2基因全序列設計檢測引物，F1：5’-ATGTTGAGAGCCCCAAAGAGAAGAC-3’；R1：5’-GTGATGGTGGTGATGATGTGGAAC T-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 畢赤酵母的電轉化

將重組質粒pPIC9K-Fiber-2導入大腸埃希菌TOP10進行大量擴增后提取質粒。取部分質粒進行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切分析。隨后取5 μg重組質粒pPIC9K-Fiber-2用SacⅠ酶對其進行線性化單酶切，并用2倍體積無水乙醇沉淀回收，30 μL ddH2O溶解。取100 μL酵母感受態細胞加入30 μL 線性化的質粒，混合后轉入電轉杯(d=0.2 cm)中，冰上放置數分鐘后，放入電轉儀中電擊(電壓：1680 V，電擊時間：5 ms)，電擊后，立刻加入1 mL 1 mol/L的D-山梨醇，冰上放置數分鐘。隨后放置28 ℃培溫搖床內培養1 h。分別取pPIC9K-Fiber-2和pPIC9K(對照)轉化菌液100～200 μL涂布于MD平板。48 h后觀察平板菌落長勢。

1.4 高拷貝陽性轉化子的篩選及PCR鑒定

用無菌ddH2O將MD平板上的酵母菌落洗脫至無菌的離心管中，按每平皿1×105個細胞涂于含G418不同質量濃度的YPD平皿，其中G418質量濃度分別為1、3和5 mg/mL。經3～5 d培養后，G418抗性克隆長出。從3 mg/mL的YPD-G418平板上挑取8個單克隆至4 mL YPD液體培養基中28 ℃培養36 h。取500 μL菌液至1.5 mL EP管中，離心收集菌體，使用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母菌的基因組。用引物F1和R1進行PCR擴增驗證。

1.5 畢赤酵母誘導表達及其優化

1.5.1搖瓶接種菌的制備

取出-80 ℃保存的酵母菌種，接種2 mL發酵種于100 mL的BMGY培養基中，放置搖床并將參數設置為300 r/min和28 ℃進行培養，最終OD600至3～6(約16～24 h)。離心收集菌體。

1.5.2誘導溫度的優化

將準備好的重組菌放在BMMY培養基中分別以不同溫度(24、26、28和30 ℃)進行誘導表達，接下來每24 h向培養基中添加總體積的1.0%甲醇，在96 h后將菌液離心取上清放在-80 ℃ 保存。先用BCA檢測上清中蛋白含量，再將剩余的上清液進行三氯乙酸蛋白沉淀，采用SDS-PAGE和Western Blot檢測，以確定最適的誘導溫度。

1.5.3誘導時間的優化

將準備好的菌體用100 mL的BMMY培養基重懸。放在搖床上并將參數設置為30 ℃ 250 r/min繼續生長。每24 h加入培養液總體積1.0%的甲醇并培養120 h。開始誘導后每天將部分菌液離心取上清用BCA檢測上清中蛋白含量，并將上清濃縮后進行SDS-PAGE和Western Blot檢測，以確定最適的誘導時間。

1.5.4甲醇誘導濃度的優化

根據確定好的最佳誘導時間和溫度，每24 h添加的甲醇分別為(0.5%、1.0%、2.0%和3.0%)。在30 ℃誘導72 h后取上清檢測蛋白表達及含量，以確定最適的甲醇誘導濃度。

1.5.5發酵液蛋白濃縮及檢測

取出900 μL上清加入三氯乙酸置于冰上10 min。離心后棄上清液加入1 mL丙酮震蕩渦旋在-20 ℃冰柜中過夜進行沉淀。12 000 r/min離心10 min，收取沉淀并加入20 μL ddH2O和4 μL上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。

Western Blot檢測，在進行SDS-PAGE后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，5%脫脂奶封閉NC膜過夜。TBST洗膜1次，加Fiber-2蛋白豚鼠多克隆抗體孵育2 h；PBST洗膜4次(10 min/次)，加HRP標記的羊抗豚鼠IgG二抗孵育1 h。TBST洗膜3次(10 min/次)，加增強型HRP底物顯色液避光反應5 min后成像檢測。

1.6 Fiber-2重組蛋白的純化和檢測

在搖瓶中誘導表達72 h后，收取菌液12 000 rmp/min 離心10 min，收取發酵上清液用0.22 μm水系濾膜過濾，利用BCA試劑盒檢測上清液中的總蛋白含量。隨后將過濾后的上清液過鎳柱純化，按照HisTrapTMHP的使用說明書進行，最終用500 mmol/L濃度的咪唑洗脫緩沖液洗脫目標蛋白，并用透析進行脫鹽處理，再用BCA試劑盒檢測Fiber-2蛋白含量。

1.7 畢赤酵母表達的重組 Fiber-2蛋白的免疫保護效力評估

1.7.1動物試驗設計

先將純化后的Fiber-2蛋白分為0、20和 50 μg，然后與ISA-201-VG免疫油佐劑等體積混合(1∶1)。將35只21日齡SPF雞分成4組(PBS對照組、Fiber2-20 μg組和Fiber2-50 μg組(每組10只)，空白組(Sham)5只)，分別胸肌多點注射重組Fiber-2蛋白，對照組注射PBS，空白組不做處理。共免疫2次，免疫間隔時間為一周，二免后7天將FAdV-4-GD616病毒液稀釋至103.5TCID50/0.1 mL，肌肉接種感染3組雞(0 μg、20 μg和50 μg/只/組)，每只0.2 mL。

1.7.2免疫后的血清ELISA抗體檢測

分別于免疫后7 d和二免后7 d后翅靜脈采血，收集血清。用ELISA進行抗體檢測，采用濃度為5 μg/mL 的Fiber-2蛋白包被過夜，用 5%的脫脂奶粉在37 ℃封閉2 h，漂洗后將稀釋200倍后的血清加入，孵育2 h；漂洗后加入5 000倍稀釋的羊抗雞IgG-HRP酶標抗體，37 ℃反應50 min；漂洗后加TMB避光反應15 min，在終止后讀取OD450吸光度值。

1.7.3攻毒后雞群保護率

攻毒后每天觀察雞的健康狀況，記錄死亡和存活的數量，并進行保護率的計算。

1.7.4攻毒后雞群病理組織觀察

PBS組隨機選取病死雞進行剖檢并收集肝臟；空白組(Sham)和50 μg組在攻毒后第7天隨機選取雞進行剖檢并收集肝臟；將收集的肝臟用4%的多聚甲醛固定，在石蠟包埋后切片，并對切片進行HE和免疫組化染色(HIC)。HIC選取課題組制備的Fiber-2豚鼠多克隆抗體。

2 結果與分析

2.1 Fiber-2基因密碼子優化

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的Fiber-2基因長為1 440 bp，按照酵母密碼子的偏好，將Fiber-2基因序列按進行了優化(圖1)。優化的過程中選擇性避開EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ酶切序列的出現。將EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點在優化時加在CDS序列兩端，以便插入載體的多克隆位點。在Fiber-2蛋白的N端添加了6×His標簽和2個終止密碼子(TGA)，序列最終長度為1 475 bp。最后對Fiber-2氨基酸序列分析顯示蛋白不存在跨膜區和信號肽。

*為終止密碼子序列。* represent the termination codon sequence.圖1 根據酵母密碼子偏好優化后的Fiber-2基因和氨基酸序列Fig.1 Fiber-2 gene and amino acid sequence optimized according to yeast codon preference

2.2 高拷貝陽性轉化子篩選及PCR鑒定

高拷貝陽性轉化子篩選結果顯示，含有5 mg/mL G418的YPD平板上并未發現菌落生長，含3 mg/mL G418的YPD平板上有8個高拷貝陽性轉化子(圖2(a))。挑取上述陽性轉化子，用優化序列的Fiber-2引物F1和R1進行PCR擴增。結果顯示所有轉化子均出現了約為1 500 bp的目的條帶(圖2(b))。

(a)Ⅰ是G418濃度為1 mg/mL的MD培養基；Ⅱ是G418濃度為3 mg/mL的MD培養基；Ⅲ是G418濃度為3 mg/mL的MD培養基；(b)1～8為G418濃度為3 mg/mL的MD培養基中的8個高拷貝陽性轉化子。(a)Ⅰ indicates MD medium with 1 mg/mL of G418,Ⅱ indicates MD medium with 3 mg/mL of G418,and Ⅲ was MD medium with 3 mg/mL of G418.(b)1-8 indicate 8 high copy positive transformants in MD medium with 3 mg/mL of G418.圖2 高拷貝陽性轉化子的篩選(a)及PCR鑒定(b)Fig.2 Screening (a)and PCR identification (b)of high copy positive transformants

2.3 誘導溫度的優化

誘導溫度在28 ℃以上時重組蛋白表達顯著增加，在30 ℃時到達峰值。因此最佳溫度為30 ℃。根據圖3(a)和(b)結果顯示，培養液中的雜蛋白雖然會隨溫度增加而變多，但是并沒有影響Fiber-2蛋白的表達。

1～4：分別為誘導溫度為24、26、28和30 ℃時蛋白的濃縮液。M：蛋白分子量標準。1-4:the protein concentrate was induced at 24,26,28,and 30 ℃,respectively.M:Protein molecular weight standard.圖3 不同誘導溫度表達產物的SDS-PAGE (a)和Western blot (b)鑒定Fig.3 SDS-PAGE (a)and Western blot (b)identification of products expressed at different induction temperatures

2.4 誘導時間的優化

分別收取誘導后24、48、72、96和120 h的發酵上清液進行濃縮，檢測發現上清液中雜質蛋白會隨著誘導時間逐漸的增多(圖4(a))。根據Western結果顯示，這些增多的雜質蛋白并不是重組Fiber-2蛋白的片段(圖4(b))。上清液的總蛋白含量在72 h 達到表達峰值，此后的時間點沒顯著增加。PAGE和Western結果顯示誘導72 h的Fiber-2蛋白表達最高，即使延長發酵也無法提高表達量。綜上，在72 h停止發酵并回收目的蛋白最為適宜。

1～5：分別為誘導24、48、72、96和120 h培養基的蛋白濃縮液。6：空白酵母誘導96 h后培養基的蛋白濃縮液。M：蛋白分子量標準。1-5:the protein concentrate of induction medium for 24,48,72,96,and 120 h,respectively.6:the protein concentration of the culture medium was induced by blank yeast for 96 hours.M:Protein molecular weight standard.圖4 不同誘導時間表達產物的SDS-PAGE(a)和Western blot鑒定Fig.4 SDS-PAGE (a)and Western blot (b)identification of expression products with different induction time

1～4：甲醇誘導濃度分別為0.5%、1.0%、2.0% 和3%時的蛋白濃縮液。M：蛋白分子量標準。1-4:the protein concentrate was induced by methanol at concentrations of 0.5%,1.0%,2.0% and 3.0%,respectively.M:Protein molecular weight standard.圖5 不同甲醇誘導濃度表達產物的SDS-PAGE(a)和Western blot(b)鑒定Fig.5 SDS-PAGE (a)and Western blot (b)detection of expressed products at different methanol induced concentrations

2.5 甲醇誘導濃度的優化

誘導表達開始后，每隔24 h分別添加不同體積分數的甲醇，體積為發酵液總量的0.5%、1.0%、2.0%和3.0%，72 h后收取各組上清液進行檢測。結果顯示Fiber-2蛋白的表達量在甲醇濃度為1.0%時最高，添加量過大反而抑制了Fiber-2蛋白的表達。所以將最佳的甲醇誘導濃度確定為1.0%。

2.6 Fiber-2蛋白純化及檢測

優化后發酵上清中總蛋白含量達到約50 mg/L，同時重組蛋白Fiber-2的產量為8.7 mg/L。上清液經過鎳柱親和層析純化后的蛋白條帶單一，說明重組蛋白Fiber-2可以通過鎳柱親和層析的方法純化(圖6(a))。Western blot檢測結果顯示的蛋白在60 ku左右，與預期結果相符(圖6(b))。

純化后的Fiber-2蛋白進行PAGE (a)和Western (b)檢測。M：蛋白分子量標準；1：純化后的Fiber-2蛋白。The purified Fiber-2 protein was detected by PAGE (a)and Western blot (b)M:Protein molecular weight standard;1:Purified Fiber-2 protein.圖6 Fiber-2蛋白純化后的檢測Fig.6 Detection of purified Fiber-2 protein

2.7 免疫攻毒保護試驗

ELISA抗體檢測結果顯示，20和50 μg免疫組在首免后1周出現特異性抗體，之后抗體水平持續上升，二免疫后1周達到高峰期。同時發現疫苗免疫劑量越大，特異性抗體水平也越高，PBS對照組在動物試驗期間未產生Fiber-2的特異性抗體(圖7(a))。超強致病性FAdV-4毒株GD616感染后，PBS免疫組的死亡率為100%(10/10)，20 μg重組Fiber-2蛋白組為10%(1/10)，50 μg重組Fiber-2蛋白組并沒有雞出現死亡(圖7(b))。結果說明重組Fiber-2蛋白免疫組較PBS對照組有明顯的保護作用，并且50 μg的免疫對超強毒株的感染可起到100%的保護。

圖7 免疫后的抗體水平(a)和攻毒后的生存曲線(b)Fig.7 Antibody level (a)after immunization and survival curve (b)after challenge

2.8 動物試驗病理學分析

對空白組、PBS組和50 μg組中的雞進行剖檢，隨后取肝臟切片并進行HE和病毒Fiber-2蛋白的免疫組化檢測(圖8)。結果顯示，PBS免疫組在GD616后出現典型的HHS的病變，而50 μg免疫組中并沒發現病變。隨后切片的HE和免疫組化(HIC)染色結果顯示，PBS組的肝臟出現了典型的病毒包涵體，脂肪變性和炎性細胞沁潤的病理學變化。而在空白組和50 μg組中并沒有發現病理變化和病毒的Fiber-2蛋白陽性著色。表明50 μg重組蛋白免疫對肝臟有很好的免疫保護效果。

箭頭a：FAdV-4病毒包涵體；箭頭b：脂肪空泡；c：炎性細胞浸潤。Arrow a:FAdV-4 virus inclusion body;Arrow b:Fat vacuoles;c:Inflammatory cell infiltration.圖8 肝臟病理組織切片觀察(HE和HIC(Fiber-2)，20×)Fig.8 Observation of pathological sections of liver (HE and HIC (Fiber-2),20×)

3 討 論

3.1 Fiber-2蛋白在畢赤酵母中的優化表達

畢赤酵母(P.pastoris)表達系統生長迅速，產量高，價格便宜易，可以進行高密度發酵，且不具有原核表達的內毒素污染問題。同時該系統已經有現成的工業化發酵平臺，技術成熟。因此綜合“量”與“質”兩方面的考慮，選取畢赤酵母表達系統開發FAdV-4的亞單位疫苗具有廣闊的應用前景。盡管畢赤酵母表達系統具有完善的表達調控機制和對表達產物的加工修飾能力，但由于外源基因及表達條件等諸多的因素影響，仍然會有外源蛋白表達量很低，甚至無法表達的問題存在。因此，外源基因的優化、畢赤酵母菌種篩選和誘導條件的改進已成為推進畢赤酵母表達系統成為強有力的外源蛋白表達工具的重要環節[26]。李思齊[22]研究雖然在畢赤酵母中對Fiber-2蛋白進行了外分泌表達，但側重點在于Fiber-2蛋白的成功表達和保護效果的評價。其研究并未對發酵的工藝進行優化，同時也未能對Fiber-2蛋白的表達量進行準確定量，這限制了畢赤酵母表達的Fiber-2蛋白作為FAdV-4亞單位疫苗的發展。

本研究首先對Fiber-2基因按照酵母密碼子進行優化，因為在采用畢赤酵母進行的羥腈裂解酶表達研究中發現，羥腈裂解酶基因在按照酵母密碼子進行優化后，可以使表達量提高約140倍[27]。血纖維蛋白溶解酶、乙肝表面抗原(HBsAg)和堿性果膠酸裂合酶的研究結果表明，提高外源基因在酵母基因組中的拷貝數有很的大概率增加外源蛋白的表達水平[28-30]。所以本研究通過不同質量濃度的G418(1、3和5 mg/mL)篩選了高拷貝菌株。接下來本研究通過誘導條件的優化，將培養基上清液中的總蛋白含量從最初的30 mg/L提升到了50 mg/L，最終上清中的重組Fiber-2蛋白含量達到了8.7 mg/L。本文旨在通過發酵工藝的初步優化來提高重組Fiber-2蛋白的產量，以推動畢赤酵母表達系統在FAdV-4亞單位疫苗中的工業化發展進程。

3.2 畢赤酵母優化表達的重組Fiber-2蛋白對國內超強毒力毒株(GD616)的攻擊保護效果

本研究中采用的超強毒力的FAdV-4毒株(GD616)是由本研究室分離鑒定的。根據先前的研究結果，該毒株以101.5TCID50接種21日齡的SPF雞群的死亡率可達90%，并且可以造成肝臟明顯的脂肪變性[31]。感染180日齡的SPF雞可造成60%的發病率和20%的死亡率。本研究采用酵母表達的Fiber-2蛋白亞單位疫苗50 μg免疫的保護率為100%，為進一步驗證保護效果，本研究對免疫攻毒后雛雞進行病理學檢測，發現50 μg免疫雞群可以完全預防心包積液-肝炎綜合征(HHS)的發生，同時可以有效阻止超強毒株對于雞群肝臟的感染和損傷。

大量的研究表明，成功表達Fiber-2蛋白的系統還有很多，如大腸桿菌[11-13]、桿狀病毒[14]和293T[16]等，這些表達系統制備的亞單位疫苗免疫雞群后均可以抵抗2015年國內不同地區的FAdV-4流行毒株，保護率均可達100%，但是對攻毒毒株的強弱程度沒有進一步說明。在本研究中，畢赤酵母優化表達的重組Fiber-2蛋白免疫雞群后使用的是2015年后中國的流行毒株—超強毒力毒株GD616，保護率也可達到100%，充分表明畢赤酵母優化表達的重組Fiber-2蛋白對超強毒株也具有很強的攻擊保護力。本研究確定了Fiber-2蛋白對超強FAdV-4毒株攻擊保護的高效性，為采用Fiber-2亞單位疫苗對國內流行超強FAdV-4毒株進行有效的防控奠定了基礎。